Implantación de sondas de silicio crónica y grabación de las células Hippocampal del lugar en un aparato de cinta enriquecido

Resumen

Describimos los pasos diversas sondas de silicio crónica del implante y registrar lugar células en ratones que son cabeza de funcionamiento fijo en un aparato de cinta enriquecida con cue.

Resumen

Un requisito importante para la comprensión de la función cerebral es la identificación del comportamiento y correlaciona la actividad de la célula. Sondas de silicona son avanzadas electrodos para grabación electrofisiológica a gran escala de la actividad neuronal, pero los procedimientos para su implantación crónica son todavía subdesarrollados. La actividad de las células hippocampal del lugar se sabe que correlacionan con la posición de un animal en el medio ambiente, pero los mecanismos subyacentes no están claros todavía. Para investigar las células de lugar, aquí se describe un conjunto de técnicas que van desde la fabricación de dispositivos para la sonda de silicona crónica implantes para el monitoreo de la actividad de campo lugar en un aparato de cinta enriquecida con cue. Una unidad de micro y un sombrero son construidos por el montaje y sujeción a impreso en 3D las piezas de plástico. Una sonda de silicona es montada en la unidad de micro, limpiada y cubierta con el tinte. Una primera cirugía se realiza para fijar el sombrero sobre el cráneo de un ratón. Pequeños hitos son fabricados y a la banda de una caminadora. El ratón está capacitado para funcionar cabeza fijada en la caminadora. Se realiza una segunda cirugía para implantar la sonda de silicona en el hipocampo, después de que las señales electrofisiológicas banda ancha se registran. Finalmente, la sonda de silicona es recuperada y limpiada para su reutilización. El análisis de la actividad de la célula de lugar en la cinta revela una diversidad de mecanismos de campo, que el beneficio del enfoque.

Introducción

Sondas de silicio presentan varias ventajas para las grabaciones electrofisiológicas, incluido el hecho de que están diseñados con perfiles agudos reduciendo al mínimo daño tisular y que presentan un diseño preciso de densamente grabación sitios^{1, 2,3,4}. Se utilizan para el estudio de diferentes sistemas en diferentes especies, incluyendo seres humanos^3,5,6, con diversos enfoques^1,7. Sin embargo, su uso recurrente es todavía relativamente limitado debido a su costo, fragilidad y el hecho de que carecen de métodos convenientes para los experimentos crónica⁸. Los avances recientes en tecnología de impresión 3D han hecho posible el diseño personalizado de dispositivos tales como unidades de micro y las placas de la cabeza para permitir un más fácil manejo de estos delicados electrodos. En un primer paso, se describe cómo crear y utilizar un conjunto de herramientas que hemos desarrollado para la implantación de sondas de silicio crónica¹⁴.

Mientras que las células de lugar típicamente se estudian libremente mover animales en laberintos, recientemente ellos también investigaron en entornos virtuales¹⁵ y en cinta de correr apparatii⁹ (figura 1A). Estos métodos experimentales ofrecen la ventaja de que los animales pueden cabeza-restringida, el uso de 2 fotones microscopio¹⁵, abrazadera del remiendo¹⁶y optrode^9,10,11 técnicas más fáciles, además de proporcionar mejor control sobre el comportamiento animal y señales ambientales¹². En un segundo paso, vamos a presentar los procedimientos de formación de ratones y grabar la actividad de células de lugar en un aparato de cinta de correr.

Protocolo

todos los métodos descritos han sido aprobados por la Comisión de uso del Instituto Coreano de ciencia y tecnología y de cuidado Animal.

1. preparación de la unidad de Micro y electrodo

1. montar la micro unidad.
   1. Imprimir las partes de la unidad de micro (control deslizante, cuerpo y shell) ¹⁴ usando una impresora 3D de alta resolución. Asegúrese de que las partes tienen ningunos defectos.
   2. Fijar el deslizador en el cuerpo de la unidad de micro con un tornillo (tamaño 000-120 x 1/4).
   3. Soldar una tuerca (tamaño 000-120 000-120/64 Hex) en la punta del tornillo.
   4. Gire el tornillo hacia la derecha para mover el control deslizante hacia arriba o hacia la izquierda para mover hacia abajo.
   5. Fijar la cáscara al cuerpo con un tornillo (tamaño 000-120 x 1/4).
2. Montaje de la sonda en el micro disco.
   1. Fijar la unidad de micro en posición horizontal bajo un microscopio binocular.
   2. Utilizar una pinza plana con relleno de goma para agarrar el cable de la flexión de la punta de prueba de silicio, mientras que separar con cuidado la sonda de la caja de envío con el fórceps. Fijar la pinza de cocodrilo a un manipulador de.
   3. Utilizando el manipulador, coloque la sonda de silicona en el regulador de la impulsión micro, paralelo a la dirección del movimiento.
   4. Aplique una gota de cemento dental (dental de acrílico de curado temperatura material reparación) para fijar la sonda en la botella. Corregir la posición de la sonda si ha cambiado de puesto. Pegamento no se recomienda ya que endurece muy rápido y es difícil reajustar la posición del electrodo.
   5. Fijar el conector de la sonda a la titular de la C (soporte de conector) con cemento dental.
3. Limpieza y poner tinte en la sonda de. Conjunto
   1. fijar la sonda de Microdrive en el dispositivo de limpieza de sonda. El dispositivo está equipado con 2 rotación pequeñas esponjas de espuma (hisopos no estériles). Ajustar el espacio libre por el manipulador.
   2. Empapar las esponjas con detergente.
   3. Lentamente mueva la sonda hacia arriba y hacia abajo entre las esponjas, lo que permite un tacto suave. Supervisar el proceso de limpieza bajo el microscopio.
   4. Lave la sonda con agua destilada. Sumergir la sonda en el alcohol para esterilización.
   5. Aplicar Dil (tinte lipofílico fluorescente) en la parte posterior de la caña de la sonda, utilizando un aplicador de espuma. Esto permitirá en una fase posterior a la visualización de ubicaciones de caña en el cerebro.
4. Armar el sombrero
   1. imprimir las piezas del sombrero (cabeza-placa, sostenedor del conectador y la tapa) ¹⁴ mediante una impresora 3D. Las 3 partes encajan entre sí para formar una caja sellada.
   2. Insertar tuercas (tamaño M2 y 00-90 00-90/4) en las ranuras de la placa de la cabeza y fijar con pegamento y cemento dental.
   3. Meter una arandela en el orificio de la tapa y fijar con cemento dental.

2. Cirugía para la fijación del sombrero en el cráneo

todas las herramientas utilizadas para la cirugía son esterilizadas previamente en autoclave. Se utiliza un dispositivo de calor seco granos forto esterilizar herramientas que contaminación, deben ser esterilizados durante la cirugía.

1. Establece el nivel de isoflurano al 4% para la iniciación de la anestesia. Poner el ratón en la cámara de anestesia por 5 min
2. Instale el mouse en un aparato estereotáxicas.
3. Reducir el nivel de isoflurano al 1.5-2%. Ajustar el nivel durante la cirugía según el estado del animal, la frecuencia respiratoria y el cuerpo temperatura ²⁰.
4. Ungüento oftálmico se aplica en los ojos.
5. Afeitado del cuero cabelludo y limpiar la cabeza del animal con un antiséptico (iodopovidone). Mantener las condiciones asépticas durante todos los pasos de la cirugía.
6. Inyectar bupivacaína (1 mg/kg) en el cuero cabelludo. Cortar y eliminar parte de la piel parietal de la cabeza de ratón con unas tijeras finas para exponer el cráneo en sus bordes. Use solución salina y una esponja hemostática para limpiar y controlar el sangrado durante la cirugía.
7. Quitar el periostio con una herramienta del raspador.
8. Encontrar los puntos de referencia en el cráneo ²¹: bregma, lambda, coronal y sutura sagital. Ajuste la cabeza ' s ángulo sobre el eje sagital que el Bregma y lambda puntos a la misma altura.
9. Taladrar dos orificios (~0.5 mm de diámetro) en el cráneo para los electrodos de referencia y tierra. Los agujeros deben ser aproximadamente 1 mm caudal y lateral de 1 mm de la Lambda.
10. Insertar los electrodos de tierra y referencia (tamaño miniatura de 000-120 000-120/16 acero inoxidable tornillos alambre junto a los conectores de pin).
11. Luz ultravioleta (UV) de aplicar adhesivo activador de dentina en el cráneo y luego aplicar luz UV para el 45-60 s.
12. Aplicar una capa de cemento dental de los bordes del cráneo. Evitar la propagación de cemento sobre la piel y el pelo de los ratones.
13. Fijar la placa de la cabeza a un manipulador estereotáxicas y colóquelo sobre el cráneo. Lentamente baje la placa de la cabeza hasta que toque ligeramente el cráneo y Aplique cemento dental en la Unión con el cráneo. Deje que la curación de cemento dental de 15 minutos
14. Eliminar la anestesia. Fijar un conector-soporte y una tapa para la cabeza de la placa. Poner el ratón en su jaula después de dar una inyección sub cutánea de ketaprofen 5 mg/kg.
15. Dar inyecciones sub cutáneas de ketaprofen 5 mg/kg para los dos próximos días y monitorear cuidadosamente cualquier signo de dolor. Típicamente despiertan ratones de anestesia dentro de 20-40 minutos. El implante de sombrero es relativamente luz 3,34 g, tales que los ratones no tienen problemas para levantar su cabeza, correr en laberintos y subir en los bordes de su jaula casa.

3. Entrenamiento conductual

1. después de un período de recuperación después de la cirugía de 7 días, iniciar la restricción de agua en 1 mL al día.
2. Para hacer la correa de la cinta de correr, cortar un trozo de tela de terciopelo (5 cm por 1-2 m) y fijar objetos pequeños usando pegamento caliente. Coloque objetos construidos en los bordes de la correa para no interferir con el movimiento del ratón.
3. Fijar la correa sobre las ruedas de la caminadora suturando los dos extremos.
4. Instale el mouse cabeza fija en la cinta insertar y apretar los dos tornillos de la placa del cabezal en las ranuras de la placa de fijación de cabeza.
5. Comienzo el ratón se refrenaron de cabeza en la carrera por el premio del agua de formación. Entregar la recompensa de agua a través de un puerto de lamer. Inicialmente, ponga el ratón en la caminadora durante períodos de 10 minutos, 3 veces al día.
6. Como el ratón se habitúe a la fijación de la cabeza y empieza a moverse la cinta (normalmente después de ~ 3 días), aumentar la sesión de entrenamiento duración a 30 minutos. Después de 2-3 semanas, algunos ratones correr más de 100 ensayos en 30 minutos (un ensayo que una rotación completa de la banda).
7. Elegir los ratones que muestran las actuaciones mejor comportamiento para los experimentos de grabación.

4. Implantación de la sonda de silicona

1. poner el ratón bajo anestesia.
2. Instale el mouse en el aparato estereotáxicas mediante la fijación de la placa de la cabeza. Limpie la superficie del cráneo con solución salina.
3. Encontrar marcadores estereotáxicas: bregma, lambda, coronal y sutura sagital. Mida la distancia hasta el punto de inserción y marque lo
4. Perforar el hueso con cuidado hasta que sea fino y transparente. Humedecer y limpiar con solución salina durante la perforación.
5. Retire con cuidado el hueso enrarecido y la materia Dura fuerza de precisiónPS. Mantenga la superficie del cerebro mojado con una solución salina todo el tiempo.
6. Fije al ensamblaje de la sonda de Microdrive/silicio a un manipulador estereotáxicas. Llevar la punta de prueba de silicio justo por encima de la craneotomía. El titular silicio sonda conector de la placa de la cabeza del tornillo.
7. Conectar los electrodos de grabación amplificador y tierra de referencia. Escudo del ratón con papel de aluminio para proteger del ruido electromagnético. Inicie el sistema de registro para monitorear la actividad eléctrica del cerebro.
8. Introduzca lentamente la sonda de silicona en el cerebro mediante el micromanipulador. Controlar continuamente las señales eléctricas, la distancia viajada de manipulador y la caña de la sonda (Asegúrese de que están penetrando en el cerebro). Actividad de la unidad es visible en la corteza mientras que la materia blanca por debajo es relativamente silenciosa. Actividad de la unidad vuelve a aparecer cuando la caña toca la capa piramidal del hipocampo. Desde este punto, retraiga el silicio sonda 200 μm (utilice la unidad de micro al día siguiente para poner la caña en la capa piramidal).
9. Cubrir la superficie del cerebro con una mezcla de cera de hueso y aceite mineral.
10. Fijar la unidad de micro en la placa de la cabeza con cemento dental. Deje que la curación de cemento dental durante 15 minutos. Luego separar la unidad micro del manipulador estereotáxicas y ponga la tapa del sombrero en.
11. Poner el ratón en su jaula y dar una inyección sub cutánea de ketaprofen 5 mg/kg. Busque cualquier signo de dolor. Esta cirugía es mucho menos invasiva que la primera y los ratones son típicamente activos dentro de 45 minutos después de despertar de la anestesia. Sin embargo, que el ratón recuperar todo el día ya que la sonda de silicona debe estabilizar en el cerebro.

5. Grabación

1. instalar el ratón jefe fijo en la caminadora. Quitar el sombrero cap.
2. Conectar el amplificador de grabación y empezar la grabación.
3. El primer día, utilizar la unidad de micro para mover la punta de prueba de silicio en la capa piramidal del hipocampo. Cada vuelta a la izquierda del tornillo mueve la caña 200 μm más profundo. Ajustar la posición de la caña lentamente (~ 20-50 μm a la vez) hasta que aparezcan oscilaciones de onda ¹³ y unidad actividad.
4. En los próximos días, ajustar la posición de la caña y esperar ~ 1 h antes de grabar la actividad del hipocampo, mientras que el ratón funciona en la banda. Para mantener la calidad de grabación buena señal por varios días, quitar objetos duros y bajo techo del ratón ' jaula de s para reducir al mínimo la posibilidad del sombrero de topa en superficies duras.

6. Recuperación de la sonda

1. poner el ratón bajo anestesia.
2. Instale el mouse en el aparato estereotáxicas mediante la fijación de la placa de la cabeza. Quitar el sombrero cap.
3. Traer el manipulador estereotáxicas justo por encima de la unidad de micro. Fijar la unidad de micro para el manipulador. Desatornille el portafusibles de conector de la placa de la cabeza. Quite el tornillo de conexión de la cáscara y el cuerpo de la unidad de micro.
4. Bajo la supervisión de microscopio binocular, lentamente Levante el ensamblaje de la sonda micro-coche/del silicio con el manipulador estereotáxicas, dejando la parte de shell.
5. Limpiar la sonda de silicona con el dispositivo de limpieza.

Resultados

Un ratón primero fue entrenado para correr en una correa larga de dos metros sin señales (figura 1). Después de la implantación de electrodos, una correa nueva de la misma longitud pero que presentan 3 pares de señales se instaló en la caminadora, para generar allocentric representaciones espaciales^12,14. Se registraron señales de banda ancha a una velocidad de muestreo de 30.000 Hz, usando un ...

Discusión

Crónica registro de la actividad neuronal es fundamental para entender procesos de los nervios tales como campos de hippocampal del lugar. Nuestro enfoque para realizar implantantation de sonda de silicona crónica se distingue de otros métodos^7,18,19,20 por el hecho de que es relativamente simple recuperar el paquete de electrodos en al final del experimento. Mientras que células de lugar t...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Probe	Neuronexus	Buzsabi32	Recording electrode
Recording system	Intantech	RHD2132/RHD2000
3D printer	Asiga	Pico Plus 27	High resolution printer for micro-drive
3D printer	Stratasys	Mojo	Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus	Kopf	Model 963
Binocular microscope	Leica	M60
Treadmill apparatus			We build them