JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ونحن تصف الخطوات المختلفة لزرع المجسات السليكون المزمنة وتسجيل مكان الخلايا في الفئران التي ثابتة رئيس تشغيل على جهاز أثري جديلة حلقة مفرغة.

Abstract

شرط مهم لفهم وظيفة المخ وهو تحديد السلوك ويرتبط نشاط الخلية. المسابر السليكون متقدمة أقطاب لتسجيل نشاط الخلايا العصبية الكهربية على نطاق واسع، ولكن الإجراءات المتعلقة بهم غرس المزمنة لا تزال متخلفة. يعرف نشاط الخلايا مكان هيبوكامبال ترتبط بموقف الحيوان في البيئة، ولكن الآليات الأساسية التي لا تزال غير واضحة. التحقيق في مكان الخلايا، هنا نحن وصف مجموعة من التقنيات التي تتراوح بين تصنيع الأجهزة للتحقيق السليكون المزمنة يزرع لرصد مكان النشاط الميداني في جهاز أثري جديلة حلقة مفرغة. أقراص صغيرة وقبعة مبنية بتركيب وابزيم معا أجزاء البلاستيك طباعة 3D. تحقيق سيليكون التي شنت على الصغير-محرك الأقراص، وتنظيفها، ومطلية بصبغ. يتم تنفيذ أول عملية جراحية لإصلاح القبعة على الجمجمة بالماوس. معالم الصغيرة هي ملفقة وتعلق على حزام حلقة مفرغة. الماوس يتم تدريبهم على تشغيل ثابت رئيس في حلقة مفرغة. يتم تنفيذ عملية جراحية ثانية لزرع المسبار السليكون في قرن آمون، بعد الإشارات الكهربية ذات النطاق العريض التي تسجل. أخيرا، استعادت المسبار السليكون وتنظيفها لإعادة استخدامها. ويكشف تحليل نشاط الخلية مكان في حلقة مفرغة مجموعة متنوعة آليات الحقل، توجز الاستفادة النهج.

Introduction

المسابر السيليكون يقدم العديد من المزايا للتسجيلات الكهربية، بما في ذلك حقيقة أن تم تصميمها مع التشكيلات الجانبية حادة للتقليل إلى أدنى حد من تلف الأنسجة وما يقدمونه تخطيط دقيق لوجبات كثافة تسجيل مواقع1، 2،،من34. يتم استخدامها لدراسة النظم المختلفة في الأنواع المختلفة، بما في ذلك البشر3،،من56، مع مختلف النهج1،7. حتى الآن، استعمالها المتكررة لا تزال محدودة نسبيا بسبب تكاليفها، وهشاشة، وحقيقة أن أساليب ملائمة لتجارب المزمنة التي تفتقر إلى8. التطورات الحديثة في تقنية الطباعة ثلاثية الأبعاد جعلت من الممكن تصميم مخصص للأجهزة مثل محركات الأقراص الصغيرة والرأس-لوحات للسماح بتناول هذه الأقطاب الحساسة بصورة أسهل. في خطوة أولى، ونحن سوف تصف كيفية بناء واستخدام مجموعة من الأدوات التي قمنا بتطوير لزرع السيليكون المزمنة المسابير14.

في حين يتم دراسة الخلايا مكان عادة استخدام الحيوانات تتحرك بحرية في متاهات، مؤخرا أنهم أيضا التحقيق في البيئات الافتراضية15 وفي حلقة مفرغة أباراتي9 (الشكل 1A). ميزة هذه الأساليب التجريبية على أن الحيوانات يمكن الرأس-ضبط النفس، مما يجعل استخدام مجهر فوتون 215والتصحيح-المشبك16أوبترودي9،،من1011 تقنيات أسهل، بالإضافة إلى توفير تعزيز الرقابة على سلوك الحيوانات ومنبهات البيئية12. في خطوة ثانية، سوف نقدم لإجراءات تدريب الفئران وتسجيل نشاط الخلية مكان في جهاز حلقة مفرغة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لمعهد كوريا للعلوم والتكنولوجيا-

1-إعداد محرك الأقراص الصغيرة والقطب

  1. تجميع مايكرو--محرك الأقراص.
    1. طباعة الأجزاء من الدقيقة-محرك الأقراص (الجسم، شريط التمرير وشل) 14 باستخدام طابعة 3D عالية الدقة. تأكد من الأجزاء لا عيوب.
    2. إصلاح المنزلق في جسم السيارة الصغيرة مع المسمار (حجم 000-120 × 1/4)-
    3. اللحيم الجوز (حجم Hex 000-120 000-120/64) على طرف المسمار.
    4. تدوير المسمار عقارب الساعة لتحريك شريط التمرير حتى أو عقارب الساعة تحريكه لأسفل.
    5. إصلاح shell للجسم مع المسمار (حجم 000-120 × 1/4)-
  2. تصاعد المسبار على الصغير--محرك الأقراص.
    1. الإصلاح الجزئي-محرك الأقراص في وضع أفقي تحت مجهر-
    2. استخدام قصاصة التمساح شقة مع الحشو المطاطية للاستيلاء على كابل فليكس المسبار السليكون، بينما فصل التحقيق من حاوية شحن بعناية مع الملقط. إصلاح القصاصة التمساح المناول.
    3. المناور، باستخدام وضع المسبار السيليكون على المنزلق محرك الأقراص الصغيرة، موازية لاتجاه الحركة.
    4. تطبيق قطره أسمنت الأسنان (اﻷكريليك درجة حرارة الغرفة علاج الأسنان إصلاح المواد) لإصلاح المسبار لشريط التمرير. تصحيح موقف التحقيق إذا قد تحول. لا ينصح الغراء كما أنه علاج سريع جداً ويجعل من الصعب على تكييف موقف القطب.
    5. إصلاح الرابط للتحقيق معه لصاحب ج (حامل موصل) مع الأسمنت الأسنان.
  3. والتنظيف ووضع صبغة على التحقيق- لفيف
    1. فيكس Microdrive/المسبار المسبار-تنظيف الجهاز. الجهاز مجهز 2 صغيرة بالتناوب الأسفنج رغوة (مسحات غير معقمة). ضبط الفجوة المناور.
    2. نقع الأسفنج مع المنظفات.
    3. تتحرك ببطء التحقيق صعودا وهبوطاً بين الأسفنج، السماح بلمسة رقيقة. رصد عملية التنظيف تحت مجهر.
    4. شطف التحقيق مع الماء المقطر. هبوط المسبار في الكحول للتعقيم.
    5. ديل تطبيق (صبغة الفلورسنت محبتين) على الجزء الخلفي شانكس المسبار، استخدام مسحه رغوة. سيسمح هذا تصور مواقع عرقوب في الدماغ في مرحلة لاحقة-
  4. تجميع القبعة
    1. طباعة الأجزاء من القبعة (رئيس--لوحة وحامل موصل وكاب) 14 باستخدام طابعة 3D. 3 أجزاء مع بعضها البعض لتشكل من العلبة مختومة.
    2. إدراج المكسرات (حجم M2 و 00-90 00-90/4) في فتحات الرأس-لوحة والإصلاح مع الغراء والأسمنت الأسنان.
    3. إدراج غسالة في فتحه سقف وإصلاحها مع الأسمنت الأسنان.

2. عملية جراحية لتثبيت القبعة في الجمجمة

يتم تعقيم جميع الأدوات المستخدمة لإجراء عملية جراحية مسبقاً قبل التعقيم. يتم استخدام جهاز خرز حرارة جافة فورتو تعقيم الأدوات التي أصبحت ملوثة وتحتاج إلى أن تكون معقمة أثناء الجراحة.

تعيين
  1. مستوى إيسوفلوراني إلى 4% للبدء بالتخدير. ضع الماوس في غرفة التخدير الحد الأدنى 5
  2. تثبيت الماوس في جهاز ستيريوتاكسيك-
  3. خفض مستوى إيسوفلوراني إلى 1.5-2%. قم بضبط المستوى أثناء الجراحة طبقاً للدولة الحيوانية، ومعدل التنفس، والجسم درجة حرارة 20-
  4. تطبيق مرهم العين على العيون.
  5. حلق فروة الرأس وتنظيف رأس الحيوان بمطهر (إيودوبوفيدوني). الحفاظ على ظروف معقمة خلال جميع الخطوات للجراحة-
  6. Bupivacaine إدخال (1 مغ/كغ) تحت فروة الرأس. قطع وإزالة جزء من الجلد الجدارية من رأس الماوس باستخدام مقص جيد لفضح الجمجمة في حوافها. استخدام المياه المالحة والإسفنج مرقئ لتنظيف والتحكم في النزيف أثناء الجراحة.
  7. إزالة السمحاق استخدام أداة كاشطة.
  8. البحث عن النقاط المرجعية في الجمجمة 21: بريجما، لامدا، كرونال، وخياطة السهمي. ضبط الرئيس ' s بزاوية على المحور السهمي مثل أن يكون بريجما ونقطة لامدا في نفس الارتفاع.
  9. حفر ثقوب اثنين (~0.5 مم) في الجمجمة لأقطاب المرجعية والأرض. ينبغي أن تكون الثقوب حوالي 1 مم والذيلية والجانبي 1 مم من لامدا.
  10. إدراج أقطاب الأرض ومرجع (حجم مصغر 000-120 000-120/16 الفولاذ المقاوم للصدأ مسامير سلك-بالإضافة إلى موصلات دبوس).
  11. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الترابط عاج المنشط في الجمجمة ومن ثم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية على 45-60 س.
  12. تطبيق طبقة من الأسمنت الأسنان على حواف الجمجمة. تجنب نشر الأسمنت على الجلد والشعر من الفئران.
    13. إصلاح الرأس-اللوحة لمناور ستيريوتاكسيك
  13. ووضعه فوق الجمجمة. ببطء أقل الرئيس--اللوحة حتى أنها تمس قليلاً في الجمجمة، وتطبيق الأسمنت الأسنان عند التقاطع مع الجمجمة. السماح لعلاج الأسنان الأسمنت 15 دقيقة
    14. إزالة
  14. التخدير. إصلاح موصل حامل وغطاء للرأس-اللوحة. وضع الماوس في قفصة بعد إعطاء حقنه جلدية الفرعية من كيتابروفين 5 ملغ/كجم
  15. إعطاء الحقن الجلدية الفرعية من كيتابروفين 5 ملغ/كغ للأيام القادمة اثنين ومراقبة بعناية لأي علامة للألم. الفئران عادة الاستيقاظ من التخدير خلال 20-40 دقيقة. زرع هات نسبيا الخفيف (3.34 غرام)، مثل الفئران لها أي مشكلة في رفع رؤوسهم وتشغيله في متاهات وتسلق على حواف بها القفص المنزل-

3. التدريب السلوكي

  1. بعد فترة نقاهة بعد عملية جراحية لمدة 7 أيام، تبدأ تقييد الماء في 1 مل يوميا.
    2. قص قطعة من القماش المخملية (5 سم م 1-2)
  2. جعل الحزام حلقة مفرغة، وإصلاح الأجسام الصغيرة على أنها استخدام الغراء الساخن. إرفاق الكائنات أقيمت على حواف الحزام لكي لا تتداخل مع حركة الماوس.
  3. إصلاح الحزام على عجلات المطحنة بخياطة طرفي معا.
  4. تثبيت الماوس رئيس--الثابتة في حلقة مفرغة بإدراج وشد مسامير اثنين من الرأس-اللوحة في فتحات اللوحة تثبيت الرأس.
  5. بدء التدريب الماوس لتشغيل ضبط النفس رأسه في حلقة مفرغة لمكافأة المياه. تقديم مكافأة المياه من خلال منفذ لعق. في البداية، وضع الماوس في حلقة مفرغة لفترات من 10 دقيقة، 3 مرات يوميا-
  6. الماوس يعتاد على الرأس--تثبيت البرنامج ويبدأ بتحريك الحزام (عادة بعد ~ 3 أيام)، زيادة دورة تدريبية مدتها 30 دقيقة. بعد 2-3 أسابيع، تشغيل بعض أجهزة الماوس المحاكمات أكثر من 100 في 30 دقيقة (محاكمة يجري تناوب كامل الحزام)-
  7. اختر الفئران عرض أفضل العروض السلوكية لتجارب تسجيل.

4. غرس "التحقيق السليكون"

  1. وضع الماوس تحت التخدير.
  2. تثبيت الماوس في الجهاز ستيريوتاكسيك عن طريق تحديد الرأس-اللوحة. تنظيف سطح الجمجمة مع المالحة.
  3. البحث عن علامات ستيريوتاكسيك: بريجما، لامدا، كرونال، وخياطة السهمي. قياس المسافة إلى نقطة الإدراج ووضع علامة عليه
  4. حفر العظام بعناية حتى تصبح رقيقة وشفافة. ترطيب وتنظيف مع المالحة أثناء الحفر.
  5. بعناية إزالة العظام ضعفت والمسألة دوراً باستخدام قوة الدقةps. الحفاظ على سطح الدماغ رطبة طوال الوقت مع المحلول الملحي.
    6. فيكس
  6. لفيف مسبار Microdrive/السيليكون لمناور ستيريوتاكسيك. إحضار المسبار السيليكون فقط أعلاه اوديما. برغي صاحب السليكون موصل التحقيق إلى الرئيس--اللوحة-
  7. توصيل أقطاب مكبر للصوت والأرض والمراجع في التسجيل. درع الماوس مع رقائق الألومنيوم لحماية من الضوضاء الكهربائية المغناطيسية. بدء تشغيل نظام التسجيل لرصد النشاط الكهربائي للمخ.
  8. ببطء إدراج التحقيق السليكون في الدماغ في ميكرومانيبولاتور باستخدام. تحقق باستمرار إشارات كهربائية والمسافة مناور سافر شانكس المسبار (تأكد من أنها هي اختراق في الدماغ). نشاط وحدة مرئياً في القشرة بينما الأبيض تحت أمر نسبيا الصامت. نشاط وحدة يظهر مرة أخرى عندما تلمس شانكس الطبقة الهرمية الحصين. من هذه النقطة، تتراجع السيليكون مسبار 200 ميكرومتر (استخدام مايكرو--محرك الأقراص في اليوم التالي لإحضار شأنك مرة أخرى إلى الطبقة الهرمية).
  9. تغطي سطح المخ بخليط من الشمع العظام والزيوت المعدنية-
    10. فيكس
  10. الصغرى-محرك الأقراص إلى لوحة الرأس باستخدام الأسمنت الأسنان. واسمحوا الأسمنت الأسنان وعلاج لمدة 15 دقيقة. ثم فصل محرك الأقراص الصغيرة من مناور ستيريوتاكسيك ووضع قبعة قبعة مرة أخرى.
  11. وضع الماوس مرة أخرى في قفصة ويعطي حقن جلدية الفرعية من كيتابروفين 5 مغ/كغ. تحقق من وجود أية علامة على الألم. هذه الجراحة الغازية أقل بكثير من الأولى والفئران تنشط عادة خلال 45 دقيقة بعد أنهم الاستيقاظ من التخدير. ومع ذلك، اسمحوا الماوس استرداد يوم كامل كالمسبار السليكون يحتاج إلى استقرار في الدماغ-

5. تسجيل

  1. تثبيت الماوس رئيس--الثابتة في حلقة مفرغة. إزالة الفصل هات
  2. توصيل مكبر للصوت تسجيل وبدء التسجيل-
  3. اليوم الأول، استخدام مايكرو--محرك الأقراص لنقل التحقيق السليكون إلى طبقة الهرمية الحصين. يتحرك كل بدوره عقارب الساعة المسمار ميكرومتر شانكس 200 أعمق. ضبط موضع ساق ببطء (~ 20-50 ميكرومتر في وقت) حتى يظهر تموج ذبذبات 13 ووحدة النشاط.
  4. في الأيام القادمة، ضبط موضع ساق والانتظار ح ~ 1 قبل تسجيل النشاط هيبوكامبال أثناء تشغيل الماوس على الحزام. للحفاظ على جودة الإشارة تسجيل جيدة لعدة أيام، إزالة الأجسام الصلبة ومنخفضة السقف من الماوس ' قفص s لتقليل فرصة القبعة المطبات إلى السطوح الصلبة.

6. استعادة التحقيق

  1. وضع الماوس تحت التخدير.
  2. تثبيت الماوس في الجهاز ستيريوتاكسيك عن طريق تحديد الرأس-اللوحة. إزالة الفصل هات
  3. تجلب مناور ستيريوتاكسيك فقط فوق مايكرو--محرك الأقراص. الإصلاح الجزئي-محرك الأقراص إلى المناور. فك حامل موصل من الرأس-اللوحة. قم بفك المسمار الذي يربط بين شل والهيئة الصغرى--محرك الأقراص.
  4. تحت مجهر الإشراف، ببطء سحب لفيف المسبار الصغير-محرك الأقراص/السيليكون مع مناور ستيريوتاكسيك، تاركين الجزء شل.
  5. تنظيف المسبار السيليكون مع جهاز التنظيف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وتم تدريب ماوس أولاً لتشغيل على حزام اثنين متر طويلة خالية من الرموز (الشكل 1). تم تثبيت بعد زرع قطب كهربائي، حزام جديد من نفس الطول ولكن تقديم 3 أزواج من الرموز في حلقة مفرغة، بغية توليد اللوسينتريك المكانية تمثيلات12،14. وسجل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المزمنة من تسجيل نشاط الخلايا العصبية أمر بالغ الأهمية لفهم العمليات العصبية مثل وضع هيبوكامبال حقول. نهجنا لأداء السيليكون المزمنة مسبار إيمبلانتانتيشن يميز نفسه عن الأخرى أساليب7،،من1819،20 من حقيقة أنه بسيط نسبيا لا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها معهد كوريا للعلوم والتكنولوجيا برنامج المؤسسية (المشاريع رقم 2E26190 و 2E26170) وبرنامج العلوم الحدود البشرية (RGY0089/2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon ProbeNeuronexusBuzsabi32Recording electrode
Recording systemIntantechRHD2132/RHD2000
3D printerAsigaPico Plus 27High resolution printer for micro-drive
3D printerStratasysMojoLower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatusKopfModel 963
Binocular microscopeLeicaM60
Treadmill apparatusWe build them

References

  1. Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
  2. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  3. Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
  4. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
  5. Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
  6. Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180(2016).
  7. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568(2012).
  8. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  9. Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  12. Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531(2017).
  13. Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
  14. Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
  15. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  16. Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
  17. Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
  18. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
  19. Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
  20. Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
  21. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  22. Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
  23. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
  24. Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
  25. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
  26. Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

128

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved