Целом гора очистки и окраски Arabidopsis цветок органов и Siliques

Резюме

В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.

Аннотация

Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.

Введение

Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад¹и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина². Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы^3,4,5,6 . Высокая вариация в цветочные формы и структуры, а также виды сексуального и бесполого размножения, опираясь на них, сделать цветок очень сложную структуру. Это привело к разнообразные усилия для характеризуют анатомии и структурные особенности цветочные органов, используя свет и электрон микроскопические методы, которые можно было бы объединить с генетические и молекулярные исследования⁷. Кроме того, как источник плоды и семена Цветки имеют первостепенное значение для человека и животных питания. Таким образом характеристика развития цветка и плода имеет множество последствий для прикладных исследований, в том числе продовольственной безопасности растущего населения и сохранения экологических стратегий в рамках меняющейся окружающей среды^{8 , 9 , 10}.

Цветок развития в проростках Arabidopsis начинается с цветок индукции и преобразование вегетативного Меристемы на Меристемы соцветия (группа цветов). Цветок Примордия инициируются боково на фланге соцветия Меристемы¹¹. Примордия цветочные орган постепенно формируют концентрические мутовках от снаружи к центру цветка и в конечном итоге превратиться в⁷чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистиков. Эти цветочные органов выполнять собственный питательная, защитных и функциональных (например, привлечение опылителей) ролей в различных видов растений, с половыми органами, устойчивого развития мужских и женских gametophytes, соответственно^{12 , 13}. gametophytes, в свою очередь, каждый дифференцировать пару мужчин (спермы) и женские гаметы (яйца и центральная ячейка), которые объединяют по двойной оплодотворения в форме следующего поколения, зиготы и основной эндосперма, поддержка терминалов ткани развитие эмбриона^14,15. Плоды и семена развития поддержки роста, созревания и сохранение эмбриона и, в конечном счете, ее разгон. Обширные исследования была выполнена характеризовать цветок и развития эмбриона в видов различных растений, особенно в модели вида Arabidopsis^7,16,17.

Ранние микроскопические анализы цветок развития были основаны на времени пример обработки и наблюдения, что методы, такие как парафин или встраивание смолы и секционирование, в сочетании с легкими или электронной микроскопии. Эти традиционные микроскопические методы были часто используется в сочетании с молекулярные генетические исследования, такие как микроскопические анализы мутантов, локализация РНК путем в situ гибридизация или иммуно обнаружение белков. Недавний прогресс в-поля и конфокальный флуоресцентной микроскопии, в состояние искусства трехмерного компьютерного изображения анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов, которые могут быть использованы на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к необходимости методы обработки образца эффективной и минимальным, которые поддаются преференциально количественного анализа. В последние годы был достигнут значительный прогресс в развитии методов очистки на целом гора животных образца. Они транспарентности образца либо с помощью водного раствора мочевины - или на основе сахара реагенты (например, масштаб, SeeDB, КУБИЧЕСКИЙ)^18,19,20, или выборочно удалить липидов (с использованием моющего средства SDS) после Встраивание образцов в стабильных гидрогели; удаление липидов может быть достигнуто либо путем пассивной диффузии (например, изменение ЯСНОСТИ протокол²¹, Пакт-ПАРС-колеса²²) или активно электрофорезом (оригинал ЯСНОСТИ протокол²³ и акт-вуаля²⁴). Воодушевленные этой быстрый прогресс, некоторые производные методы появляются также для использования в растениях.

В этом документе методы сосредоточены на модели Arabidopsisмы описываем порядок надлежащего вскрытия бутонов, цветов, и молодые siliques и очистки всего гора образцов для разнообразной окраски и процедуры наблюдения с помощью Классическая или недавно метод очистки на базе ИКБ. Даны примеры крахмал, callose и окрашивание хроматина. Хотя эти процедуры может понадобиться дальнейшего улучшения и адаптации при использовании с другими видами, мы надеемся, что они будут почву для дальнейших исследований на этих простых, но важных методов, которые являются отправной точкой многих научно-исследовательских проектов.

протокол

1. цветок и стручок фиксации

1. На открытии первого цветка синхронизации урожай цветы и siliques из растений.
   Примечание: В экспериментальных условиях использовали здесь, растения начинают цветение около 21 дней после пересадки от плиты фотосинтетическую и Скуг (МС) в почву. Семена, стратифицированная по 3 – 4 дня при температуре 4 ° C и проросшие/выращенных на MS пластинки в свет 16 h/22 ° C и 18 ° C/8 h темный для 8-10 дней, до высадки рассаду на богатые питательными веществами почвы в горшках, хранится на тех же условиях (рис. 1). Количество реплицирует зависит от цели конкретных исследований, но минимум 5 соцветия (от 5 отдельных растений) для каждого лечения рекомендуется. Если цветы экспериментальное подразделение, рекомендуется минимум 10 цветов на репликацию.
2. Срезанные соцветия или цветы (Рисунок 1E-H), используя маленькие ножницы (например, ножницы для ногтей) и поместите их непосредственно в пробки microcentrifuge (для фиксации соцветия/цветок) или конической трубки (для коллективного записей) содержащие свежезаваренным сделал Карнуа 's, метанол/уксусной кислоты или FPA50 фиксаторы (в зависимости от приложения, см. ниже) на льду.
   Примечание: Образцы необходимо полностью погружать в фиксатором.
3. Оставьте ткань внутри фиксатором для 4 h на ночь при 4 ° C.
   Примечание: Инфильтрации вакуум может быть использован для ускорения проникновения фиксатором в ткани, но это может быть пагубным для сохранения структуры ткани. Авторы не реализуют вакуумные инфильтрации.
4. Снимите фиксатор, добавить достаточно 70% этанола для покрытия образцы и вернуть их до 4 ° C в течение 24 часов; образцы могут бесконечно оставаться в этом решении. После удаления этанола, немедленно приступить к следующему шагу; рассечение или SDS очистки.

2. диссекция под стереомикроскопом

1. Положите свежеприготовленные 70% этанола в часы чайник стекла, помещаемых на небольшой Петри для поддержки.
2. Соцветие/цветок/стручок на этом свежезаваренным сделал фиксатором и вскрыть под стереомикроскопом, с помощью щипцов и шприц с иглой.
   1. Используйте часы maker стекла или подобное устройство, которое позволяет образцов быть полностью покрыты с этанолом (рекомендуется) для рассечения соцветия и разрывает цветочные органов Зрелые цветы (чашелистики, лепестки и тычинки могут быть расчленены на данном этапе ) чтобы избежать риска высыхания образцов.
3. Вскрыть siliques и небольшие бутоны на слайде, как описано ниже.
   1. Отложил часы чайник стекла с предварительно обработанные образцы и использовать обычный слайд для окончательного вскрытия.
   2. Переместите образец интерес к слайду и 10 мкл свежие на 70% спирте. Быстро работать на окончательный диссекции и 10 мкл этанола, при необходимости сохранить образец влажные без чрезмерной жидкости.
   3. Для выпуска зерна пыльцы из тычинок, смотрите шаг 5.1. Для рассечения плодолистиков и яйцеклеток, выполните процедуру, описанную на рисунке 2. Эта процедура применима ко всем этапам развития пестика, в том числе на стадии разработки зеленый siliques.
      Примечание: Не добавлять этанола, если есть достаточно этанола перенос перемещение образцов; Пройдя через очень небольшие образцы намного проще в минимальное количество жидкости. Всегда держите только органы интерес (чашелистики, лепестки, тычинки, плодолистиков, яйцеклеток, семян или зерна пыльцы) на слайде. Эта процедура позволит обеспечить равномерную толщину между слайд и coverslip, соответствующий толщине органа под экспертизы, что приводит к более высокой однородности и таким образом эффективности микроскопических экзаменов (большее число целевых образцов в одной фокальной плоскости).
4. Поглощать и удалить столько этанол как можно используйте небольшой кусок промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу (раздел 3, 4 или 6) перед образца сушит вне.

3. на основе хлораль гидрата клиринга и комбинированных информационно окрашивание

Примечание: Наилучшие результаты для очистки на основе хлораль гидрата получаются с фиксированной материала FPA50.

1. Место 20 мкл очистки раствора (хлораль гидрата/глицерина, изменение Хойер средний, Herr в 4½ или Герр ИКИ-4½ решения) на слайде образца подшипника. С помощью пары шприцев с гиподермального иглы, поместите образцы, сокращения пространства между ними и листать те где орган интерес сталкивается вниз. Удалите любые оставшиеся пузырьков воздуха с помощью иглы.
2. Нижняя coverslip боком и осторожно поместите его, нажав очень осторожно и подождать до тех пор, пока решение очистки заполняет пространство между ними. Добавьте решение минимальная очистка, если необходимо, чтобы заполнить все пространство под coverslip.
3. Поместите слайд слайд держатель и оставить его под зонт. Перейти к микроскопические наблюдения после по крайней мере 4 ч и в течение следующих 4-5 дней.

4. Сводные Александр окрашивание и Герр в 4½ очистки пыльники

Примечание: Оригинальный Александр протокол основан на выпуск зерна пыльцы на слайде до окрашивания. Эффективной и более информативным, изменение Александр, окрашивание и очистки процедура является окрашивание зрелого зерна пыльцы в зрелый, но не вскрывающийся пыльники.

1. Выберите свежеубранных бутоны, которые вы собираетесь открыть с не вскрывающийся пыльники.
   Примечание: Не принимать маленьких бутонов, потому что Александр пятнать предназначен для зрелого зерна пыльцы и эффективно не испачкать Незрелые зерна пыльцы. Рекомендуется минимум 5 цветов за лечение, собирают из различных растений и соцветия.
2. Подготовьте 96-луночных плита с достаточно Александр решение погрузиться бутон цветка. Подвергать пыльники, удалив чашелистиков и лепестков и погрузить их в растворе Александра. Храните образцы под зонт для 1-3 ч.
3. Замените Герр в 4½ решения Александра решение и место несколькими хорошо пластины обратно под зонт для ночи инкубации.
4. С помощью щипцов, осторожно перемещайте очищается бутоны на новый слайд. Поскольку могут возникнуть некоторые вынос Александра решения, используйте промокательную бумагу для удаления столько очистки решения как можно скорее.
5. Вскрыть тычинок и удалите все другие ткани. Следуйте инструкциям в разделе 3, с помощью Герр в 4½ решения.

5. Удаление Экзина из пыльцы

Примечание: Мы рекомендуем использовать Карнуа с фиксатором для окрашивания DAPI.

1. Выполните фиксацию и рассечение процедуры, описанные в разделах 1 и 2. В настоящее время необходимо иметь один для много тычинок на слайде в течение минимум на 70% спирте.
2. Для удаления избыточных этанола использовать промокательной бумаги и 5 – 10 мкл раствора DAPI. Используя пару шприцы с иглами, выпуск зерна пыльцы в пределах этого небольшое количество раствора (например, использовать один шприц для иммобилизации тычинки и других, чтобы освободить зерна пыльцы). Если раствор высыхает, добавьте еще 5 мкл DAPI.
3. Удаление всех мусора тычинка является важным шагом, таким образом, что только пыльца зерна остаются между слайд и coverslip.
4. Место coverslip на слайде образца подшипник, опустив ее в сторону и добавить минимальное количество DAPI решения, необходимые для заполнения пространства. Поместите указательный палец на coverslip, и без давя слишком много сделать быстро, фирмы и короткие скользящие движения.
   Примечание: Чтобы оценить необходимую силу и амплитуда скользящие движения, этот шаг следует практиковать несколько раз, проверка результатов каждый раз под микроскопом.
5. При необходимости добавьте DAPI решение и место слайда в коробке влажный в темноте при температуре 4 ° C 15 мин до 1 ч. Продолжайте наблюдать за образцы под-поля флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч. попытаться объединить эту процедуру с SDS, очистка проверить ли дальнейшие улучшения ments могут быть получены.

6. лаурилсульфат натрия (SDS) очистка

Примечание: В зависимости от цветочные орган для анализа и исследователь навыки, чтобы вскрыть очень мягкий и малых образцов, SDS лечение может осуществляться либо перед (для опытных исследователей) или после вскрытия шаг (для менее опытных исследователи) на метанол уксусной кислоты фиксированной материала.

1. Используйте часы чайник стекла, вогнутой слайд или пробки microcentrifuge для инкубации расчлененных или нерассеченный образцов в 1% SDS и 0,2 N NaOH решения на ночь при комнатной температуре.
2. Обращаться с осторожностью, потому что образец очень мягкий и прозрачный вид. Несколько раз промыть водой.
   Примечание: Остатки раствора ИКБ может привести к осадков при добавлении окрашивание раствора, например, анилиновый голубой.
3. Для образцов, нерассеченный следуйте рассечение процедуры, описанной в разделе 2, использование воды вместо 70% этиловом спирте. После рассечения желаемого ткани, удалить любые остатки и мусора и любой избыток воды с промокательной бумаги, а затем 20 – 40 мкл окрашивание раствора и переходите к шагу 6.5.
4. Для образцов, расчлененный тщательно, переместить выборки из моющего раствора и поместите его на чистый слайд и 20 – 40 мкл окрашивание раствора.
5. Осторожно поместите coverslip на слайде, опустив ее в сторону. Будьте осторожны, не Сквош подготовки. Если ткань является слишком мягким, место любого тонкого разделителя в слайд и coverslip по углам (например, ленты или сломанные coverslip), оставляя пространство камеры как между слайдов и coverslip, таким образом, что coverslip не раздавить образца.
6. Поместите все слайды в поле влажный, накрыть алюминиевой фольгой и поместите его на 4 ° C для по крайней мере 1 ч. Продолжайте наблюдать за образец, используя widefield флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч.

Результаты

Арабидопсис принадлежит к семейству Brassicacea, принимая соцветия цветками бисексуалов, организовал в цветет (рис. 1). Каждый цветок имеет четыре чашелистика, четырьмя лепестками, шесть тычинок (четыре длинный и два коротких) и синкарпная гинецея, состо...

Обсуждение

Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хор...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.