Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Zusammenfassung

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Zusammenfassung

Aufgrund seiner gewaltigen Werkzeuge für Molekulare genetische Studien ist Arabidopsis Thaliana eines der prominentesten Modell Arten in Pflanzenbiologie und insbesondere Anlage Reproduktionsbiologie. Allerdings beinhalten Pflanzen-morphologische, anatomische und Ultrastrukturforschung Analysen traditionell zeitraubende einbetten und Verfahren für Hellfeld, Scannen und Elektronenmikroskopie-Schnitt. Jüngste Fortschritte in konfokale Fluoreszenzmikroskopie, State-of-the-Art 3-d-CAD-mikroskopische Analysen und die kontinuierliche Verbesserung der molekularen Techniken auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden führte zu einer steigenden Nachfrage nach Entwicklung effizienter und minimale Probe Verarbeitungstechniken. In diesem Protokoll beschreiben wir Techniken für richtig sezieren Arabidopsis Blumen und Siliques, grundlegende Techniken, clearing und einige befleckenden Verfahren zur gesamten-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen.

Einleitung

Blumen sind eines der wichtigsten Organe der Angiospermen definieren. Blühende Pflanzen erschienen vor 90 Millionen Jahren¹, und so schnell, dass ihre schnelle aussehen als eine "abscheuliche Geheimnis" von Charles Darwin²beschrieben wurde diversifiziert. Die Interessen der Pflanzenforscher Blütenentwicklung sind vielfältig. Einige Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des evolutionären Ursprungs der Blume als Ganzes oder die Entwicklung der spezifischen anatomischen, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Blumen^3,4,5,6 . Die hohe Varianz in florale Form und Struktur sowie die Modi der sexuelle und asexuelle Reproduktion unter Berufung auf sie, machen der Blume ein hochkomplexes Gebilde. Dies führte zu vielfältigen Bemühungen um die Anatomie und strukturelle Eigenschaften von blütenorganen, mit Licht und Elektronen mikroskopischen Techniken, die in mit genetischen und molekularbiologischen Untersuchungen^{7 Kombination}zu charakterisieren. Darüber hinaus als Quelle von Früchten und Samen, sind Blumen von größter Bedeutung für die Human-und Tierernährung. Daher hat die Charakterisierung von Blüte und Frucht Entwicklung viele Konsequenzen für angewandte Forschung, einschließlich der Sicherung der Ernährung einer wachsenden Weltbevölkerung und ökologische Erhaltung Strategien im Rahmen einer sich ändernden Umwelt^{8 , 9 , 10}.

Blütenentwicklung in Arabidopsis beginnt mit Blume Induktion und die Transformation von der vegetativen Meristem, ein Blütenstand (Gruppe von Blumen) Meristem. Blume Primordia sind seitlich an der Flanke der Blütenstand Meristem¹¹eingeleitet. Die floralen Orgel Primordia schrittweise in konzentrischen Windungen von außen in die Mitte der Blüte zu bilden und schließlich in Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter und Fruchtblätter⁷entwickeln. Diese blütenorganen erfüllen unterschiedliche nutritive, Schutz- und funktionale (z.B.Bestäuber Attraktion) Rollen in verschiedenen Pflanzenarten mit den Geschlechtsorganen, die nachhaltige Entwicklung der männlichen und weiblichen Gametophyten, bzw.^{12 , 13}. die Gametophyten wiederum jeweils ein paar männlich (Sperma) unterscheiden und weiblichen Gameten (Ei und zentrale Zelle), die auf einen doppelte Befruchtung an die nächste Generation, die Zygote und primäres Endosperm bilden ein terminal Gewebe unterstützen die Entwicklung des Embryos^14,15. Frucht und Samen Entwicklung unterstützen das Wachstum, Reifung und Konservierung des Embryo und schließlich seine Ausbreitung. Umfangreicher Forschung ist durchgeführt worden, zur Charakterisierung von Blume und Embryo Entwicklung in verschiedenen Pflanzenarten, vor allem in der Modell-Spezies Arabidopsis^7,16,17.

Frühe mikroskopische Analysen der Blütenentwicklung beruhten auf zeitraubende Probenbearbeitung und Beobachtung, dass Techniken wie Paraffin oder Harz einbetten und -Schnitt, mit Licht oder Elektronenmikroskopie kombiniert. Diese traditionellen mikroskopischen Techniken wurden oft in Kombination mit molekularen genetischen Untersuchungen, wie mikroskopische Analysen von Mutanten, die Lokalisierung der RNA durch in Situ Hybridisierung oder die Immuno-Erkennung von Proteinen verwendet. Jüngste Fortschritte im Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie in State-of-the-Art 3-d CAD-Bild-Analysen und die kontinuierliche Verfeinerung der molekularen Methoden, die auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden kann führte zu einem Bedarf an Beispiel für effiziente und minimale Verarbeitungstechniken, die Quantitative Analysen bevorzugt zugänglich sind. In den letzten Jahren erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von Clearing-Techniken auf tierische Probe vollständig-hängen. Machen sie der Probe transparent entweder mit wässrigen Harnstoff oder zuckerhaltigen Reagenzien (z. B., Maßstab, SeeDB, KUBISCH)^18,19,20, oder selektiv entfernen Lipide (unter Verwendung des Waschmittels SDS) nach Proben einbetten in stabilen Hydrogele; die Entfernung von Lipiden kann entweder durch passive Diffusion (z.B.Klarheit Protokoll²¹, Pakt-PARS-Felgen²²geändert) oder aktiv durch Elektrophorese (ursprüngliche Klarheit Protokoll²³ und ACT-PRESTO-²⁴). Ermutigt durch diese schnelle Fortschritte, entstehen einige abgeleiteten Techniken auch für den Einsatz in Anlagen.

In diesem Methodenpapiers konzentrierte sich auf das Modell Arabidopsisbeschreiben wir das Verfahren für die ordnungsgemäße Zerlegung des jungen Siliques, Knospen und Blumen, und die Räumung des gesamten-Mount Proben für unterschiedliche Färbung und Beobachtung Verfahren mit klassische oder eine aktuelle SDS-basierte Clearing-Methode. Beispiele für Stärke, Zellstress und Chromatin zu beflecken. Obwohl diese Verfahren weitere Verbesserungen und Anpassungen bei Verwendung mit anderen Arten benötigen können, hoffen wir, dass sie die Bühne für die weitere Forschung auf diese einfachen, aber wichtigen Methoden festgelegt werden, die der Ausgangspunkt zahlreicher Forschungsprojekte sind.

Protokoll

1. Blume und Schote Fixierung

1. Ernte Blumen und Siliques aus Pflanzen synchronisiert bei der Eröffnung der ersten Blüte.
   Hinweis: Unter den experimentellen Bedingungen hier verwendete, Pflanzen blühen beginnen ungefähr 21 Tage nach der Transplantation von Murashige und Skoog (MS) Platten zu Boden. Samen sind geschichtete für 3 – 4 Tage bei 4 ° C und gekeimt/gewachsen auf MS-Platten bei 22 ° C/16 h Licht und 18 ° C/8 h dunkel für 8 bis 10 Tage vor der Verpflanzung der Sämlinge auf nährstoffreichen Böden in Töpfen gehalten unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 1). Die Anzahl der Wiederholungen hängt von der spezifischen Forschungsziel, aber mindestens 5 Blütenstände (aus 5 einzelnen Pflanzen) für jede Behandlung wird empfohlen. Blumen sind das Versuchsgerät, empfiehlt ein Minimum von 10 Blüten pro replizieren.
2. Schneiden Sie Blütenstände oder Blumen (Abb. 1E-H) mit einer kleinen Schere (z.B. Nagelschere) und legen Sie sie sofort in einem Microcentrifuge Schlauch (für einzelne Blütenstand/Blume Fixierung) oder eine konische Rohr (für kollektive Fixierungen) mit frisch gemacht Carnoy, Methanol/Essigsaure Säure oder FPA50 Fixiermittel (je nach Anwendung, siehe unten) auf dem Eis.
   Hinweis: Proben sollten vollständig in das Fixiermittel eingetaucht werden.
3. Lassen Sie das Gewebe innerhalb der Fixiermittel für 4 h bei 4 ° c über Nacht
   Hinweis: Vakuum Infiltration kann verwendet werden, für die Beschleunigung des Eindringen von das Fixiermittel in das Gewebe, aber dies möglicherweise nachteilig für die Erhaltung der Struktur des Gewebes. Die Autoren umsetzen Vakuum Infiltration nicht.
4. Das Fixiermittel zu entfernen, fügen Sie genügend 70 % igem Ethanol um die Proben zu decken, und bringt sie auf 4 ° C für mindestens 24 h; Proben können auf unbestimmte Zeit in dieser Lösung bleiben. Nach dem Entfernen von Ethanol, sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren; Dissektion oder SDS-Clearing.

2. Präparation unter dem Stereomikroskop

1. Setzen Sie gemacht frisch 70 % Ethanol in einem Uhrmacher Glas auf eine kleine Petrischale für Unterstützung.
2. Ort der Blütenstand/Blume/Schote dazu frisch aus Fixiermittel und unter dem Stereomikroskop mit Zange und eine Spritze mit einer Nadel zu sezieren.
   1. Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas oder ähnliches Gerät, das die Proben mit Ethanol (empfohlen) für die Zerlegung der Blütenstände und zerreißen blütenorganen Reifen Blüten (Kelchblätter, Blütenblätter und Staubfäden können in diesem Stadium seziert werden total überzogen sein können ), das Risiko von Proben Austrocknen zu vermeiden.
3. Sezieren Sie Siliques und kleine Blütenknospen auf einer Folie, wie unten beschrieben.
   1. Der Uhrenhersteller Glas mit vorbehandelte Proben beiseite, und verwenden Sie eine normale Folie für die endgültigen Zerlegung.
   2. Verschieben der Probe von Interesse auf die Folie und fügen Sie 10 µL frisch 70 % Ethanol. Arbeiten Sie zügig auf die endgültigen Zerlegung und 10 µL Ethanol, fügen Sie, falls nötig, um die Probe ohne übermäßige Flüssigkeit feucht zu halten.
   3. Für Freigabe Pollenkörner von Staubblättern, siehe Punkt 5.1. Folgen Sie für sezieren Fruchtblätter und Eizellen, Verfahren Sie wie in Abbildung 2. Dieses Verfahren gilt für alle Phasen der Entwicklung von Fruchtblatt, einschließlich der Entwicklungsstand des grünen Siliques.
      Hinweis: Fügen Sie Ethanol nicht hinzu, wenn es ausreichend Ethanol Verschleppung gibt von bewegten die Proben; sehr kleine Proben sezieren ist viel einfacher in eine minimale Menge an Flüssigkeit. Halten Sie immer nur die Organe von Interesse (Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Eizellen, Samen oder Pollenkörner) auf der Folie. Dieses Verfahren sorgt für eine gleichmäßige Dicke zwischen der Folie und Deckglas, entspricht der Dicke des Organs untersucht, wodurch eine höhere Homogenität und damit Effizienz für mikroskopische Untersuchungen (höhere Anzahl von Ziel-Proben in der gleichen Brennebene).
4. Verwenden Sie ein kleines Stück Löschpapier zu absorbieren und so viel Ethanol als möglich zu entfernen. Schnell fahren Sie mit dem nächsten Schritt (Kapitel 3, 4 oder 6) vor der Probe austrocknet.

3. Chloral Hydrate-basierte Abrechnung und kombinierte Clearing-Färbung

Hinweis: Beste Ergebnisse für Chloral Hydrate-basierte Clearing werden mit FPA50 befestigt Material erzielt.

1. Platz 20 µL der clearing-Lösung (Chloral Hydrate/Glycerin, modifizierte Hoyers Medium, die Herr 4½ oder Herr der IKI-4½ Lösungen) auf der Probe-Lager-Folie. Mit ein paar Spritzen mit hypodermal Nadeln, positionieren die Proben nach Bedarf durch Verringerung des Raumes zwischen ihnen, und spiegeln diejenigen wo steht das Organ der Zinsen nach unten. Entfernen Sie alle verbleibenden Luftblase mit der Nadel.
2. Senken Sie ein Deckglas seitlich zu sanft legen Sie es, sehr sanft drücken und warten Sie, bis die Clearing-Lösung den Raum dazwischen füllt. Bei Bedarf den gesamte Raum unter dem Deckglas füllen, fügen Sie minimale Clearing-Lösung hinzu.
3. Legen Sie die Folie auf einen Diahalter und lassen Sie es unter dem Abzug. Fahren Sie mit mikroskopischen Beobachtungen nach mindestens 4 h und in den nächsten 4 – 5 Tagen.

4. Alexander Färbung und der Herr 4½ Räumung der Antheren kombiniert

Hinweis: Das ursprüngliche Alexander-Protokoll basiert auf Freigabe Pollenkörner auf der Folie vor Verschmutzung. Eine effiziente und informativer, Alexander Färbung und clearing-Verfahren ist die Färbung der Reife Pollenkörner im Reifen aber nicht aufspringende Antheren geändert.

1. Wählen Sie aus frisch geernteten Blütenknospen, die mit nicht aufspringende Antheren öffnen.
   Hinweis: Nehmen Sie jüngere Blütenknospen nicht, weil Alexander Färbung sich an Reife Pollenkörner richtet und nicht effizient unreifen Pollenkörner befleckt. Ein Minimum von 5 Blüten pro Behandlung aus verschiedenen Pflanzen und Blütenstände geerntet wird empfohlen.
2. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit genügend Alexander Lösung um eine Blütenknospe zu versenken. Setzen Sie die Staubbeutel durch Entfernen der Kelchblätter und Kronblätter und tauche sie in Alexanders Lösung. Halten Sie die Proben unter dem Abzug für 1 – 3 h.
3. Ersetzen Sie Alexanders Lösung zu, mit der Herr 4½ Lösung und setzen Sie die Multi-well-Platte wieder unter dem Abzug für eine Inkubation über Nacht.
4. Mit Pinzette, sanft bewegen Sie die geräumten Blütenknospen in eine neue Folie. Da einige Verschleppung von Alexanders Lösung auftreten kann, verwenden Sie ein Löschpapier, um soviel Clearing-Lösung wie möglich zu entfernen.
5. Die staubblätter zu sezieren und andere Gewebe zu entfernen. Führen Sie die Schritte in Abschnitt 3 des Herrn 4½-Lösung.

5. entfernen die Exine aus Pollenkörner

Hinweis: Wir empfehlen Carnoy Fixativ für DAPI-Färbung.

1. Führen Sie die Fixierung und Dissektion Verfahren, die in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Jetzt sollte man ein bis viele staubblätter auf der Folie in einen Mindestbetrag von 70 % Ethanol haben.
2. Verwenden Sie ein Löschpapier, um überschüssige Ethanol zu entfernen, und fügen Sie 5 – 10 µL DAPI-Lösung. Mit ein paar Spritzen mit Nadeln, lassen Sie die Pollenkörner in diese kleine Menge Lösung (z. B.Verwendung einer Spritze, die Staubfäden und andererseits die Pollenkörner freizugeben zu immobilisieren). Fügen Sie ein weiteres 5 µL DAPI, wenn die Lösung trocknet aus.
3. Entfernen allen Schmutz von den Staubfäden ist ein wichtiger Schritt, so, dass nur Pollenkörner sind zwischen der Folie und dem Deckglas Links.
4. Platzieren Sie ein Deckglas auf der Probe-Lager-Folie durch seitlich absenken und fügen Sie die minimale Menge an DAPI-Lösung erforderlich, um den Raum zu füllen. Legen Sie einen Zeigefinger auf das Deckglas und ohne quetschen zu viel machen eine schnelle, feste und kurze Gleitbewegung.
   Hinweis: Um die notwendige Kraft und die Amplitude der gleitenden Bewegung einschätzen zu können, sollte diesen Schritt mehrmals geübt werden überprüft die Ergebnisse jedes Mal unter die Lupe genommen.
5. DAPI-Lösung bei Bedarf hinzufügen und statt die Folie in eine feucht-Box im Dunkeln bei 4 ° C für 15 min bis 1 Uhr weiter Proben unter Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 Std. zu beobachten versuchen, dieses Verfahren mit SDS löschen um zu überprüfen, ob weitere kombinieren verbessern rungen können abgerufen werden.

(6) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) löschen

Hinweis: Je nach floralen Organ analysiert werden, und auf der Forscher Fähigkeiten, sehr weich und kleine Exemplare zu zergliedern, die SDS-Behandlung kann erfolgen entweder vor (für erfahrene Forscher) oder nach der Dissektion Schritt (für weniger erfahrene Forscher) auf Methanol Essigsäure Säure Material fixiert.

1. Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas, eine konkave Folie oder einem Microcentrifuge Schlauch sezierte oder nicht seziert Proben in 1 % SDS und 0,2 N NaOH-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
2. Mit Vorsicht zu handhaben, weil die Probe sehr weich ist und eine transparente Erscheinung hat. Mehrmals mit Wasser abspülen.
   Hinweis: Reste der SDS-Lösung können zu Niederschlag führen, beim Hinzufügen der Färbelösung, z.B., Anilin-blau.
3. Folgen Sie für nicht seziert Proben Dissektion Verfahren Sie wie in Abschnitt 2, mit Wasser statt 70 % Ethanol. Entfernen Sie nach sezieren das gewünschte Gewebe alle Reste und Schmutz und überschüssiges Wasser mit einem Löschpapier, dann fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung und fahren Sie mit Schritt 6.5.
4. Für seziert Proben sorgfältig bewegen der Probenmaterials aus der Waschlösung und legen Sie sie in eine saubere Folie und fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung.
5. Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie durch seitlich absenken. Achten Sie darauf, nicht um die Vorbereitung zu zerquetschen. Wenn das Gewebe zu weich ist, verlassen findet eine Trennlinie in der Folie und dem Deckglas an seinen Ecken (z.B., Band oder einem gebrochenen deckgläschen), dünn einen Kammer-artigen Raum zwischen Folie und Deckglas, derart, dass das Deckglas die Probe vernichten nicht.
6. Legen Sie die Folien in einem feucht-Box, mit Alufolie decken Sie ab, und legen Sie sie bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde fahren Sie mit die Probe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 h zu beobachten.

Ergebnisse

Arabidopsis gehört zur Familie Brassicacea, Lager Blütenstände mit bisexuell Blumen in einer doldentraube (Abbildung 1). Jede Blume hat vier Kelchblätter, vier Blütenblätter, sechs staubblätter (vier lange und zwei kurze) und ein syncarpous Gynoeceum, bestehend aus zwei Geburt an geschmolzenen Fruchtblätter (Abb. 1F-H) in vier konzentrische Umgänge^25,

Diskussion

Die Existenz von vielen Blütenknospen innerhalb einer einzigen Blütenstand der Arabidopsis, überspannt alle Blume Entwicklungsstadien, bietet eine einzigartige Gelegenheit für Studien, die darauf abzielen, einen Effekt der Behandlung oder eine Entwicklungsstörung Funktion charakterisieren gleichzeitig über die verschiedenen Phasen der Blütenentwicklung. Ein guter Bezugspunkt zwischen verschiedenen Einzelpflanzen ist die Eröffnung der ersten Blüte der wichtigsten Blütenstand. Pflanzen werden behandelt, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.