Implantação de sondas de silicone crônica e gravação de lugar Hippocampal células em um aparelho de esteira enriquecido

Resumo

Descrevemos as medidas diversas para implante de silicone crônica sondas e gravar lugar células em ratos que são cabeça running-fixo em um aparelho de esteira cue-enriquecido.

Resumo

Um requisito importante para a compreensão do funcionamento do cérebro é a identificação do comportamento e atividade das células correlaciona. Sondas de silicone são avançadas eletrodos para gravação eletrofisiológico em larga escala da atividade neuronal, mas os procedimentos para sua implantação crônica são ainda subdesenvolvidos. A atividade das células do hipocampo lugar chama-se correlacionar com a posição do animal no ambiente, mas os mecanismos subjacentes não são ainda claras. Para investigar o lugar células, aqui descrevemos um conjunto de técnicas que vão desde a fabricação de dispositivos para sonda de silicone crônica de implantes para o monitoramento da atividade de campo lugar em um aparelho de esteira cue-enriquecido. Uma unidade de microe um chapéu são construídos por encaixe e fixação juntos as peças de plástico 3D-impresso. Uma sonda de silicone é montada na unidade micro, limpos e revestida com corante. Uma primeira cirurgia é realizada para corrigir o chapéu no crânio de um rato. Pequenos pontos de referência são fabricados e anexados ao cinto de uma escada rolante. O mouse é treinado para executar cabeça-fixo na esteira. Uma segunda cirurgia é realizada para implantar a sonda de silicone no hipocampo, que banda larga sinais eletrofisiológicos são registrados a seguir. Finalmente, a sonda de silicone é recuperada e limpo para reutilização. A análise da atividade das células lugar na esteira revela uma diversidade de mecanismos de campo, o benefício da abordagem de estrutura de tópicos.

Introdução

Sondas de silicone apresentam diversas vantagens para gravações eletrofisiológicas, incluindo o fato de que eles são projetados com perfis afiadas, minimizando danos nos tecidos e que apresentam um layout preciso de densamente gravação sites^{1, 2,3,4}. Eles são usados para estudar vários sistemas em diferentes espécies, incluindo^5,seres humanos^3,6, com diversas abordagens^1,7. Ainda, seu uso recorrente é ainda relativamente limitado por causa de seu custo, fragilidade e o fato de que métodos convenientes para experimentos crônicos faltam⁸. Recentes avanços na tecnologia de impressão 3D tornaram possível o projeto personalizado de dispositivos como unidades de micro e cabeça-placas para permitir uma manipulação mais fácil desses eletrodos delicados. Em uma primeira etapa, descreveremos como construir e usar um conjunto de ferramentas que desenvolvemos para a implantação de silicone crônica sondas¹⁴.

Enquanto lugar de células são tipicamente estudadas usando animais movimentando-se livremente, correr em labirintos, recentemente eles foram também investigados em ambientes virtuais¹⁵ e na esteira apparatii⁹ (figura 1A). Estes métodos experimentais oferecem a vantagem de que os animais podem ser cabeça-imobilizados, fazendo o uso de microscópio 2-fóton¹⁵, remendo-braçadeira¹⁶e optrode^9,10,11 técnicas mais fácil, além de proporcionar maior controle sobre comportamento animal e pistas ambientais¹². Em uma segunda etapa, apresentaremos os procedimentos para a formação de ratos e atividade de célula de lugar de gravação em um aparelho de esteira.

Protocolo

todos os métodos descritos foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de Coreia da ciência e tecnologia e cuidado Animal.

1. preparando a unidade de Micro e eletrodo

1. montar o micro drive.
   1. Imprimir as peças do micro-drive (controle deslizante, corpo e shell) ¹⁴ usando uma impressora 3D de alta resolução. Certifique-se as peças sem defeitos.
   2. Consertar o controle deslizante para o corpo de micro-drive com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).
   3. Soldar uma porca (tamanho 000-120 120 000/64 Hex) para a ponta do parafuso.
   4. Gire o parafuso no sentido horário para mover o controle deslizante até ou anti-horário para movê-lo para baixo.
   5. Corrigir o shell para o corpo com um parafuso (tamanho 000-120 x 1/4).
2. a sonda de montagem na unidade micro.
   1. Reparar o micromovimentação na posição horizontal, sob um microscópio binocular.
   2. Use um agrafo plana com enchimento de borracha para pegar o cabo flex da sonda silício, enquanto desanexando cuidadosamente a sonda do gabinete da expedição com fórceps. Fixar o grampo de jacaré para um manipulador.
   3. Usando o manipulador, colocar a sonda de silicone no controle deslizante micro drive, paralelamente à direção do movimento.
   4. Aplicar uma gota de cimento dental (temperatura de cura acrílica dental reparar material) para fixar a sonda para o controle deslizante. Corrija a posição da sonda se mudou. Cola não é recomendada, pois ele cura muito rápido e torna difícil reajustar a posição do eletrodo.
   5. Consertar o conector da sonda para o C-suporte (suporte conector) com cimento dental.
3. Limpeza e colocar corante na sonda.
   1. Fix a sonda/Microdrive assemblage no dispositivo de limpeza de sonda. O dispositivo é equipado com 2 pequeno giro esponjas de espuma (amostras não-estéril). Ajustar a lacuna por manipulator.
   2. Embeber as esponjas com detergente.
   3. Mova lentamente a sonda em cima e para baixo entre as esponjas, que permite um toque suave. Monitorar o processo de limpeza sob um microscópio.
   4. Lavar a sonda com água destilada. Mergulhe a sonda em álcool para esterilização.
   5. Aplicar Dil (corante lipofílico fluorescente) na parte de trás dos desvios da sonda, usando um cotonete de espuma. Isto permitirá a visualização dos locais de haste no cérebro em uma fase posterior.
4. Montagem do chapéu
   1. imprimir as peças do chapéu (cabeça-placa, titular de conector e tampa) ¹⁴ usando uma impressora 3D. As 3 partes se encaixam para formar um gabinete selado.
   2. Inserir porcas (tamanho M2 e 00-90 90 00/4) nas ranhuras da cabeça-placa e fixar com cola e cimento dental.
   3. Inserir uma anilha na ranhura da tampa e fixe com cimento dental.

2. Cirurgia para fixação do chapéu no crânio

todas as ferramentas utilizadas para a cirurgia são esterilizadas previamente em autoclave. É utilizado um dispositivo de grânulos de calor seco forto esterilizar ferramentas que tornam-se contaminadas e precisam ser esterilizados durante a cirurgia.

1. Definir o nível de isoflurano para 4% para o início da anestesia. Coloque o mouse na câmara de anestesia 5 min.
2. Instalar o mouse em um aparelho estereotáxica.
3. Reduzir o nível de isoflurano 1,5-2%. Ajustar o nível durante a cirurgia de acordo com o estado animal, taxa de respiração e corpo temperatura ²⁰.
4. Aplicar a pomada sobre os olhos.
5. Raspar o couro cabeludo e limpar a cabeça do animal com anti-séptico (iodopovidone). Manter condições assépticas durante todas as etapas da cirurgia.
6. Inject bupivacaína (1 mg/kg), sob o couro cabeludo. Cortar e remover parte da pele da cabeça do mouse usando a tesoura bem para expor o crânio em suas bordas parietal. Usar soro fisiológico e uma esponja hemostática de limpar e controlar o sangramento durante a cirurgia.
7. Remover o periósteo usando uma ferramenta de raspador.
8. Encontrar os pontos de referência sobre o crânio ²¹: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Ajustar a cabeça ' s ângulo ao longo do eixo sagital, tal que o Bregma e o lambda pontos estão à mesma altura.
9. Dois furos (~0.5 mm de diâmetro) no crânio para os eletrodos de referência e o chão. Os furos devem ser de aproximadamente 1 mm caudal e lateral de 1 mm do Lambda.
10. Os eléctrodos do chão e referência (tamanho miniatura 000-120 000-120/16 aço inoxidável parafusos fio acoplados aos conectores de pino).
11. Aplicar raios ultravioleta (UV) ativador de dentina no crânio de ligação e em seguida, aplicar a luz UV para s. 45-60
12. Aplique uma camada de cimento dental nas bordas do crânio. Evitar a propagação de cimento sobre a pele e os cabelos dos ratos.
13. Fixe a chapa de cabeça para um manipulador estereotáxica e posicione-o acima do crânio. Lentamente Abaixe a cabeça-placa até toca ligeiramente o crânio e aplique o cimento dental na junção com o crânio. Deixe-a cura do cimento dental durante 15 min.
14. Remover a anestesia. Consertar um conector-titular e um boné na cabeça-placa. Coloque o mouse em sua jaula depois de dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg
15. Dar injeções sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg para os dois próximos dias e monitor cuidadosamente por qualquer sinal de dor. Os ratos normalmente acordam da anestesia dentro de 20-40 min. O implante de chapéu é relativamente luz (3,34 g), tal que os ratos não têm problemas para levantar sua cabeça, correr em labirintos e subir nas bordas de sua gaiola em casa.

3. Treinamento comportamental

1. após um período de recuperação pós-operatório de 7 dias, iniciar a restrição de água a 1 mL por dia.
2. Para fazer o cinto de esteira, corte um pedaço de tecido de veludo (5 cm por 1-2 m) e consertar pequenos objetos nele usando cola quente. Anexar objetos erigidos nas bordas da correia para não interferir com o movimento do mouse.
3. Fixar o cinto nas rodas da esteira de sutura juntos nas duas extremidades.
4. Instalar o mouse de cabeça-fixo na esteira inserindo e apertar os dois parafusos da placa de cabeça nas ranhuras da placa de fixação de cabeça.
5. Iniciar o mouse para correr de cabeça-contido na esteira para a recompensa de água de formação. Entrega a recompensa de água através de uma porta de lamber. Inicialmente, coloque o mouse sobre a esteira por períodos de 10 minutos, 3 vezes por dia.
6. Conforme o mouse se acostuma com a cabeça-fixação e começa a se mover a cintura (normalmente depois de ~ 3 dias), aumentar o treino duração de 30 min. Após 2-3 semanas, alguns ratos executar mais de 100 ensaios em 30 min (uma prova ser uma rotação completa do cinto).
7. Escolher os ratos apresentando as melhores performances comportamentais para os experimentos de gravação.

4. Implantação da sonda silício

1. colocar o rato sob anestesia.
2. Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Limpe a superfície do crânio com solução salina.
3. Encontrar marcadores estereotáxicos: bregma, lambda, coronal e sagital sutura. Medir a distância até o ponto de inserção e marcá-lo
4. Perfurar o osso cuidadosamente até que se torne fina e transparente. Umedecer e limpe com soro fisiológico durante a perfuração.
5. Remover cuidadosamente o osso diluído e a dura-máter usando força de precisãoPS. Mantenha a superfície do cérebro molhado com soro fisiológico, o tempo todo.
6. Corrigir a montagem de sonda Microdrive/silício para um manipulador estereotáxica. Traga a sonda de silicone acima a craniotomia. Dane-se o titular de conector de sonda de silicone na cabeça-placa.
7. Ligar os eléctrodos de terra/referência e amplificador de gravação. Escudo do mouse com folha de alumínio para proteger de ruído eletromagnético. Iniciar o sistema de gravação para monitorar a atividade elétrica do cérebro.
8. , Lentamente, introduzir a sonda de silicone no cérebro usando o micromanipulador. Verificar continuamente os sinais elétricos, a distância de manipulador viajado e os desvios da sonda (certifique-se que penetram no cérebro). Actividade da unidade é visível no córtex enquanto matéria branca por baixo é relativamente silenciosa. Actividade da unidade reaparece quando as canelas de tocar a camada piramidal do hipocampo. A partir deste ponto, retrair o silício sonda 200 µm (usar o micro-drive no dia seguinte para trazer a haste de volta para a camada piramidal).
9. Cobrir a superfície do cérebro com uma mistura de cera para osso e óleo mineral.
10. Consertar o micro-drive para a placa de cabeça usando cimento dental. Deixe a cura do cimento dental por 15 min. Então desanexar o microcarro do manipulador estereotáxica e ponha a chapéu boina.
11. Colocar o mouse de volta à sua jaula e dar uma injeção sub-cutâneo de ketaprofen 5 mg/kg. Verifique se há qualquer sinal de dor. Esta cirurgia é muito menos invasiva do que a primeira e ratos são normalmente ativos dentro de 45 min, depois eles acordar da anestesia. No entanto, deixe o mouse recuperar um dia inteiro, como a sonda de silicone precisa estabilizar no cérebro.

5. Gravação de

1. instalar o mouse cabeça fixa na esteira. Remova o boné chapéu
2. Ligar o amplificador de gravação e iniciar a gravação.
3. No primeiro dia, usar o micro-drive para mover a sonda de silicone para a camada piramidal do hipocampo. Cada volta anti-horário do parafuso move o shanks 200 µm mais profundo. Ajustar a posição da haste lentamente (~ 20-50 µm de cada vez) até que apareçam ripple oscilações ¹³ e unidade atividade.
4. Nos próximos dias, ajustar a posição da haste e esperar ~ 1 h antes da gravação da atividade hippocampal enquanto o mouse é executado no cinto. Para manter a qualidade de sinal boa gravação por vários dias, remover objectos duros e baixo teto do mouse ' gaiola s para minimizar a possibilidade do chapéu solavancos em superfícies duras.

6. Recuperando a sonda

1. colocar o rato sob anestesia.
2. Instalar o mouse no aparato estereotáxica, fixando a placa-de-cabeça. Remova o boné chapéu
3. Trazer manipulator estereotáxica logo acima do micro-drive. Conserte o micro-drive para o manipulador. Desaperte o porta-conector da placa de cabeça. Remova o parafuso conectando a concha e o corpo do micro-drive.
4. Sob a supervisão do microscópio binocular, lentamente levante a montagem de microunidade / silicon sonda com o manipulador estereotáxica, deixando a parte casca.
5. Limpe a sonda de silicone com o dispositivo de limpeza.

Resultados

Um rato primeiro foi treinado para ser executado em uma correia longa de dois metros desprovido de tacos (Figura 1). Pós-implante de eletrodo, uma nova correia do mesmo comprimento, mas apresentando 3 pares de sugestões foi instalado na esteira, a fim de gerar representações espaciais de allocentric^12,14. Sinais de banda larga foram registrados a uma taxa de amostragem de 30.000 Hz, usando um sist...

Discussão

Gravação crônica da atividade neuronal é fundamental para a compreensão de processos neurais como lugar hippocampal campos. Nossa abordagem para executar implantantation de sonda de silicone crônica se distingue de outros métodos^7,18,19,20 pelo fato de que é relativamente simples recuperar o pacote do eletrodo em o final do experimento. Enquanto lugar de células são tipicamente estuda...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Probe	Neuronexus	Buzsabi32	Recording electrode
Recording system	Intantech	RHD2132/RHD2000
3D printer	Asiga	Pico Plus 27	High resolution printer for micro-drive
3D printer	Stratasys	Mojo	Lower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatus	Kopf	Model 963
Binocular microscope	Leica	M60
Treadmill apparatus			We build them