مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Summary

في هذا البروتوكول، نحن تصف التقنيات لتشريح سليم من نبات الزهور وسيليكويس، بعض تقنيات مسح الأساسية، وتحديد تلطيخ إجراءات الملاحظات جبل كل الهياكل الإنجابية.

Abstract

سبب أدواته الهائلة للدراسات الوراثية الجزيئية، أعطيت التمويل واحدة من أبرز الأنواع النموذجية في علم الأحياء النباتية، وخاصة في مصنع بيولوجيا التناسل. إلا أن المصنع مورفولوجية، تشريحية، وتحليلات ultrastructural تقليديا تنطوي التضمين مضيعة للوقت وتمزيقها الإجراءات الميدانية مشرق والمسح الضوئي والميكروسكوب الإلكتروني. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الأسفار [كنفوكل] مجهرية وتحليلات مجهرية الدولة من الفن ثلاثي الأبعاد للحاسوب والتحسين المتواصل للتقنيات الجزيئية لاستخدامها على الحد الأدنى من المعالجة جبل كل العينات، قد أدى إلى زيادة طلب على تطوير تقنيات معالجة عينة تتسم بالكفاءة والحد الأدنى. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنيات بشكل صحيح تشريح نبات الزهور وسيليكويس، الأساسية تبادل التقنيات، وبعض إجراءات المصبوغة للجامعة-جبل الملاحظات لهياكل الإنجابية.

Introduction

الزهور هي من بين أهم تعريف الأجهزة من كاسيات البذور. النباتات المزهرة ظهرت قبل حوالي 90 مليون سنة¹، وتنوعاً بسرعة أن مظهرها السريع وصفت بأنها "لغزا بغيضة" تشارلز داروين². وتتنوع مصالح الباحثين المصنع في تنمية الزهور. بعض البحوث قد ركزت على فهم أصل تطوري الزهرة ككل، أو تطور الخصائص التشريحية وهيكلية ووظيفية محددة من الزهور^3،،من^45،6 . التباين العالي في شكل الأزهار والهيكل، فضلا عن طرق التكاثر الجنسي والتكاثر اللاجنسي الاعتماد عليها، جعل الزهرة بنية معقدة للغاية. وقد أدى هذا إلى جهود متنوعة لوصف السمات الهيكلية والتشريح أجهزة الأزهار، واستخدام تقنيات تقنيين الإلكترون والضوء التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات الجينية والجزيئية⁷. وعلاوة على ذلك، كمصدر للفواكه والبذور والزهور من الأهمية بالنسبة للتغذية البشرية والحيوانية. ولذلك، وصف وضع الزهور والفواكه آثار العديد من البحوث التطبيقية، بما في ذلك الأمن الغذائي سكان بشرية المتزايدة واستراتيجيات الحفاظ على البيئة في إطار بيئة متغيرة^{8 , 9 , 10}.

التنمية الزهرة في نبات يبدأ التعريفي زهرة وتحويل أرض الخضري إلى أرض نورات (مجموعة من الزهور). وتبدأ بريمورديا زهرة جانبياً في الجناح من أرض نورات¹¹. بريمورديا جهاز الأزهار تشكل تدريجيا في جدلات متحدة المركز من الخارج إلى مركز الزهرة، وتتحول في نهاية المطاف إلى كاسية، تلات، والاسدية، وكاربيلس⁷. هذه الأجهزة الأزهار تحقيق الحماية التغذوية، متميزة، والوظيفية (مثلاً، جذب الملقحات) أدوار في الأنواع النباتية المختلفة، مع الأعضاء الجنسية استدامة تنمية جاميتوفيتيس الذكور والإناث، على التوالي^{12 , 13}. جاميتوفيتيس، بدوره، تميز كل زوج من الذكور (الحيوانات المنوية) والإناث الجاميطات (البويضة والخلية المركزية)، التي توحد عند ضعف الإخصاب لتشكيل الجيل القادم واقحه والسويداء الأولية، دعم الأنسجة الطرفية التنمية الجنين^14،15. تطوير الفواكه والبذور دعم نمو ونضج، والمحافظة على الجنين، وفي نهاية المطاف، التشتت. وقد أجريت بحوث مستفيضة لتوصيف وضع الزهور والجنين في الأنواع النباتية المتنوعة، لا سيما في الأنواع النموذجية التي أعطيت^7،،من¹⁶¹⁷.

استندت تحليلات مجهرية المبكر للتنمية زهرة تجهيز العينة مضيعة للوقت ومراقبة تقنيات مثل البارافين أو الراتنج التضمين وتمزيقها، جنبا إلى جنب مع الضوء أو المجهر الإلكتروني. وكثيراً ما استخدمت هذه التقنيات المجهرية التقليدية في تركيبة مع التحقيقات الجينية الجزيئية، مثل تحليلات تقنيين من طفرات، وإضفاء الطابع المحلي على الجيش الملكي النيبالي بالتهجين في الموقع ، أو المناعية-الكشف عن البروتينات. وادي التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص المجهري الأسفار واسع المجال و [كنفوكل]، في تحليلات للدولة من أحدث صورة الحاسوب ثلاثي الأبعاد، والتحسين المتواصل للأساليب الجزيئية التي يمكن استخدامها في معالجة الحد الأدنى الجامع-جبل العينات، بحاجة إلى نموذج الكفاءة والحد الأدنى من تقنيات المعالجة قابلة تفضيلي للتحليلات الكمية. في السنوات الأخيرة، أحرز تقدم كبير في تطوير تقنيات مسح على عينة حيوانية الجامعة-جبل. أنها تجعل العينة شفافة أما باستخدام الكواشف المستندة اليوريا أو السكر مائي (مثلاً، مقياس، سيدب، مكعب)^18،،من¹⁹²⁰، أو بشكل انتقائي إزالة الدهون (باستخدام مواد التنظيف الحزب الديمقراطي الصربي) بعد تضمين عينات في الهلاميات المائية مستقرة؛ إزالة الدهون يمكن تحقيقه أما عن طريق نشر السلبي (مثلاً، تعديل الوضوح البروتوكول²¹،²²من الميثاق-بارس-دواليب) أو بنشاط بالتفريد (الأصلي الوضوح البروتوكول²³ و²⁴من قانون-المعزوفة). وبتشجيع من هذا التقدم السريع، ظهرت بعض التقنيات المشتقة أيضا للاستخدام في المصانع.

في هذه الورقة أساليب تركز على نموذج نبات، يصف لنا إجراء تشريح سليم براعم الزهور، والزهور، وسيليكويس الشباب، وتطهير الجامعة-جبل عينات لتلطيخ المتنوعة وإجراءات المراقبة باستخدام الكلاسيكية أو أسلوب تطهير القائم على الحزب الديمقراطي الصربي مؤخرا. وترد أمثلة للنشا، كلوس، وتلطيخ الكروماتين. على الرغم من أن قد تحتاج هذه الإجراءات إلى مزيد من التحسينات والتعديلات المدخلة عند استخدامها مع الأنواع الأخرى، ونأمل أنهم سوف يمهد لإجراء المزيد من البحوث حول هذه الأساليب بسيطة ولكن الهامة التي هي نقطة انطلاق للعديد من مشاريع البحوث.

Protocol

1-زهرة وتثبيت خردلة

1. سيليكويس من النباتات والزهور الحصاد متزامنة في افتتاح أول زهرة.
   ملاحظة: في ظل الظروف التجريبية المستخدمة هنا، تبدأ النباتات المزهرة حوالي 21 يوما بعد زرع ألواح Murashige سكوغ (مللي ثانية) إلى التربة. بذور هي طبقات لمدة 3 – 4 أيام في 4 درجات مئوية ونامي/نمت على ألواح مرض التصلب العصبي المتعدد في ضوء 22 درجة مئوية/16 ح و 18 درجة مئوية/8 ح الظلام لمدة 8 إلى 10 أيام قبل زراعة الشتلات في التربة الغنية بالمغذيات في الأواني يحتفظ بنفس الشروط (الشكل 1). عدد replicates يعتمد على إجراء بحوث محددة الهدف، ولكن ينصح بالحد ني إينفلوريسسينسيس 5 (من 5 محطات فردية) لكل معاملة. إذا كانت الزهور هي وحدة تجريبية، يوصي بالحد ني زهور 10 كل تكرار.
2. قطع إينفلوريسسينسيس أو الزهور (الشكل 1E-ح) باستخدام مقص صغير (مثلاً، مقص الأظافر) ووضعها مباشرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي (لتثبيت نورات/زهرة واحدة) أو أنبوب مخروطي (لتثبيتات الجماعية) تتضمن حديثا أدلى في كارني، وحمض الخليك/الميثانول، أو نسيجية FPA50 (اعتماداً على التطبيق، انظر أدناه) على الجليد.
   ملاحظة: العينات ينبغي أن يكون تماما غارقة في مثبت.
3. ترك الأنسجة داخل مثبت على 4 (ح) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تسلل فراغ يمكن أن تستخدم لتسريع اختراق مثبت الأنسجة، ولكن هذا قد يكون ضاراً للحفاظ على بنية الأنسجة. المؤلفين لا تنفذ تسلل الفراغ.
4. إزالة مثبت وإضافة الإيثانول 70% ما يكفي لتغطية العينات، وإعادتها إلى 4 درجات مئوية على الأقل 24 ساعة؛ عينات البقاء إلى أجل غير مسمى في هذا الحل. بعد إزالة الإيثانول، الشروع فورا في الخطوة التالية؛ أما التشريح، أو إزالة مخزونات النشر الاستراتيجي.

2-التشريح تحت ستيريوميكروسكوبي

1. وضع طازجة الإيثانول 70% في الزجاج صانع يشاهد توضع على طبق بيتري صغيرة للدعم.
2. نورات/الزهرة/خردلة في هذا المكان طازجة مثبت وتشريح تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط وحقنه بإبرة.
   1. استخدام الزجاج صانع يشاهد أو الأجهزة المماثلة التي تسمح العينات لتكون مغطاة تماما مع الإيثانول (مستحسن) التشريح إينفلوريسسينسيس، وتمزق الأجهزة الزهور للزهور الناضجة (كاسية تلات ويمكن السداة تكون تشريح في هذه المرحلة ) لتجنب خطر جفاف العينات.
3. تشريح سيليكويس وبراعم الزهور الصغيرة على شريحة كما هو موضح أدناه.
   1. جانبا زجاج لصانع يشاهد مع العينات المجهزة مسبقاً، واستخدام شريحة عادية للتشريح النهائي.
   2. نقل عينة الفائدة للشريحة وإضافة 10 ميليلتر من جديد 70% إيثانول. العمل بسرعة على التشريح النهائي وإضافة 10 ميليلتر من الإيثانول، إذا لزم الأمر، للحفاظ على العينة رطبة دون السائل المفرط.
   3. للحصول على الإفراج عن حبوب اللقاح من الأسدية، راجع الخطوة 5، 1. لتشريح carpels والبويضات، اتبع الإجراء الموضح في الشكل 2. ينطبق هذا الإجراء على جميع مراحل تنمية الكربلة، بما في ذلك مرحلة تنمية سيليكويس الأخضر.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة الإيثانول إذا لم يكن هناك كافية الإيثانول المرحل من نقل العينات؛ تشريح عينات صغيرة جداً أسهل بكثير في كمية صغيرة من السائل. تبقى فقط الأجهزة للفائدة (كاسية أو تلات، الأسدية، كاربيلس، والبويضات، بذور أو حبوب اللقاح) دائماً على الشريحة. وسيكفل هذا الإجراء سماكة موحدة بين الشرائح وساترة، المقابلة لسمك الجهاز قيد الدراسة، مما أدى إلى تجانس أعلى، وهكذا الكفاءة للفحص المجهري (عدد أكبر من العينات المستهدفة في نفس المستوى البؤري).
4. استخدام قطعة صغيرة من ورق نشاف لامتصاص وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. بسرعة المضي قدما إلى الخطوة التالية (القسم 3 أو 4 أو 6) قبل يجفف عينة بها.

3-كلورال هيدرات على أساس المقاصة وتلطيخ المقاصة المجمعة

ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج للمقاصة على أساس كلورال هيدرات مع FPA50 الثابتة المادية.

1. 20 مكان ميليلتر لمسح الحل (كلورال هيدرات/والغليسيرول، تعديل المتوسط في هوير أو 4 في هير ايكي-4 الحلول هير) على الشريحة الحاملة للعينة. استخدام زوج من الحقن بالإبر، وقالت بوضع العينات عند الاقتضاء عن طريق تقليل المسافة بينها، وعكس تلك التي تواجه فيها الجهاز للفائدة إلى الأسفل. قم بإزالة أي فقاعة هواء المتبقية باستخدام الإبرة.
2. انخفاض ساترة جانبية بلطف وضعه، الضغط بلطف جداً، والانتظار حتى الحل المقاصة يملأ المساحة بين. إضافة حل إزالة الحد الأدنى، إذا لزم الأمر، لملء المساحة الكاملة تحت ساترة.
3. ضع الشريحة على حامل شرائح واتركه تحت غطاء الدخان. متابعة الملاحظات المجهرية بعد على الأقل 4 ح وخلال 4-5 أيام التالية.

4-الجمع بين ألكسندر تلطيخ وتطهير هير في 4 أنثيرس

ملاحظة: يستند الأصلي للبروتوكول ألكسندر الإفراج عن حبوب اللقاح على الشريحة قبل التلوين. كفاءة وأكثر إفادة، تعديل ألكسندر تلطيخ والتخليص الداخلي هو تلطيخ من حبوب اللقاح الناضجة داخل anthers ناضجة ولكن غير ديهيسسينت.

1. اختر براعم الزهور الطازجة المحصودة التي على وشك فتح مع أنثيرس غير ديهيسسينت.
   ملاحظة: لا تأخذ الشابة زهرة براعم لأن ألكسندر تلطيخ المقصود لحبوب اللقاح الناضجة وعدم كفاءة وصمة حبوب اللقاح غير ناضجة. ويوصي بحد أدنى زهور 5 كل معاملة حصادها من نباتات مختلفة وإينفلوريسسينسيس.
2. إعداد لوحة 96-جيدا مع حل ألكسندر كافية لغمر برعم زهرة. كشف أنثيرس عن طريق إزالة كاسية وتلات وتزج بها في حل ألكسندر. تبقى العينات تحت غطاء الدخان ح 1 – 3.
3. استبدال الحل ألكسندر مع الحل هير في 4 ومكان لوحة متعددة جيدا مرة أخرى تحت غطاء الدخان لحضانة بين عشية وضحاها.
4. استخدام الملقط، تحرك بلطف تطهير براعم الزهور إلى شريحة جديدة. منذ قد تحدث بعض المرحل من حل ألكسندر، استخدام ورقة نشاف لإزالة الحل المقاصة قدر الإمكان.
5. تشريح والاسدية، وإزالة جميع الأنسجة الأخرى. اتبع الخطوات الموجودة في القسم 3 استخدام هير للحل 4.

5-إزالة اكسين من حبوب اللقاح

ملاحظة: نوصي باستخدام مثبت في كارني لتلطيخ DAPI.

1. اتبع إجراءات التثبيت وتشريح المبينة في القسمين 1 و 2. الآن، واحدة يجب أن يكون واحد للعديد من الأسدية على الشريحة ضمن الحد أدنى من الإيثانول 70%.
2. استخدام ورقة نشاف لإزالة الزائدة الإيثانول، وإضافة 5-10 ميليلتر لحل DAPI. باستخدام اثنين من الحقن بالإبر، الإفراج عن حبوب اللقاح داخل ذلك كمية صغيرة من الحل (مثلاً، استخدام حقنه واحدة شل في السداة وأخرى للإفراج عن حبوب اللقاح). إضافة آخر ميليلتر 5 من DAPI إذا كان الحل الذي يجف.
3. إزالة جميع الأنقاض من السداة خطوة حاسمة، مثل أن تترك بين الشريحة وساترة حبوب اللقاح فقط.
4. ضع ساترة على الشريحة الحاملة للعينة بتخفيض من جانبية وإضافة الحد الأدنى من حل DAPI المطلوبة لملء الفراغ. مكان سبابة على ساترة، ودون السحق أيضا الكثير مما جعل سريعة، وطيد، وانزلاق حركة قصيرة.
   ملاحظة: لقياس القوة اللازمة، والسعة لحركة انزلاق، هذه الخطوة ينبغي أن يمارس عدة مرات، التحقق من النتائج في كل مرة تحت المجهر.
5. إضافة حل DAPI إذا لزم الأمر وتحسين مكان الشريحة في مربع رطبة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى حاء 1 المضي قدما لمراقبة العينات تحت الأسفار واسع المجال أو مجهرية [كنفوكل] داخل 24 حاء في محاولة للجمع بين هذا الإجراء مع المقاصة للتحقق ما إذا كانت زيادة مخزونات النشر الاستراتيجي ويمكن الحصول على الإدلاء بالبيانات.

6-الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) مسح

ملاحظة: اعتماداً على جهاز الأزهار يتم تحليلها، وعلى مهارات الباحث تشريح العينات لينة جداً وصغيرة، معاملة مخزونات النشر الاستراتيجي يمكن القيام أما قبل (للباحثين ذوي الخبرة) أو بعد التشريح خطوة (لأقل من ذوي الخبرة الباحثين) في حمض الخليك الميثانول الثابتة المادية.

1. استخدام الزجاج صانع مشاهدة شريحة مقعرة أو أنبوب ميكروسينتريفوجي لاحتضان تشريح أو غير تشريح عينات في مخزونات النشر الاستراتيجي 1% وحل ن هيدروكسيد الصوديوم 0.2 بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
2. التعامل مع الرعاية لأن العينة لينة جداً وله مظهر شفافة. يشطف عدة مرات بالماء.
   ملاحظة: قد تؤدي مخلفات حل الحزب الديمقراطي الصربي لهطول الأمطار عند إضافة حل المصبوغة، مثلاً، انيلين الأزرق.
3. لعينات غير تشريح، اتبع الإجراء التشريح هو موضح في القسم 2، باستخدام المياه بدلاً من الإيثانول 70%. بعد تشريح الأنسجة المرجوة، لإزالة أي بقايا والحطام، وأي فائض المياه مع ورقة نشاف، ثم إضافة 20 – 40 ميليلتر من حل المصبوغة، والمضي في الخطوة 6، 5.
4. لعينات تشريح، بعناية نقل العينة من الحل الغسيل ووضعه على شريحة نظيفة، وإضافة 20 – 40 ميليلتر من حل المصبوغة.
5. بلطف ضع ساترة على الشريحة عن طريق خفض من جانبية. الحرص على عدم الاسكواش الإعداد. مكان أي رقيقة فاصل بين الشريحة وساترة في أركانه (مثلاً، الشريط أو ساترة مكسورة)، إذا كانت الأنسجة الناعمة جداً، ترك مساحة مثل الدائرة بين الشرائح وساترة، مثل أن لا سحق ساترة العينة.
6. ضع كافة الشرائح داخل مربع رطبة وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، ووضعه في 4 درجات مئوية على الأقل 1 حاء المضي قدما لمراقبة العينة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهرية [كنفوكل] داخل ح 24.

النتائج

نبات ينتمي إلى أسرة براسيكاسيا، إذ تضع inflorescences مع المخنثين الزهور مرتبة في كوريمب (الشكل 1). وقد كل زهرة كاسية أربعة وتلات أربع وست الأسدية (أربعة منذ فترة طويلة وقصيرة اثنين) ومن متاع سينكاربوس تتكون من اثنين carpels تنصهر خلقية (الشكل 1-واو

Discussion

وجود العديد من براعم الزهور داخل نورات واحدة من نبات، التي تغطي جميع مراحل نمو الزهرة، يوفر فرصة فريدة من نوعها لدراسات تهدف إلى وصف تأثير علاج أو ميزة الإنمائية في الوقت نفسه عبر مراحل مختلفة من التنمية زهرة. نقطة مرجعية جيدة بين مختلف النباتات الفردية هو افتتاح أول زهرة نورات الرئي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.