全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

要約

このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と siliques、いくつかの基本的な清算のテクニックの適切な解剖のためのテクニックの説明し、生殖構造の観察を全取り付ける染色を選択しました。

要約

分子遺伝学的研究の素晴らしいツールによるシロイヌナズナは植物生物学で、特に、植物生殖生物学の最も著名なモデル種の一つです。ただし、植物形態学的、解剖学的、および微細構造分析時間のかかる埋め込み、明視野、スキャン、および電子顕微鏡のための手続の区分を含む伝統的。最低限の処理のホール マウント標本に使用される分子技術の継続的な改良、新式の 3次元計算機援用微視的解析、共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の需要の増加につながっています。効率的かつ最小限のサンプル処理技術を開発します。このプロトコルでは正しく解剖シロイヌナズナの花や siliques、基本的な技術をクリアするための手法について述べるとのいくつかの汚損プロシージャ全体マウント生殖構造の観察。

概要

花は最も重要な被子植物の器官を定義しています。顕花植物登場いくつかの 9000 万年前¹、急速な外見だったチャールズ ・ ダーウィン²「忌まわしい謎」として記載されて、非常に高速の多様化。花の開発の植物研究者の関心は多様であります。いくつかの研究は、全体または花^{3,4,5,6 の特定の解剖学的、構造的・機能的特性の進化として花の進化的起源を理解することに焦点を当ててください。}.フローラル フォームの構造と、それらに依存する性および無性生殖様式の高い変化は花に非常に複雑な構造を作る。これは遺伝学的および分子調査⁷と組み合わせることができる光と電子顕微鏡技術を使用して花の器官の解剖学と構造機能を特徴付けるため多様な活動につながっています。さらに果実や種子のソースとして、花は人間および動物栄養物のため非常に重要です。したがって、花とフルーツの開発の特性、応用研究、増え人口と変化する環境⁸下で生態系保全戦略のための食料安全保障を含む多くの影響^,9,10。

シロイヌナズナの花の開発には花成誘導と花序 (花のグループ) の分裂組織に植物の分裂組織の変容が始まります。花原基は、花序メリステム¹¹の側面に横方向に開始されます。花の器官原基の花の中心に外から同心円状の渦巻き状に徐々 に形し、がく片、花びら、雄しべ、心皮の⁷に最終的に開発。これらの花器を果たす個別栄養、保護、および機能 (例えば、送粉者魅力) オスとメスの配偶体、それぞれ¹²の発達を支える性的器官との異なる植物の役割^,13配偶体、ターンでは、それぞれを区別する男性 (精子) のペアと雌性の配偶子 (卵と中央のセル) に結合する二重次世代、受精と一次胚乳を形成する受精ターミナル組織支援、。胚^14,15の開発。果実や種子の開発は、成長、成熟および胚と、最終的には、その分散の保全をサポートします。シロイヌナズナ^7,16,17モデル種を中心に、多様な植物の花と胚の開発を特徴付ける広範な研究を行った。

花の開発の初期の顕微鏡分析は時間のかかるサンプル加工、パラフィンまたは樹脂埋め込み断面などの手法は組み合わせて光または電子顕微鏡の観察に基づいていた。これらの伝統的な顕微鏡の技術は蛋白質の免疫検出の in situハイブリダイゼーションによる RNA の局在や突然変異体の顕微鏡分析などの分子遺伝の調査との組み合わせでよく使用されました。最新の 3次元コンピューター支援画像解析と最低限の処理のホール マウント標本で使用できる分子の方法の継続的な改良の広視野および共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の必要性をもたらした優先的に定量分析に適している効率的かつ最小限のサンプル処理技術。近年、全体マウント動物標本のクリアリングの技術の開発の重要な進歩をしました。レンダリング サンプル透明水性尿素または砂糖ベースの試薬 (例えばスケール、SeeDB、立方体) を使用して^18,19、20、または後の脂質 (洗剤 SDS を使用) の選択的除去安定したゲル; に試料を埋め込む脂質の除去をすることができます受動拡散によっていずれかを達成した (例えば、変更明確プロトコル²¹, 協定 PARS リム²²) または電気泳動 (元明確プロトコル²³と法律さきがけ²⁴) によって積極的に。この高速の進歩に励まされて、いくつかの派生技術、プラント用も浮上しています。

シロイヌナズナのモデルに焦点を当てた本のメソッドで花蕾、花、そして若い siliques の適切な郭清と全体マウント多様な染色サンプルのクリアリングの手順と観察の手順について述べる古典的なまたは最近 SDS ベースのクリア方法。澱粉、カロース、クロマチン染色の例のとおりです。ただし、これらの手順は、使用すると他の種の適応の改善とさらに必要があります、彼らは多くの研究プロジェクトの出発点は、これらの単純ですが重要なメソッドのさらなる研究のための段階を設定いただければ幸いです。

プロトコル

1. 花と Silique 固定

1. 収穫の花と植物から siliques 最初の花のオープニングで同期されます。
   注: ここで使用される実験条件下で植物開花を開始土壌培地・培 (MS) 版の移植後約 21 日間。種子は 4 ° C で 3-4 日間の成層、発芽/暮れた 22 ° C/16 h 光と 18 ° C/8 時間で MS プレート上のもとに同じ条件 (図 1) 鍋で栄養豊富な土に苗を移植する前に、8 〜 10 日間。複製の数特定の研究の目的によって異なりますが、各治療のため (5 個体) から 5 花房の最小値をお勧めします。花は実験機である場合 10 花あたりの最小値をお勧めします。
2. 花序または花 (図 1E-H) (例えば爪のはさみ) 小さいはさみを使って切り取り、(単一の花序/花固定) の微量遠心チューブまたは (の集団注視) 円錐管ですぐにそれらを配置新鮮なを含む製カルノワのやメタノール/酢酸 FPA50 定着剤 (アプリケーションによっては、下記参照) 氷の上。
   注: のサンプルは、固定液で完全に水没する必要があります。
3. 4 ° C で一晩に 4 h 用定着剤内の組織を残す
   注: 真空浸透を組織に定着剤の浸透をスピードアップするため使用できますが、これは、組織の構造を維持する有害かもしれない。著者は、真空浸潤を実装しないでください。
4. 定着剤を削除、サンプルをカバーする十分な 70% エタノールを追加し、少なくとも 24 時間; 4 ° C にそれらを返すサンプルは、このソリューションに無期限に滞在できます。エタノールを除去した後すぐに次のステップに進んでください。郭清、または SDS クリア。

2、実体顕微鏡下で解剖

1. 入れて 70% エタノールを支える小さなシャーレ上に配置の時計メーカーのガラスで作られて。
2. 場所この花房/花/silique は、定着剤をたてさせ、鉗子、注射器の針を用いた顕微鏡下で解剖。
   1. 時計メーカーのガラスまたはサンプル (がく片、花弁、雄しべはこの段階で切り裂かれる成熟した花の花器を離れて引き裂く、花序の解剖のためのエタノール (推奨) で完全にカバーすることができる同様のデバイスを使用して、) 乾燥のサンプルのリスクを回避します。
3. 以下の説明に従って siliques およびスライドの小さなつぼみを解剖します。
   1. 処理済みサンプルの時計メーカーのガラスはさておき、最終的な郭清のため通常のスライドを使用します。
   2. スライドに興味のサンプルを移動し、新鮮な 70% エタノールを 10 μ l 添加します。最終的な郭清の迅速作業、サンプルの余分な液体ことがなく潤いを保つには、必要に応じて、エタノールの 10 μ L を追加します。
   3. おしべから花粉を解放する, ステップ 5.1 を参照してください。心皮および胚珠を解剖の図 2で説明されている手順に従います。この手順は、緑の siliques の開発の段階を含む、心皮の開発のすべての段階に適用されます。
      注: は、サンプルの内容を移動から十分なエタノールのキャリー オーバーがある場合、エタノールを追加しないでください。非常に小さいサンプルを解剖は、液体の最小限の量ではるかに簡単です。スライドに関心 (がく片、花びら、雄しべ、心皮、胚珠、種子、または花粉) の器官だけを常に保ちます。この手順はスライドと高い均一性とこうして顕微鏡検査 (対象の標本のより高い数のための効率の結果、審査機関の厚さに対応する coverslip の一様な厚さを確保します。同じ焦点面)。
4. 吸収し、可能な限りできるだけ多くのエタノールを削除するあぶらとり紙の小片を使用します。すぐにうちサンプル乾く前に (セクション 3、4、または 6) の次のステップに進みます。

3. 決済抱水クロラールと組み合わせたクリア染色

注: FPA50 材料を固定抱水クロラール ベース クリアするため最高の結果が得られました。

1. クリア ソリューションの場所 20 μ L (抱水クロラール/グリセリン、変更 Hoyer の中、君の 4 または君の壱岐 4 ソリューション) 標本ベアリング スライドに。必要に応じて、それらの間のスペースを減らすことおよびそれらを反転、標本の位置皮下針と注射器のペアを使用して興味のオルガンが下向き。針を使って残りの空気の泡を削除します。
2. 横の coverslip を下げると優しく非常に優しくを押すと、それを配置し、クリア ソリューションの間の隙間が埋まるまで待ちます。Coverslip の下で全体のスペースを埋めるために、必要な場合は、最小限のクリア ソリューションを追加します。
3. スライド ホルダーにスライドを配置し、ヒューム フードの下でそれを残します。少なくとも 4 時間後、次の 4-5 日間顕微鏡による観察に進みます。

4. 結合染色アレクサンダーと葯の君の 4 クリア

注: 元のアレクサンダー ・ プロトコルは、染色する前にスライドの花粉を解放に基づいています。効率的でより有益な変更アレクサンダー染色し、プロシージャをクリアは成熟しているが非裂開葯内花粉粒の染色します。

1. 非裂開葯を開こうとして新鮮な収穫の花蕾を選択します。
   メモ: は、染色アレクサンダーは成熟した花粉を対象として、未熟花粉を効率的に染色されませんので若い花蕾になりません。別の植物と花序から収穫される治療あたり 5 花の最小値をお勧めします。
2. 花のつぼみが水没する十分なアレキサンダーのソリューションと 96 ウェルのプレートを準備します。萼片と花弁を削除することによって葯を公開し、それらをアレキサンダーの溶液に浸します。1-3 h のヒューム フードの下でサンプルを保ちます。
3. 君の 4 ソリューションとアレキサンダーのソリューションを交換し、一晩インキュベートの発煙のフードの下に戻ってウェル プレートを配置します。
4. 鉗子を使用して、優しくクリアの花のつぼみを新しいスライドを移動します。アレキサンダーのソリューションのいくつかのキャリー オーバーが発生するため、可能な限りクリア ソリューションを削除するのにあぶらとり紙を使用します。
5. 雄しべを解剖し、他のすべての組織を削除します。君の 4 ソリューションを使用して 3 のセクションで手順に従います。

5. 花粉から性物質が外殻を除去

注: DAPI 染色のカルノワの定着剤の使用をお勧めします。

1. セクション 1 と 2 で固定と郭清の手順に従ってください。今では、1 つは、スライド内の 70% のエタノールの最小量の多くの雄蘂、一つをしてください。
2. あぶらとり紙を使用して余分なエタノールを削除、DAPI 溶液の 5-10 μ L を追加します。針と注射器のいくつかを使用して、その少量の溶液 (例えばおしべと花粉を解放する他の固定化使用 1 つの注射器) の内で花粉を解放します。ソリューションが乾く場合は、DAPI の別の 5 μ L を追加します。
3. 花粉粒のみがスライドと、coverslip の間残っていることなど重要なステップは、おしべのすべての残骸を削除します。
4. 片軸受スライドの横にそれを下げることによって観察を配置し、最小限のスペースを埋めるために必要な DAPI ソリューションを追加します。上、人差し指を置きも退治することがなく多くが手っ取り早く、しっかりと短い滑り運動。
   注: 必要な力と滑り運動の振幅を測定するには、このステップべきでは数回、たびに顕微鏡下で結果を確認します。
5. DAPI ソリューションを必要な場合に追加し、1 h ワイド フィールド蛍光や 24 時間以内の共焦点顕微鏡下その場観察に進みます 4 ° C 15 分で暗闇の中で湿気のあるボックスでスライドかどうか、さらにチェックをクリア SDS とこの手順を結合する場所を向上させるメンツが得られます。

6. ナトリウム Dodecyl 硫酸塩 (SDS) をクリア

注: によって分析される花器と非常に柔らかく、小さな検体を分析する研究者のスキル、SDS の処置でも行えます (経験者) の前にいずれかまたは解剖手順 (少ない経験の後研究者) メタノール酢酸酸材料を固定します。

1. 時計メーカーのガラス、凹面のスライド、または微量遠心チューブを使用して、1 %sds と室温で一晩 0.2 N 水酸化ナトリウム溶液中または非解剖解剖サンプルをインキュベートします。
2. サンプルは非常に柔らかい透明な外観をしているので取り扱いに注意。数回を水ですすいでください。
   注: SDS ソリューションの残党は、染色液、例えば、アニリン ブルーを追加するとき析出する可能性があります。
3. 非解剖サンプルのセクション 2、70% エタノールではなく水を使用で説明した解剖手順に従います。目的の組織を解剖後残党と、破片、あぶらとり紙で、余分な水分を削除する染色液の 20-40 μ L を追加し、6.5 の手順に進みます。
4. 切り裂かれたサンプルには、慎重に洗浄液からサンプルを移動しきれいなスライドに配置、染色液の 20-40 μ L を追加します。
5. スライドの横にそれを下げることによって観察をそっと置きます。準備をスカッシュに注意してください。組織が柔らかすぎる場合は、いずれかの薄いスライドと (例えば、テープまたは壊れた coverslip)、その四隅に coverslip の間の区切り記号の場所は、coverslip 試料を粉砕しないように、スライドと観察の間商工会議所のようなスペースを残してください。
6. 湿気の多いボックス内のすべてのスライドに配置、アルミ箔でカバーし、少なくとも 1 h. 広視野蛍光または 24 h 内共焦点の顕微鏡を使用して標本の観察に進みます 4 ° C で置きます。

結果

シロイヌナズナは花序 (図 1) に配置された両性花で花序を軸受、Brassicacea 家族に属しています。それぞれの花は 4 がく片、花びら、(4 つの長いおよび 2 つの短い)、六つの雄しべ、4 つの同心円状の渦巻き^25,26で配置 2 先天性融合心皮 (図 1 階H) から成る syncarpous...

ディスカッション

シロイヌナズナ、すべて花の発達段階にまたがる単一の花序内の多くの花蕾の存在が治療や発達機能の効果を特徴を目指した研究のユニークな機会を提供しています花の開発のさまざまな段階で同時に異なる個体間の良好な基準点は主要な花序の最初の花の開いています。植物が開花が同期されているような方法で扱われる可能な (例えば、4 ° C で最大同期種子の発芽およびそ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.