만성 실리콘 프로브 및 녹음 풍부한 디딜 방 아 장치에 Hippocampal 장소 세포의 이식

요약

우리는 만성 실리콘 프로브를 이식 하 고 마우스는 디딜 방 아 큐 농축 장치에 실행 머리 고정에 장소 세포를 기록 하는 다양 한 단계를 설명 합니다.

초록

뇌 기능을 이해 하기 위한 중요 한 필요한 행동의 식별 이며 세포 활동 연결. 실리콘 감지기 전극 신경 활동의 대규모 electrophysiological 녹음에 대 한 고급 하지만 그들의 만성 이식에 대 한 절차는 아직도 저 개발. Hippocampal 장소 세포의 활동은 환경에서 동물의 위치와 상관 관계를 알려져 있지만 근본적인 메커니즘은 아직 명확 하지 않다. 장소 세포 조사, 여기 우리가 만성 실리콘 프로브에 대 한 장치의 제조 이르기까지 디딜 방 아 큐 농축 장치에 장소 필드 활동의 모니터링을 이식 하는 기술의 세트를 설명 합니다. 마이크로 드라이브와 모자 및 3D 인쇄 플라스틱 부품을 함께 고정 하 여 만들어집니다. 실리콘 프로브 마이크로 드라이브에 탑재, 청소, 이며 염료와 코팅. 첫 번째 수술에는 마우스의 두개골 모자를 해결 하기 위해 수행 됩니다. 작은 랜드마크 조작 하는 디딜 방 아의 벨트에 연결 된. 마우스 머리 고정을 실행 하는 훈련은 디딜 방 아에. 두 번째 수술은 이식 해 마, 어떤 광대역 electrophysiological 신호가 기록 됩니다 다음에 실리콘 프로브를 수행 됩니다. 마지막으로, 실리콘 프로브 회수 이며 재사용에 대 한 청소. 디딜 방 아에서 장소 세포 활동의 분석 다양을 한 접근의 혜택을 설명 하는 장소 필드 메커니즘을 보여준다.

서문

실리콘 프로브 electrophysiological 기록, 그들은 날카로운 프로필 조직 손상과 그들은 사이트^{1, 기록 밀도가 포장의 정확한 레이아웃을 제시를 최소화 설계 된 있다는 사실을 포함 하 여에 대 한 몇 가지 장점을 제시합니다 2,,34}. 그들은 다른 종에서 인간^3,,56, 다양 한 접근^1,7을 포함 하 여 다양 한 시스템을 연구 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 그들의 재발 사용은 그들의 비용, 취약성, 및 만성 실험을 위한 편리한 방법⁸부족 사실 때문에 여전히 상대적으로 제한 된. 3D 인쇄 기술의 최근 발전 장치 마이크로 드라이브 등이 섬세 한 전극의 쉽게 처리 수 있도록 헤드 플레이트의 사용자 지정 디자인을 가능한 만들었습니다. 첫 번째 단계에서 만성 실리콘 프로브¹⁴의 이식에 대 한 우리 개발 도구 집합을 사용 하는 방법을 설명 합니다.

장소 세포는 일반적으로 자유롭게 움직이는 동물 미로에서 실행을 사용 하 여 공부 하 고, 그러나 최근에 그들은 또한 조사 되었다 디딜 방 아 apparatii⁹ (그림 1A)와 가상 환경¹⁵ 에서. 이러한 실험 방법은 그 동물 수 있을 머리-제 지, 2 광자 현미경¹⁵,¹⁶, 패치 클램프 및 optrode^9,,1011 의 사용 하는 이점을 제공합니다 기술 쉽게, 동물 행동 및 환경 단서¹²향상 된 제어를 제공 하. 두 번째 단계에서 우리는 쥐 훈련과 디딜 방 아 장치에 장소 세포 활동을 기록 하는 절차를 발표할 예정 이다.

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프로토콜

설명 하는 모든 방법을 동물 관리 및 사용 위원회 한국 과학 및 기술에 의해 승인 되었습니다.

1. 마이크로 드라이브와 전극 준비

1. 마이크로 드라이브를 조립.
   1. (슬라이더, 몸, 및 셸) 마이크로 드라이브의 부분을 인쇄 ¹⁴ 고해상도 3D 프린터를 사용 하 여. 부품 아무 결함을가지고 있는지 확인 하십시오.
   2. 나사 (000-120 x 1/4 크기)와 마이크로 드라이브 몸으로 슬라이더를 수정.
   3. 너트 솔더 (000-120 000-120/64 16 진수 크기)는 스크류의 끝에.
   4. 나사를 시계 방향으로 슬라이더를 위로 또는 아래로 이동 하려면 시계 반대 방향으로 이동.
   5. 나사 (000-120 x 1/4 크기)와 신체에 셸을 수정.
2. 마이크로 드라이브에 프로브를 장착.
   1. 쌍 안 현미경 수평 위치에 있는 마이크로 드라이브를 수정.
   2. 고무 패딩 플랫 악어 클립을 사용 하 여 신중 하 게 집게와 선적 인클로저에서 프로브를 분리 하는 동안 실리콘 프로브의 플렉스 케이블을 잡아. 조작자에 악어 클립을 수정.
   3. 운동의 방향에 마이크로 드라이브 슬라이더에 실리콘 프로브를 평행 하다, 조작자를 사용 하 여.
   4. 적용 치과 시멘트의 드롭 (실 온 경화 아크릴 치과 자료 복구) 프로브 슬라이더를 해결 하기 위해. 그것은 이동 하는 경우 프로브 위치를 수정 합니다. 접착제는 권장 하지 않습니다 그것은 매우 빠르게 치료 및 전극 위치 조정 하기가 어렵습니다.
   5. 치과 시멘트와 프로브를 C-홀더 (홀더 커넥터)의 커넥터 수정.
3. 클리닝 하 고 염료는 프로브에.
   1. 수정 마이크로 드라이브/프로브 프로브 청소 장치에 조립. 장치는 2 작은 회전 거품 스폰지 (비 멸 균 면봉)을 갖추고 있습니다. 조작자 간격 조정.
   2. 세제와 스폰지를 적시 게.
   3. 는 서서히 부드러운 터치 수 있도록 스폰지 사이 여기저기에 프로브를 이동 합니다. 현미경으로 청소 과정 모니터링.
   4. 는 증류수로 프로브 린스. 살 균에 대 한 알코올에 프로브를 찍어.
   5. 적용 Dil (닥터지 형광 염료) 프로브, 정강이의 뒤에 거품 면봉을 사용 하 여. 이것은 두뇌에서 생크 위치 시각화 나중 단계에서 수.
4. 조립 모자
   1. 모자 (머리 판, 커넥터 홀더, 및 모자)의 부분을 인쇄 ¹⁴ 3D 프린터를 사용 하 여. 3 부품 밀봉 된 인클로저를 형성 하기 위하여 맞는.
   2. 머리 판 및 접착제와 치과 시멘트 수정의 슬롯에 삽입 너트 (m 2와 00-90 시-90/4 크기).
   3. 세탁기 뚜껑의 슬롯에 삽입 하 고 치과 시멘트로 수정.

2. 두개골에 모자의 고정을 위한 수술

수술에 사용 되는 모든 도구는 압력가 마로 소독 하 여 미리 살 균 된다. 건조 열 구슬 장치는 forto 오염 되 고 수술 하는 동안 소독 하는 데 필요한 도구를 소독.

1. 마 취의 개시에 대 한 4 %isoflurane 수준을 설정합니다. 5 분에 대 한 마 취 약 실에 있는 마우스를 넣어
2. Stereotaxic 장치에 마우스를 설치.
3. 는 1.5-2 %isoflurane 수준을 줄일. 동물 상태, 호흡 속도 따라 수술 하는 동안 레벨을 조정 하 고 몸 온도 ²⁰.
4. 눈에 눈 연 고를 적용.
5. 두 피를 면도 하 고 살 균 (iodopovidone)와 동물의 머리를 청소. 수술의 모든 단계 동안 무 균 상태를 유지.
6. 두 피 아래 넣기 bupivacaine (1 mg/kg). 잘라 고 좋은 위를 사용 하 여 그것의 가장자리에 두개골을 폭로 하는 마우스 머리의 정수 리 스킨의 일부를 제거 합니다. 염 분 및 hemostatic 스폰지를 사용 하 여 청소 하 고는 수술 중 출혈 제어.
7. 긁는 도구 도구를 사용 하 여과 제거.
8. 두개골 ²¹에 참조 점의 찾을: bregma, 람다, 코로나와 화살 봉합. 머리를 조정 ' 되도록 Bregma 점과 람다 같은 높이에서 s 화살 축 각도.
9. 참조 및 접지 전극에 대 한 두개골에 두 개의 구멍 (~0.5 m m 직경) 드릴. 구멍 해야 약 1 m m 꼬리 람다의 1 m m 옆.
10. 지상 및 기준 전극 (크기 000-120 000-120/16 미니어처 스테인리스 나사 와이어-핀 커넥터 결합) 삽입.
11. 적용 자외선 (UV) 두개골에 상 아질 활성기를 결합 한 다음 자외선 45-60 미에 대 한 적용
12. 는 두개골의 가장자리에 치과 시멘트의 레이어를 적용. 피부와 쥐의 머리에 시멘트를 확산 방지.
13. Stereotaxic 조작에 머리 판을 해결 하 고 두개골 위에 위치. 천천히 머리 판 두개골, 약간 접촉 될 때까지 낮은 고 치과 시멘트와 두개골 접합에 적용 합니다. 15 분을 위한 치과 시멘트 치료 하자
14. 마 취를 제거합니다. 커넥터-보유자와 머리 판에 캡 수정. Ketaprofen의 하위 피부 주입을 주기 후에 그것의 감 금에서 마우스를 넣어 5 mg/kg.
15. 줄 ketaprofen의 하위 피부 주사 두 일을 신중 하 게 고통의 어떤 표시 든 지에 대 한 모니터에 대 한 5 mg/kg. 마우스는 일반적으로 20-40 분 이내 마 취에서 깨어나. 임 플 란 트 모자는 상대적으로 같은 마우스 아무 문제가 그들의 머리를 리프트 하 고, 미로에서 실행 하 고 등반을 그들의 집에 감 금 소의 가장자리에 빛 (3.34 g).

3. 행동 훈련

1. 7 일 수술 후 회복 기간, 후 일 당 1 mL에 물 제한 시작.
2. 디딜 방 아 벨트를 만들기 위해 벨벳 직물 (1-2 m 5 c m)의 조각을 잘라 하 고 뜨거운 접착제를 사용 하 여 그것에 작은 물체를 수정. 마우스의 움직임을 방해 하기 위하여 벨트의 가장자리에 지어진된 개체 연결.
3. 함께 두 끝을 봉합 하 여 디딜 방 아의 바퀴에 벨트를 해결.
4. 머리 고정 플레이트의 슬롯에 머리 판의 2 개의 나사를 조여 여 디딜 방 아에 머리 고정 마우스 설치.
5. 머리 억제 물 보상에 대 한 디딜 방 아에 실행 하려면 마우스를 훈련 하는 시작. 핥 아 포트를 통해 물 보상을 제공 합니다. 처음 10 분, 하루에 3 번의 기간에 대 한 디딜 방 아 마우스를 입었다.
6. 마우스 머리 고정에 사용 되 면 (일반적으로 3 일 후), 벨트를 이동 하려면 시작으로 증가 훈련 세션 지속 시간 30 분을. 2-3 주 후, 일부 마우스 30 분 (벨트의 전체 회전 되는 재판)에 100 개 이상의 실험을 실행.
7. 행동 기록 실험에 대 한 최고의 공연을 보여주는 마우스 선택.

4. 프로브 실리콘의 주입

1. 넣어 마 취 마우스.
2. 머리-플레이트를 고정 하 여 stereotaxic 장치에 마우스를 설치 합니다. 식 염 수로 두개골 표면 청소.
3. 찾을 stereotaxic 마커: bregma, 람다, 코로나와 화살 봉합. 삽입 지점에 거리를 측정 하 고 표시 합니다.
4. 얇고 투명 하 게 될 때까지 신중 하 게 뼈를 드릴. 축 축 하 고 시추 하는 동안 염 분 깨끗.
5. 남았다 뼈 및 정밀 힘을 사용 하 여 경질 문제를 신중 하 게 제거ps. 뇌 표면 염 분으로 항상 젖은 유지.
6. Stereotaxic 조작에 마이크로 드라이브/실리콘 프로브 조립 수정. 바로 위에 craniotomy 실리콘 프로브를가지고. 나사 머리 접시에 실리콘 프로브 커넥터 홀더.
7. 녹음 앰프 및 접지/참조 전극 연결합니다. 방패 전자기 잡음 으로부터 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 마우스. 뇌의 전기 활동을 기록 시스템 시작.
8. 천천히는 micromanipulator를 사용 하 여 뇌에 실리콘 프로브를 삽입 합니다. 지속적으로 전기 신호, 조작 여행 거리 및 프로브의 정강이 확인 (그들은 두뇌에 있는 침투는 확인). 단위 활동 아래 백색 질은 상대적으로 침묵 하는 동안 대뇌 피 질에 표시 됩니다. 단위 활동에는 정강이 해 마의 피라미드 계층을 만질 때 다시 나타납니다. 이 시점에서 철회 실리콘 프로브 200 µ m (마이크로 드라이브를 다음날 사용 피라미드 계층에 다시 칼을가지고).
9. 뼈 왁 스, 미네랄 오일의 혼합물으로 뇌의 표면을 커버.
10. 치과 시멘트를 사용 하 여 머리 판에 마이크로 드라이브를 수정 합니다. 15 분 동안 치과 시멘트 치료 하자. 다음 stereotaxic 조작에서 마이크로 드라이브를 분리 하 고 다시 넣어 모자 모자.
11. 마우스 다시는 새 장에 넣고 ketaprofen의 하위 피부 주사를 주고 5 mg/kg. 고통의 어떤 표시 든 지를 확인 합니다. 이 수술은 첫 번째 보다 훨씬 덜 침략 그리고 마우스는 일반적으로 45 분 이내 활성 후 그들은 웨이크 업 마 취에서. 그러나, 마우스 실리콘 프로브 두뇌에 안정 하기 때문에 하루 종일 복구 하자.

5. 녹음

1. 설치 마우스 머리 고정 디딜 방 아에. 모자 뚜껑 제거
2. 녹음 앰프를 연결 하 고 녹음을 시작.
3. 첫 날,를 사용 하 여 마이크로 드라이브 실리콘 프로브는 해 마의 피라미드 계층으로 이동. 나사 각 시계 반대 방향으로 회전 정강이 200 µ m 깊이 이동합니다. 생크 위치를 천천히 조정 (20 ~ 50 한 번에 µ m) 리플 진동 ¹³ 및 단위 활동 나타날 때까지.
4. 다음 일에 칼 위치를 조정 하 고 마우스 벨트에서 실행 하는 동안 hippocampal 활동을 기록 하기 전에 ~ 1 h를 기다려. 몇 일 동안 좋은 녹음 신호 품질을 유지 하려면 하드 개체를 제거 하 고 마우스에서 천장 낮은 ' 모자 하드 표면에 충돌 하는 기회를 최소화 하기 위해 s 케이지.

6. 복구 조사

1. 넣어 마 취 마우스.
2. 머리-플레이트를 고정 하 여 stereotaxic 장치에 마우스를 설치 합니다. 모자 뚜껑 제거
3. 가지고 바로 위에 마이크로 드라이브 stereotaxic 조작. 마이크로 드라이브는 조작자를 수정 합니다. 나사 머리 접시에서 커넥터 홀더. 껍질과 마이크로 드라이브의 연결 나사를 제거.
4. 셸 부분 쌍 안 현미경 감독, 천천히 올려 stereotaxic 조작자와 마이크로 드라이브/실리콘 프로브 조립 남겨두고.
5. 실리콘 프로브 청소 장치 청소.

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결과

마우스 처음 신호 (그림 1C) 없는 2 미터 긴 벨트에서 실행 하도록 훈련 되었다. 전극 이식, 동일한 길이의 새로운 벨트를 따라 하지만 3 쌍의 단서를 제시, 디딜 방 아에 allocentric 공간 표현^12,14을 생성 하기 위해 설치 되었다. 광대역 신호 250 채널 녹화 시스템 (증폭기 보드 USB 인터페이스 보드 및 Labview 인터?...

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토론

신경 활동의 만성 녹음은 hippocampal 장소 필드 같은 신경 과정을 이해 하는 데 중요 합니다. 만성 실리콘 프로브 implantantation를 수행 하는 접근 방식 그것은 상대적으로 간단에 전극 패키지를 복구 하는 사실에 의해 다른 방법^7,18,,1920 에서 자체 구별 실험의 끝입니다. 장소 세포는 일반적으로 자유롭게 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Probe	Neuronexus	Buzsabi32	Recording electrode
Recording system	Intantech	RHD2132/RHD2000
3D printer	Asiga	Pico Plus 27	High resolution printer for micro-drive
3D printer	Stratasys	Mojo	Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus	Kopf	Model 963
Binocular microscope	Leica	M60
Treadmill apparatus			We build them