Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kronik silikon sondalar implant ve bir işaret zenginleştirilmiş koşu bandı cihazları üzerinde çalışan kafa-sabit farelerde yer hücreleri kaydetmek için çeşitli adımlar açıklanmaktadır.

Özet

Beyin fonksiyonlarını anlamak için önemli bir koşul davranış tanımlamasıdır ve hücre etkinlik karşılıklı olarak ilişkilendirir. Silikon sondalar elektrotlar nöronal aktivite büyük ölçekli Elektrofizyolojik kayıt için gelişmiş, ama onların kronik implantasyon için yordamlar hala gelişmemiş. Hipokampal yer hücrelerin aktivitesini bir hayvanın bulunduğu çevre ile ilişkilendirmek için bilinir, ama temel mekanizmaları hala belirsiz. Yer hücreleri araştırmak için burada yer alan faaliyet bir işaret zenginleştirilmiş koşu bandı cihazları izleme için fabrikasyon kronik silikon sonda için aygıt hangi aralıktan implantlar teknikleri bir dizi tarif. Mikro sürücü ve bir şapka uygun ve birlikte 3D baskılı plastik parçalar Tespitleme inşa edilir. Bir silikon sonda mikro sürücüde takılı, temizlenir ve boya ile kaplı. İlk ameliyat şapka bir fare kafatasında düzeltmek için gerçekleştirilir. Küçük simge fabrikasyon ve bir koşu bandı kemeri bağlı. Fare kafa-sabit çalıştırmak için eğitim koşu bandı üzerinde. İkinci bir ameliyat hangi geniş bant Elektrofizyolojik sinyalleri kaydedilir takip Hipokampus, silikon soruşturma implantı yapılır. Son olarak, silikon sonda yeniden elde etmek ve yeniden kullanılmak üzere temizledim. Koşu bandı yer hücre etkinliğini analiz yer alan mekanizmaları, yaklaşım yararı özetleyen bir çeşitlilik ortaya koymaktadır.

Giriş

Silikon sondalar gerçeğini onlar doku hasarı ve onlar mevcut yoğun dolu siteler1kayıt hassas bir düzeni en aza indirerek keskin profilleri ile tasarlanmıştır dahil olmak üzere Elektrofizyolojik kayıtlar için çeşitli avantajları sunmak, 2,3,4. Onlar farklı türler, insanlar3,5,6, farklı yaklaşımlar1,7ile de dahil olmak üzere çeşitli sistemleri incelemek için kullanılır. Henüz, tekrarlayan kullanımları bunların maliyet, kırılganlık ve kronik deneyleri için uygun yöntemleri8eksik olan gerçek yüzünden hala nispeten sınırlıdır. 3D baskı teknolojisinde son gelişmeler mikro-sürücüleri ve bu hassas elektrotlar daha kolay bir kullanımı sağlamak için baş-tabak gibi cihazların özel tasarımı mümkün kılmıştır. Bir ilk adım olarak, biz inşa ve kronik silikon sondalar14implantasyon için geliştirdiğimiz araçlar kümesi kullanmak nasıl anlatacağım.

Yer hücreleri genellikle serbestçe hareket hayvan labirentler içinde çalışan kullanarak incelendiği iken, son zamanlarda onlar da sanal ortamlar15 ve koşu bandı apparatii9 (şekil 1A) araştırıldı. Bu deneysel yöntemler hayvanlar baş-, 2 fotonlu mikroskop15, yama-kelepçe16ve optrode9,10,11 kullanımını ölçülü olduğunu avantaj sunuyor teknikleri daha kolay, hayvan davranışları ve çevre ipuçları12gelişmiş denetimi sağlayan ek olarak. İkinci adımda, fareler eğitim ve bir koşu bandı cihaz yer hücre etkinliği kaydetmek için yordamlar sunacak.

Protokol

tüm yöntemleri açıklanan hayvan bakım ve Kore Enstitüsü bilim ve teknoloji kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış olan.

1. mikro-sürücü ve elektrodu hazırlanması

  1. mikro sürücü montaj.
    1. Mikro sürücü (kaymak, beden ve kabuk) bölümlerini yazdırmak bir yüksek çözünürlüklü 3D printerlere harcama maddeler kullanarak 14. Parçalar hiçbir kusurları olduğundan emin olun.
    2. Kaydırıcıyı mikro-sürücü vücuda bir vida (boyut 000-120 x 1/4) ile düzeltmek.
    3. Bir somun lehim (000-120 000 120/64 onaltılık boyut) vida ucu üzerine.
    4. Vida kaydırıcıyı yukarı veya aşağı taşımak için saatin tersi yönde taşımak için saat yönünde döndür.
    5. Kabuk vücut için bir vida (boyut 000-120 x 1/4) ile düzeltmek.
  2. Sonda üzerinde mikro sürücü montaj.
    1. Binoküler mikroskop altında yatay bir konumda mikro tahrik düzeltmek.
    2. Bir düz timsah klip dikkatle Forseps ile sevk irsaliyesi muhafaza sonda ayırma sırasında silikon sonda flex kablosu kapmak için kauçuk doldurma ile kullanın. Bir manipülatör timsah klibine düzeltmek.
    3. Manipülatör kullanarak lay mikro-sürücü kaydırıcıyı silikon sonda paralel hareket yönü için.
    4. Geçerli bir damla diş çimento (oda sıcaklığında kür akrilik diş tamir malzemesi) kaydırıcıyı için prob düzeltmek için. Bu kaymıştır sonda pozisyon düzelt. Tutkal gibi çok hızlı tedavileri ve elektrot konumunu yeniden düzenlemek zordur tavsiye etmiyoruz.
    5. Sonda C-sahibi (bağlayıcı sahibi) için bağlayıcı diş çimento ile düzeltmek.
  3. Temizleme ve boya sondası koyarak.
    1. Düzeltme Microdrive/sonda montaj prob Temizleme cihaz üzerinde. Cihazın küçük köpük sünger (non-steril temizleme bezi) dönen 2 ile donatılmıştır. Tarafından manipülatör boşluğu ayarlamak.
    2. Deterjan ile süngerler emmek.
    3. Yavaş yavaş yukarı ve aşağı yumuşak bir dokunuş sağlayan süngerler arasında sonda taşımak. Mikroskop altında temizlik işlemi izlemek.
    4. Soruşturma distile su ile yıkayın. Alkol soruşturma sterilizasyon için daldırma.
    5. Bir köpük bez kullanarak Uygula Dil (lipofilik floresan boya) prob, shanks arkası. Bu bir sonraki aşamada beyin yerlerde şaftlı görselleştirme sağlayacaktır.
  4. Şapka montaj
    1. hat (baş-plaka, bağlayıcı tutucu ve cap) bölümlerini 3D yazıcı kullanarak 14. 3 parça mühürlü bir muhafaza oluşturmak üzere birbirine.
    2. Ekle (boyut M2 ve 00-90 00 90/4) fındık kafa-plaka ve tutkal ve diş çimento ile saptamak yuvalarında.
    3. Bir çamaşır makinesi kap yuvaya takýn ve tamir ile diş çimento.

2. Ameliyat için kafatası üzerinde şapka tespit

ameliyat için kullanılan tüm araçları önceden tarafından ısıyla sterilize. Kuru sıcak boncuk aygıtı kullanılan reaksiyonunu kontamine ve ameliyat sırasında sterilize edilecek gereken araçları sterilize.

  1. %4 için anestezi inisiyasyon isoflurane düzeyini ayarlayın. 5 dakika süreyle anestezi odasında fare koymak
  2. Fare stereotaksik bir cihaz yüklemek.
  3. % 1.5-2'ye isoflurane düzeyini azaltmak. Hayvan durumuna, solunum hızı, göre ameliyat sırasında seviyesini ayarlamak ve vücut sıcaklığı 20.
  4. Göze göz merhem uygulamak.
  5. Kafa derisi tıraş ve antiseptik (iodopovidone) ile hayvanın kafasını temizleyin. Cerrahi tüm adımları sırasında aseptik koşullar korumak.
  6. Kafa derisi altında enjekte bupivacaine (1 mg/kg). Kesme ve kenarlarından kafatasına ortaya çıkarmak için iyi makas kullanırken fare kafa parietal deri parçası kaldırmak. Serum ve kan durdurucu sargı süngerle temizlemek ve ameliyat sırasında kanamayı kontrol için kullanın.
  7. Bir kazıyıcı aracını kullanarak kapaklarini kaldırmak.
  8. Kafatası 21 tarihinde referans noktaları bulmak: bregma, lambda, koronal ve sagittal dikiş. Baş ayarlamak ' s açı sagittal ekseni boyunca Bregma ve lambda noktaları aynı yükseklikte vardır öyle ki.
  9. İki (~0.5 mm çap) başvuru ve zemin elektrotlar için kafatasındaki delik. Delikleri yaklaşık 1 mm Kaudal ve Lambda 1 mm lateral olmalıdır.
  10. Zemin ve referans elektrotlar (boyutu 000-120 000 120/16 minyatür paslanmaz çelik vidaları tel birleştiğinde-pim konektörleri için) ekleyin.
  11. Uygula ultraviyole (UV) ışık dentin aktivatör kafatası üzerinde bağ ve UV ışığı 45-60 s. için uygulayın
  12. Kafatası kenarlarında diş çimento bir tabaka uygulayın. Çimento cilt ve saç farelerin üzerinde yayılmasını önlemek.
  13. Stereotaksik manipülatör kafa plakasına düzeltmek ve kafatası üzerinde konumlandırın. Yavaş yavaş kafatası hafifçe dokunana dek kafa-plaka indirin ve kafatası ile kavşağında diş çimento uygulayın. Diş çimento tedavi 15 dakika süreyle izin
  14. Anestezi kaldırın. Fix bir bağlayıcı sahibi ve baş plaka bir kap. Ketaprofen alt kutanöz bir enjeksiyon verdikten sonra onun kafes içinde fare koymak 5 mg/kg
  15. Vermek ketaprofen alt Kutanöz enjeksiyonlari 5 mg/kg iki sonraki gün ve dikkatli bir şekilde acı bir iz için monitör için. Fareler genellikle anestezi 20-40 dakika içinde uyanmayı. Şapka implant nispeten olduğunu ışık (3,34 g), öyle ki fareler var onların başını kaldır, labirentler içinde koşmak ve tırmanmak için hiçbir sorun ev onların kafes kenarlarında.

3. Davranışsal eğitim

  1. sonra bir ameliyat sonrası iyileşme döneminde 7 gün, günde 1 mL su kısıtlama başlatın.
    2. Koşu bandı kemer yapmak
  2. kadife kumaş (1-2 m 5 cm) bir parça kesti ve küçük nesneleri üzerinde sıcak tutkal kullanarak bunu düzeltin. Fareyi hareket ile karışmaması amacıyla kemer kenarları dikilen nesneleri.
  3. Birlikte iki ucu dikiş tarafından koşu bandı tekerlek üzerinde kemer düzeltmek.
  4. Ekleyerek ve iki vidayı baş plaka baş-fiksasyon plaka yuvalarına sıkma baş-koşu bandı içinde sabit fare yükleyin.
  5. Kafa ölçülü su ödül için koşu bandı üzerinde çalıştırmak için fareyi eğitim Başlat. Su ödül yalamak bağlantı noktası üzerinden teslim. Başlangıçta, günde 3 kez 10 dk bir süre için koşu bandı üzerinde fare koymak.
  6. Fare kafa fiksasyon için kullanılan alır ve (genellikle ~ 3 gün sonra), kemer taşımak başlar artırmak eğitim oturumu süresi 30 dk. 2-3 hafta sonra bazı fareler 100'den fazla deneme 30 dk (kemer tam bir dönüşü olmak bir deneme sürümü) çalıştırmak.
  7. Kayıt deneyler için en iyi davranış performansları gösterilen fareler seçin.

4. Silikon sonda implantasyonu

  1. anestezi altında fare koymak.
  2. Fare kafa-plaka düzelterek stereotaksik aparatı yükleyin. Serum fizyolojik ile kafatası yüzeyi temizleyin.
  3. Bulmak stereotaksik işaretleri: bregma, lambda, koronal ve sagittal dikiş. Ekleme noktasına mesafeyi ölçmek ve onu işaretle
    4. İnce ve saydam hale gelene kadar
  4. kemik dikkatle matkap. Nemlendirin ve delme sırasında serum temiz.
  5. Dikkatli bir şekilde inceltilmiş kemik ve hassas güç kullanarak Dura sorun çıkarınPS. serum sürekli ıslak beyin yüzey tutun.
  6. Microdrive/silikon sonda montaj stereotaksik manipülatör için düzelt. Silikon sonda kranyotomi üzerinde de getir. Kafa-plaka silikon sonda bağlayıcı sahibine vida.
  7. Kayıt amplifikatör ve zemin/referans elektrotlar bağlayın. Kalkan elektromanyetik gürültü korumak için alüminyum folyo ile fare. Beyin elektriksel aktivitesinin izlemek için kayıt sistemi başlatmak.
  8. Yavaş yavaş micromanipulator kullanarak beynine silikon sonda yerleştirin. Sürekli elektrik sinyallerini, seyahat manipülatör mesafe ve sonda shanks kontrol (onlar beyin delici emin olun). Beyaz madde altında nispeten sessiz olmakla birlikte birim faaliyet korteks içinde görünür. Hipokampüs piramit tabakası shanks dokunduğumda birim faaliyet tekrar görünür. Bu noktadan sonra silikon sonda 200 µm geri çekmek (mikro sürücü ertesi gün bıçağı geri piramit tabaka haline getirmek için kullanabilirsiniz).
  9. Beyin yüzeyinde kemik balmumu ve mineral yağ karışımı ile kapak.
  10. Diş çimento kullanarak kafa plakasına mikro sürücü düzeltmek. Diş çimento tedavi 15 dakika izin ver. O zaman stereotaksik manipülatör mikro sürücüden bağlantısını kesin ve şapka ilham toplamak.
  11. Fareyi onun kafese koyun ve ketaprofen alt kutanöz bir iğne yapın 5 mg/kg. Acı bir iz için kontrol edin. Bu ameliyatı ilk olandan daha az invaziv ve 45 dakika içinde onlar uyanmak-yukarıya anesteziden sonra fareler genellikle etkindir. Ancak, silikon sonda beyinde stabilize etmek ihtiyacı olduğu bir gün kurtarmak fare izin.

5. Kayıt

  1. yüklemek fare kafa-sabit koşu bandı üzerinde. Şapka başIıkIı kaldırmak
  2. Kayıt amplifikatör bağlamak ve Kayýt iþlemini baþlatmak.
  3. İlk gününde, mikro sürücü silikon sonda hipokampüs piramit katmanına taşımak için kullanın. Vida yönünün her dönüş daha derin shanks 200 µm taşır. Yavaş yavaş şaftlı konumunu ayarlamak (~ 20-50 µm teker) dalgalanma salınımlarını 13 ve birim faaliyet görününceye.
  4. Sonraki günlerde, şaft konum ayarlamak ve ~ 1 h fare üzerinde kemer çalışırken Hipokampal etkinlik kaydetmeden önce bekleyin. Birkaç gün için iyi kayıt sinyal kalitesini korumak için sabit nesneleri kaldırmak ve fare tavan düşük ' şapka sert yüzeyler çarpma olasılığını en aza indirmek için s kafesi.

6. Sonda kurtarma

  1. anestezi altında fare koymak.
  2. Fare kafa-plaka düzelterek stereotaksik aparatı yükleyin. Şapka başIıkIı kaldırmak
  3. Hemen üzerinde mikro sürücü stereotaksik manipülatör getir. Mikro-sürücü manipülatör düzeltmek. Kafa-plaka bağlayıcı sahibinden sökün. Kabuk ve mikro sürücünün gövdesini birbirine bağlayan vidayı çıkarın.
  4. Binoküler mikroskop gözetiminde, yavaş yavaş mikro-sürücü/silikon sonda montaj stereotaksik manipülatör ile Yüksel kabuk bölümü geride bırakarak.
  5. Silikon sonda ile temizleme cihazı temizlemek.

Sonuçlar

Bir fare ilk bir iki metre uzun kemer yardımlar (şekil 1 c) yoksun çalıştırmak için eğitildim. Elektrot implantasyonu, aynı uzunlukta yeni bir kemer takip ama 3 çift-in ipuçları sunan koşu bandı üzerinde allocentric kayma temsilcilikleri12,14oluşturmak için kuruldu. Geniş bant sinyalleri 250-kanal kayıt sistemi (amplifikatör kurulu USB arabirim kartını ve ısmarlama LabVIEW aray?...

Tartışmalar

Nöronal aktivite kronik kayıt Hipokampal yer alanları gibi sinirsel süreçleri anlamak için önemlidir. Kronik silikon sonda implantantation gerçekleştirmek için bizim yaklaşım kendisini ayıran diğer yöntemleri7,18,19,20 aslında bu elektrot paket at kurtarmak nispeten basit tarafından denemenin sonu. Yer hücreleri genellikle serbestçe hareket eden içinde incelendiği süre ko?...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser Kore Enstitüsü bilim ve Teknoloji Kurumsal programı (Proje No 2E26190 ve 2E26170) ve insan sınır bilim programı (RGY0089/2012) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Silicon ProbeNeuronexusBuzsabi32Recording electrode
Recording systemIntantechRHD2132/RHD2000
3D printerAsigaPico Plus 27High resolution printer for micro-drive
3D printerStratasysMojoLower resolution printer for hat components
Stereotaxic apparatusKopfModel 963
Binocular microscopeLeicaM60
Treadmill apparatusWe build them

Referanslar

  1. Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
  2. Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
  3. Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
  4. Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
  5. Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
  6. Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180 (2016).
  7. Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
  8. Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
  9. Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  12. Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531 (2017).
  13. Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
  14. Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
  15. Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
  16. Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
  17. Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
  18. Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
  19. Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
  20. Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
  21. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  22. Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
  23. Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
  24. Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
  25. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
  26. Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesorunu 128silikon sondayer h creleriHipokampusko u bandkronik kaydyerel alan potansiyelifare

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır