השרשה של הגששים סיליקון כרונית ורישום של תאים בהיפוקמפוס המקום מכשיר הליכון מועשר

Summary

אנו מתארים את השלבים מגוונות כדי להשתיל סיליקון כרונית הגששים וכדי להקליט את המקום התאים בעכברים כי הם הראש-קבוע על מנגנון מועשרת cue הליכון.

Abstract

נחוץ חשוב להבנת תפקוד המוח הוא הזיהוי של התנהגות, פעילות התאים מופיע. סיליקון רגשים מתקדמים אלקטרודות להקלטה אלקטרופיזיולוגיות בקנה מידה גדול של פעילות. עצבית, אך נהלי השרשה כרונית שלהם לא מפותחים. הפעילות של תאים בהיפוקמפוס המקום ידוע לתאם עם העמדה של חיה בסביבה, אבל המנגנון הבסיסי לא ברורים. כדי לחקור את המקום התאים, כאן נתאר סט של טכניקות אשר נע הזיוף של מכשירי בדיקה כרונית סיליקון שתלים אל הפיקוח על המקום שדה פעילות מנגנון מועשרת cue הליכון. של מיקרו-נסיעה וכובע נבנים על ידי התאמת והידק יחד מודפס 3D חלקי פלסטיק. בדיקה הסיליקון הוא רכוב על המיקרו-הכונן, ניקה, מצופה צבע. ניתוח הראשון מתבצע כדי לתקן את הכובע על הגולגולת של עכבר. אתרים קטנים מפוברק, המצורפת את החגורה של הליכון. העכבר שאומן להפעיל את הראש-קבוע על ההליכון. ניתוח נוסף מתבצע כדי להשתיל את החללית סיליקון בהיפוקמפוס, בעקבות אותות אלקטרופיזיולוגיות בפס רחב אשר נרשמים. לבסוף החללית הסיליקון הוא התאושש, ניקה לשימוש חוזר. הניתוח של המקום פעילות התאים בתוך ההליכון חושף מגוון של מנגנונים שדה המקום, חלוקה לרמות את היתרון של הגישה.

Introduction

הגששים סיליקון להציג מספר יתרונות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות, לרבות העובדה כי הן מעוצבות עם פרופילים חדה למזער נזק לרקמות, כי הם מציגים פריסה מדויק של בצפיפות הקלטה אתרים^{1, 3, 2,4}. הם משמשים כדי ללמוד מערכות שונות במינים שונים, כולל בני אדם^3,5,6, עם גישות מגוונות^1,7. ובכל זאת, השימוש חוזרים ונשנים שלהם הוא עדיין מוגבל יחסית בגלל העלות שלהם, השבריריות, והעובדה כי שיטות נוחות כרונית ניסויים חסרים⁸. ההתקדמות בטכנולוגיית הדפסה תלת-ממד הפכו אפשריות עיצוב מותאם אישית של התקנים כגון מיקרו-כוננים והראש-פלטות כדי לאפשר טיפול קל יותר של האלקטרודות עדין. בשלב הראשון, נתאר כיצד לבנות ולהשתמש סט של כלים אשר פותחו עבור ההשתלה של סיליקון כרונית הגששים¹⁴.

אמנם המקום התאים נלמדים בדרך כלל באמצעות בעלי חיים נע בחופשיות םילעופה מבוכים, לאחרונה הם גם נחקרו בסביבות וירטואליות¹⁵ , הליכון apparatii⁹ (איור 1 א'). אלה שיטות נסיוניות מציעים יתרון כי בעלי חיים יכולים הראש-לרסנם, שהופך את השימוש מיקרוסקופים פוטונים 2¹⁵, תיקון-קלאמפ¹⁶ו- optrode^9,10,11 טכניקות קל יותר, בנוסף לספק בקרה משופרת על התנהגות בעלי חיים, רמזים סביבתיים¹². בשלב השני, נציג את נהלי הדרכה עכברים ורישום פעילות התאים במקום במנגנון הליכון.

Protocol

כל השיטות המתוארות אושרו על ידי חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה קוריאה במכון למדע וטכנולוגיה -

1. הכנת את מיקרו-הכונן ואת אלקטרודה

1. להרכבת המיקרו-הכונן.
   1. להדפיס את החלקים של המיקרו-הכונן (המחוון, גוף ו- shell) ¹⁴ משתמשים במדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה. ודא החלקים שיש הפגמים לא.
   2. לתקן את המחוון לתוך הגוף מיקרו-כונן עם בורג (גודל 000-120 x 1/4).
   3. הלחמה אגוז (גודל Hex 000-120 000-120/64) אל קצה הבורג.
   4. לסובב את הבורג כיוון השעון כדי להזיז את המחוון למעלה או נגד כיוון השעון כדי להזיז אותו.
   5. לתקן את המעטפת לגוף עם בורג (גודל 000-120 x 1/4).
2. הרכבה החללית של המיקרו-כונן.
   1. לתקן המיקרו-הכונן במצב אופקי תחת מיקרוסקופ דו-עינית.
   2. השתמש קליפ תנין שטוח עם גומי ריפוד כדי לתפוס את הכבל הגמיש של המכשיר סיליקון, תוך ניתוק בקפידה את החללית מהמתחם המשלוח עם מלקחיים. לתקן את הקליפ תנין תחמן.
   3. באמצעות manipulator, שכב החללית סיליקון על מחוון מיקרו-כונן, במקביל לכיוון התנועה.
   4. להחיל טיפה של מלט שיניים (טמפרטורת החדר-אשפרה אקריליק שיניים תיקון החומר) כדי לתקן את המקדח כדי במחוון. תקן את מיקום המכשיר אם זה השתנה. דבק לא מומלץ כי זה מרפא מהר מאד והופכת אותו שקשה להתאים מחדש את מיקום האלקטרודות.
   5. לתקן את המחבר של המכשיר לפני C-מחזיק (מחזיק המחבר) עם מלט שיניים.
3. ניקוי ולשים לצבוע על החללית. מכלול
   1. תיקון המכשיר/Microdrive על המכשיר לניקוי בדיקה. המכשיר מצויד עם 2 קטנים סיבוב קצף ספוגים (מטליות שאינו סטרילי). התאם את הפער על ידי manipulator.
   2. להשרות את הספוגים עם חומר ניקוי.
   3. לאט הניעו את המכשיר למעלה או למטה בין הספוגים, ומאפשר מגע עדין. לפקח על תהליך ניקוי תחת מיקרוסקופ.
   4. לשטוף את המכשיר עם מים מזוקקים. טובלים את המכשיר אלכוהול עבור עיקור.
   5. החל דיל (lipophilic הפלורסנט) בגב שאנקס של המכשיר, באמצעות מקלון קצף. זה יאפשר מאוחר יותר את החזיית shank מיקומים במוח.
4. בהרכבת הכובע
   1. להדפיס את החלקים של הכובע (ראש-צלחת, מחזיק המחבר ו cap) ¹⁴ משתמשים במדפסת תלת-ממד. 3 החלקים מתחברים כדי ליצור מארז אטום.
   2. להוסיף אגוזים (גודל M2 ו- 00-90 ב- 90/4) במכונה של הראש-צלחת, תיקון עם דבק ומלט שיניים.
   3. להוסיף מנקה. בחריץ של המכסה ולתקן עם מלט שיניים.

2. ניתוח קיבוע של הכובע על הגולגולת

כל הכלים המשמשים לניתוח סטריליים מראש על-ידי autoclaving. מכשיר חרוזים חום יבש משמשת לברר לחטא כלים תזדהם צריך לעקר במהלך הניתוח.

1. להגדיר את רמת איזופלוריין ל- 4% עבור אתחול של הרדמה. לשים את העכבר בבית הבליעה הרדמה עבור 5 דק
2. התקן העכבר מנגנון stereotaxic.
3. להפחית את רמת איזופלוריין ל- 1.5-2%. להתאים את רמת במהלך הניתוח על פי מדינה בעלי חיים, קצב נשימה, וכן גוף טמפרטורה ²⁰-
4. למרוח משחה עין על העיניים.
5. לגלח את הקרקפת ולנקות את הראש של החיה עם חומר חיטוי (iodopovidone). לשמור על תנאים aseptic במהלך כל השלבים של הניתוח.
6. הכנס נמשך (1 מ ג/ק ג) תחת הקרקפת. לחתוך ולהסיר חלק העור הקודקוד של הראש העכבר באמצעות מספריים בסדר לחשוף את הגולגולת-הקצוות שלה. השתמש תמיסת מלח וספוג hemostatic כדי לשלוט בדימום במהלך הניתוח ונקי.
7. להסיר את קרום העצם בעזרת כלי המגרד.
8. למצוא את נקודות ההתייחסות על הגולגולת ²¹: bregma, למבדה, ניתן לומר, המשונן. התאם את הראש ' s זווית לאורך הציר הסאגיטלי כזה Bregma ואת הנקודות למבדה הם באותו גובה.
9. תרגיל שני חורים (~0.5 מ"מ קוטר) בתוך הגולגולת עבור הפניה ואת הקרקע האלקטרודות. החורים צריך להיות כ סימטרית 1 מ"מ ו 1 מ מ לרוחב של למדא-
10. להוסיף הקרקע והפניה האלקטרודות (בגודל מיניאטורי 000-120 000-120/16 מפלדת ברגים מצמידים תיל למחברי ה-pin).
11. החל אור אולטרה סגול (UV) מליטה דנטין activator על הגולגולת ולאחר מכן להחיל אור UV עבור 45-60 s
12. למרוח שכבה של מלט שיניים בקצוות של הגולגולת. למנוע הפצת מלט על העור, השיער של העכברים.
13. לתקן את הראש-בלוח תחמן stereotaxic ומקם אותה מעל הגולגולת. לאט לאט להוריד את הראש-הצלחת עד מעט שייגע הגולגולת ולהחיל מלט שיניים בצומת עם הגולגולת. לתת את התרופה מלט שיניים במשך 15 דקות
14. להסיר את ההרדמה. מתקן בעל מחבר וכובע הראש-לצלחת. לשים את העכבר בכלוב שלו לאחר מתן זריקה תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ספקית
15. לתת זריקות תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ק"ג על שני הבא ימים ועל צג בקפידה עבור כל סימן של כאב. עכברים בדרך כלל מתעורר מן ההרדמה בתוך 20-40 דקות. השתל הכובע הוא יחסית קל ( 3.34 ז), כגון עכברים יש צרות להרים את ראשם, לרוץ מבוכים ולטפס על הקצוות של הכלוב שלהם הביתה.

3. אימון התנהגותי

1. לאחר 7 ימים תקופת ההחלמה לאחר הניתוח, להתחיל את ההגבלה של מים על 1 מ"ל ליום.
2. להפוך את החגורה על ההליכון, לחתוך חתיכה של בד קטיפה (5 ס מ 1-2 מ') ותקן חפצים קטנים באמצעות דבק חם. צרף אובייקטים שביסודה בקצוות של החגורה כדי לא להפריע התנועה של העכבר.
3. לתקן את החגורה על הגלגלים של ההליכון על-ידי תפירת ביחד את שני הקצוות.
4. להתקין העכבר הראש-קבוע בתוך ההליכון על-ידי הוספת והידוק את שני הברגים של הראש-הצלחת לתוך החריצים של צלחת קיבוע הראש.
5. להתחיל לאמן את העכבר כדי להפעיל את הראש-מרוסן על ההליכון בשביל הפרס מים. להעביר את הפרס מים דרך יציאת ליקוק. בתחילה, לשים את העכבר על ההליכון לפרקי זמן של 10 דקות, 3 פעמים ביום.
6. בעכבר יתרגל הראש-הקיבעון ומתחיל להזיז את החגורה (בדרך כלל לאחר ~ 3 ימים), להגדיל את האימון משך כדי 30 דקות. לאחר 2-3 שבועות, עכברים לרוץ יותר מ-100 ניסויים 30 דקות (משפט להיות סיבוב מלא של רצועת).
7. בחרו העכברים מציג ההופעות ההתנהגות הטובה ביותר עבור הניסויים הקלטה.

4. השרשת לחקור הסיליקון

1. לשים את העכבר תחת הרדמה.
2. התקן העכבר המנגנון stereotaxic על ידי תיקון שלוחית הראש. לנקות את השטח הגולגולת עם תמיסת מלח.
3. למצוא סמנים stereotaxic: bregma, למבדה, ניתן לומר, המשונן. למדוד את המרחק עד לנקודה של ההכנסה ולסמן את זה
4. תרגיל העצם בזהירות עד שיהפוך דק ושקוף. להרטיב ולנקות עם תמיסת מלח בזמן קידוח.
5. הסר בזהירות את העצם ורקמת והחומר דורא שימוש precision בכוחps. לשמור את פני השטח של המוח רטוב עם תמיסת מלח כל הזמן.
6. לתקן את מכלול בדיקה Microdrive/סיליקון כדי תחמן stereotaxic. להביא את המכשיר הסיליקון מעל הניתוח. בורג בעל מחבר סיליקון בדיקה הראש-לצלחת.
7. חיבור האלקטרודות מגבר ועיון/הקרקע הקלטה. מגן העכבר עם רדיד אלומיניום כדי להגן מפני רעש אלקטרו-מגנטי. להפעיל את מערכת הקלטה כדי לנטר את הפעילות החשמלית של המוח.
8. אט-אט את הגשוש סיליקון למוח באמצעות את micromanipulator. בדוק ללא הרף את האותות החשמליים, המרחק מניפולטור נסע, ושנקס של המכשיר (ודא הם חודרות במוח). פעילות יחידת מוצגת ב קליפת אמנם בחומר הלבן מתחת נאלמים. פעילות יחידת מופיע שוב שאנקס נוגעים השכבה כפירמידה של ההיפוקמפוס. מנקודה זו, תמשוך את מיקרומטר בדיקה 200 סיליקון (השתמש המיקרו-הכונן למחרת כדי להחזיר את הסכין לתוך השכבה כפירמידה).
9. לכסות את המשטח של המוח עם תערובת של שעווה לאיטום שמן מינרלי-
10. לתקן המיקרו-לכונן הראש-הצלחת באמצעות מלט שיניים. לתת את התרופה מלט שיניים למשך 15 דקות. לנתק את המיקרו-נסיעה stereotaxic manipulator ואז תלבש בחזרה את כובע כובע.
11. לשים את העכבר לכלוב ולתת זריקה תת עורית של ketaprofen 5 מ"ג/ק"ג. בדוק אם יש סימן לכאב. ניתוח זה הרבה פחות פולשניים הראשון, עכברים פעילים בדרך כלל בתוך 45 דקות אחרי שהם התעוררות מההרדמה. בכל אופן, תן את העכבר לשחזר יום שלם כמו החללית סיליקון צריך להתייצב במוח.

5. הקלטה

1. התקן העכבר הראש-קבוע על ההליכון. להסיר את הכובע הצוואה
2. להתחבר המגבר הקלטה, להתחיל את ההקלטה.
3. ביום הראשון, השתמש המיקרו-בכונן כדי להזיז את החללית הסיליקון לתוך השכבה כפירמידה של ההיפוקמפוס. כל סיבוב נגד כיוון השעון המברג מעביר את מיקרומטר שאנקס 200 עמוק יותר. להתאים את מיקום shank לאט (~ 20-50 מיקרומטר בכל פעם) עד ¹³ תנודות גלי ופעילות יחידת יופיעו.
4. על הימים הבאים, לכוון את מיקום shank ולחכות ~ 1 h לפני הקלטת הפעילות בהיפוקמפוס בזמן העכבר פועלת על החגורה. כדי לשמור על איכות האות הקלטה טובה במשך מספר ימים, להסיר אובייקטים קשה, נמוך תקרה מהעכבר ' s הכלוב למזער את הסיכוי הכובע מתנגש משטחים קשים.

6. שחזור המכשיר

1. לשים את העכבר תחת הרדמה.
2. התקן העכבר המנגנון stereotaxic על ידי תיקון שלוחית הראש. להסיר את הכובע הצוואה
3. להביא manipulator stereotaxic מעל המיקרו-הכונן. לתקן המיקרו-לכונן manipulator. להתיר בעל מחבר מהצלחת-הראש. הסר את הבורג המחבר את מעטפת הגוף של המיקרו-הכונן.
4. תחת מיקרוסקופ דו-עינית פיקוח, אט אט למשוך את מכלול מיקרו-נסיעה/סיליקון בדיקה עם stereotaxic manipulator, משאירים את החלק של מעטפת מאחור.
5. לנקות את המכשיר סיליקון עם מכשיר ניקוי.

תוצאות

עכבר הוכשר קודם לרוץ על חגורה ארוך שני מטר ללא רמזים (איור 1C). בעקבות ההשתלה אלקטרודה, חגורה חדשה באותו אורך, אבל מציג 3 זוגות רמזים הותקן על ההליכון, על מנת ליצור allocentric ייצוגים מרחביים^12,14. אותות פס רחב נרשמו בקצב דגימה של 30,000 ...

Discussion

הקלטה כרונית של פעילות. עצבית הינה קריטית להבנת תהליכים עצביים כגון שדות המקום בהיפוקמפוס. הגישה שלנו לבצע סיליקון כרונית בדיקה implantantation מבדיל עצמו אחרים שיטות^7,18,19,20 על ידי העובדה כי זה פשוט יחסית לשחזר את החבילה אלקטר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Probe	Neuronexus	Buzsabi32	Recording electrode
Recording system	Intantech	RHD2132/RHD2000
3D printer	Asiga	Pico Plus 27	High resolution printer for micro-drive
3D printer	Stratasys	Mojo	Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus	Kopf	Model 963
Binocular microscope	Leica	M60
Treadmill apparatus			We build them