כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Summary

ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

Abstract

בשל כלי אימתני שלו ללימודי הגנטי המולקולרי, תודרנית לבנה הוא אחד המינים דגם הבולטים ביותר בביולוגיה צמח, במיוחד, צמח הרבייה הביולוגית. עם זאת, צמח מורפולוגי, אנטומי, וניתוחים ultrastructural באופן מסורתי כוללים גוזלת זמן הטמעה חלוקתה הליכים שדה בהיר, סריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, המדינה-of-the-art תלת-ממדי בעזרת מחשב מיקרוסקופיים ניתוחים ו עידון רציפה של טכניקות מולקולריות כדי לשמש על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל לביקוש מוגבר פיתוח טכניקות עיבוד מדגם מינימלי ויעילה. פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ניקוד כראוי תודרנית ופרחים, בסיסי ניקוי טכניקות, siliques, כמה הליכים מכתימים עבור כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.

Introduction

פרחים בין החשובים ביותר מגדיר את האיברים של angiosperms. צמחים פורחים הופיע לפני כמה שנים 90-130 מיליון¹, ואת המגוון כל כך מהר כי הופעתם מהירה תוארה "תעלומה הזוועה" מאת צ'רלס דרווין². האינטרסים של חוקרי הצמחים בהתפתחות פרחים מגוונים. מחקר התמקדה הבנת המקור האבולוציוני של הפרח כולו, או את האבולוציה של תכונות אנטומיות מבניות, פונקציונלי ספציפי של פרחים^3,4,5,6 . וריאציית גבוהה ב טופס פרחוני, מבנה, כמו גם את דרכי רבייה אל-זוויגית ופוגע להסתמך עליהם, להפוך הפרח מבנה מורכב מאוד. זה הוביל במאמצים מגוונים לאפיון התכונות אנטומיה מבניים איברים פרחוני, תוך שימוש בטכניקות microscopical אלקטרון ואור זה יכול להיות משולב עם חקירות גנטית ומולקולרית⁷. יתרה מזאת, כמקור של פירות וזרעים, פרחים הם בחשיבות עליונה על תזונת האדם ושל בעלי החיים. לכן, אפיון ופיתוח פרחים ופירות יש השלכות רבות על מחקר יישומי, כולל מזון אבטחה עבור אוכלוסיה אנושית וגובר ואסטרטגיות שימור אקולוגי תחת סביבה משתנה^{8 , 9 , 10}.

פיתוח פרח תודרנית מתחיל עם פרח אינדוקציה, הטרנספורמציה של meristem וגטטיבי כדי meristem תפרחת (קבוצה של פרחים). פרח primordia מבוצעים רוחבית לאגף מ meristem תפרחת¹¹. Primordia איברים פרחוני בהדרגה בצורה המעגלים הקונצנטריים מבחוץ אל מרכז הפרח, ובסופו של דבר לפתח לתוך עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels⁷. אלו איברים פרחוני להגשים הגנתי התזונתי, ברורים, ואת פונקציונלי (למשל, המשיכה המאביק) תפקידי מיני צמחים שונים, עם איברי המין סופגת את התפתחות gametophytes זכר ונקבה, בהתאמה^{12 , 13}. gametophytes, בתורו, להבדיל כל זוג של זכר (זרע) ולהכפיל גמטות הנשי (ביצה, תא מרכזי), אשר התאחדו על הפריה כדי ליצור את הדור הבא של הזיגוטה, את האנדוספרם העיקרי, רקמות מסוף המשנה התפתחות העובר ה-^14,15. פיתוח זרעים ופירות תומכת צמיחה, התבגרות, שימור העובר ופיזור, בסופו של דבר, שלה. מחקר מקיף בוצעה כדי לאפיין את הפרחים והתפתחות העובר במיני צמחים שונים, במיוחד במינים דגם תודרנית^7,16,17.

ניתוחים מיקרוסקופיים מוקדם של התפתחות פרחים היו מבוססים על מדגם גוזלת זמן עיבוד והתבוננות טכניקות, כמו פרפין או שרף הטבעה ו חלוקתה, בשילוב עם אור או מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלה מיקרוסקופיים מסורתי שימשו לעיתים קרובות בשילוב עם חקירות הגנטי המולקולרי, כגון ניתוחים microscopical של מוטציות, הלוקליזציה של RNA על ידי הכלאה בחיי עיר או חיסונית-זיהוי חלבונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ שדה רחב וקונפוקלי פלורסצנטיות, התמונה בעזרת מחשב תלת-ממדי המדינה-of-the-art ניתוחים, עידון רציפה של שיטות מולקולריות שניתן להשתמש בהם על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל צורך טכניקות עיבוד מינימלי ויעילה מדגם נתונות מעדיפים כמותני. בשנים האחרונות הפך התקדמות משמעותית בפיתוח טכניקות ניקוי על הדגימה בעלי חיים שלמים-הר. הם לעיבוד המדגם שקוף באמצעות מימית אוריאה - או סוכר מבוססי ריאגנטים (למשל, קנה מידה, SeeDB, מעוקב)^18,19,20, או על ידי באופן סלקטיבי הסרת שומנים (באמצעות הנוזל מרחביות) לאחר הטבעה דגימות ב hydrogels יציב; הסרת שומנים יכולה להיות מושגת באמצעות דיפוזיה פסיבית (שונה,למשלפרוטוקול בהירות²¹, ברית-PARS-חישוקים²²) או באופן פעיל על-ידי אלקטרופורזה (בהירות המקורי פרוטוקול²³ ו מעשה-פרסטו²⁴). בעידודה של התקדמות מהירה זו, כמה טכניקות נגזר גם מתגלים לשימוש בצמחים.

בנייר זה שיטות התמקדו המודל תודרנית, נתאר ההליך את הקרע הנכון של ניצני פרחים, פרחים, siliques צעיר, קרחת היער של דגימות כולה-הר עבור צביעת מגוונות ונהלים התבוננות באמצעות קלאסית או שיטה סליקה מבוססי מרחביות האחרונות. דוגמאות עמילן, callose של כרומטין מכתים ניתנת. אף על פי נהלים אלה עליך בהמשך שיפורים והתאמות בעת שימוש עם מינים אחרים, אנו מקווים שהם יהיה להגדיר את הבמה עבור מחקר נוסף על שיטות אלה פשוט אבל קריטיים המהווים נקודת ההתחלה של פרויקטי מחקר רבים.

Protocol

1. פרח, קיבוע Silique

1. Siliques מצמחים ופרחים הקציר מסונכרנים בטקס הפתיחה של הפרח הראשון.
   הערה: בתנאים ניסיוני המשמש כאן, להתחיל צמחים פורחים כ 21 ימים לאחר ההשתלה של צלחות Murashige ו- Skoog (MS) אל הקרקע. זרעים מרובדת במשך 3-4 ימים ב 4 ° C, מונבטים/גדל על צלחות MS-22 ° C/16 שעות אור ו- 18 ° C/8 h כהה במשך 8-10 ימים, לפני משתילים את השתילים באדמת עשירות בעציצים תחת באותם התנאים (איור 1). המספר של משכפל תלוי המטרה מחקר ספציפי, אך מומלץ מינימום של התפרחות 5 (מ 5 צמחים בודדים) עבור כל טיפול. אם הפרחים יחידת ניסויי, מומלץ מינימום של 10 פרחים לכל שכפול.
2. התפרחות או פרחים (איור 1E-H) באמצעות מספריים קטנות (למשל, מספריים לציפורניים) ולמקם אותם מיד צינור microcentrifuge (עבור קיבוע תפרחת/פרח יחיד) או צינור חרוטי (עבור הקיבועים קולקטיבית) המכיל טרי גרם של Carnoy, חומצה אצטית/מתנול או כתות ומייצבים FPA50 (בהתאם ליישום, ראה להלן) על קרח.
   הערה: דוגמאות צריך להיות לגמרי שקועים מקבע.
3. להשאיר הריקמה שבתוך מקבע במשך 4 שעות ללון ב 4 º C.
   הערה: חדירת אבק יכול לשמש לצורך זירוז חדירת מקבע לתוך הרקמה, אך ייתכן שהדבר מזיק שמירה על המבנה של הרקמה. המחברים לא מיישמת הסתננות ואקום.
4. הסר את מקבע, הוספת אתנול 70% מספיק כדי לכסות את הדגימות, ולהחזיר אותם עד 4 ° C לפחות 24 שעות; דוגמאות יכול להישאר ללא הגבלת זמן בפתרון זה. לאחר הסרת אתנול, פנה מיד אל השלב הבא; ניתוח או ניקוי מרחביות.

2. ניתוח תחת Stereomicroscope

1. לשים ומדברי 70% אתנול בכוס של יוצר השעון מניחים על צלחת פטרי קטנים לקבלת תמיכה.
2. המקום תפרחת/הפרח/silique על זה טרי עשה מקבע ומנתחים תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים מזרק עם מחט.
   1. שימוש של יצרנית שעון זכוכית או התקן דומה המאפשר את הדוגמאות כדי להיות מכוסה לגמרי עם אתנול (מומלץ) עבור ניתוח התפרחות, ועבור קורע איברים פרחוני של פרחים בוגרת (עלי גביע, עלי כותרת, אבקן יכול להיות גזור בשלב זה ) כדי למנוע את הסיכון של דגימות מתייבשת.
3. לנתח siliques, ניצני פרחים קטנים בשקופית כמתואר להלן.
   1. לשים בצד של היוצר שעון הזכוכית עם דגימות מעובד מראש ולהשתמש שקופית רגילה של החתך האחרון.
   2. להעביר את הדגימה עניין לשקופית ולהוסיף 10 µL של אתנול 70% טרי. לעבוד במהירות על החתך האחרון ולהוסיף 10 µL של אתנול, במידת הצורך, כדי לשמור את הדגימה לחות ללא נוזל מוגזמת.
   3. ולשחרור גרגרי אבקה מן האבקנים, ראה שלב 5.1. ניקוד carpels ו- ovules, בצע את ההליך המתואר באיור2. הליך זה חל על כל שלבי התפתחות שחלה, כולל בשלב ההתפתחות של siliques ירוק.
      הערה: לא להוסיף אתנול אם יש מספיק carry-over אתנול מלעבור את הדגימות; לנתח דגימות קטן מאוד קל בהרבה בכמות מינימלית של נוזל. תמיד לשמור רק את האיברים של עניין (עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels, ovules, זרעים או גרגרי אבקה) בשקופית. הליך זה יבטיח עובי אחיד בין שקופיות coverslip, התואם העובי של האיבר תחת בדיקה, וכתוצאה מכך הומוגניות גבוה יותר, ולכן יעילות עבור בדיקות מיקרוסקופיות (מספר גבוה יותר של דגימות היעד באותו מוקד מישור).
4. השתמש חתיכה קטנה של נייר סופג כדי לספוג ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. במהירות להמשיך לשלב הבא (סעיף 3, 4 או 6) לפני מדגם מתייבש החוצה.

3. קלוראל-הידרייט המבוסס על חישוף, מכתים סליקה משולב

הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור סליקה מבוססי קלוראל-הידרייט מתקבלים עם FPA50 קבוע חומר.

1. מקום 20 µL ניקוי פתרון (קלוראל-הידרייט/גליצרול, שונה בינוני של שותפה עסקית, 4½ של אדון או איקי-4½ פתרונות של אדון) בשקופית מניבי הדגימה. באמצעות זוג מזרקים עם מחטים hypodermal, מקם את דגימות כנדרש על ידי הפחתת שביניהם, סובבי אותם איפה האיבר עניין פונה כלפי מטה. הסר את כל בועות האוויר הנותרים בעזרת המחט.
2. הנמך את coverslip על הצד בעדינות למקם אותו, לחיצה בעדינות ו לחכות עד הפתרון סליקה ממלאת את הרווח בין. להוסיף פתרון סליקה מינימלית, במקרה הצורך, כדי למלא את החלל כולו תחת coverslip.
3. מניחים את השקופית על בעל שקופית ולהשאיר את זה מתחת למכסה המנוע fume. המשך תצפיות מיקרוסקופיות לאחר לפחות 4 שעות, במהלך הימים הבאים 4 – 5.

4. בשילוב אלכסנדר מכתים, ניקוי 4½ של הר של פורים

הערה: פרוטוקול אלכסנדר המקורי מבוסס על שחרור גרגרי אבקה על השקופית לפני צביעת. יעיל ואינפורמטיבי יותר, שונה אלכסנדר מכתים ולניקוי הליך זה ההכתמה של בוגר גרגירי אבקה בתוך פורים בוגרת אבל ללא dehiscent.

1. לבחור ניצני פרחים שנקטפו זה עתה על מנת לפתוח עם פורים dehiscent.
   הערה: לא לקחת ניצני פרחים הצעיר כי אלכסנדר מכתים מיועד בוגרת גרגירי אבקה, אינו מכתים ביעילות גרגרי אבקה לא בוגר. מומלץ מינימום של 5 פרחים לכל טיפול שנקטפו התפרחות וצמחים שונים.
2. להכין צלחת 96-ובכן פתרון של אלכסנדר מספיק. להציף ניצן של פרח. לחשוף את פורים על-ידי הסרת את עלי גביע, עלי כותרת, לטבול אותם בפתרון של אלכסנדר. שומרים את הדגימות מתחת למכסה המנוע fume עבור h 1 – 3.
3. להחליף את הפתרון של אלכסנדר עם פתרון 4½ של אדון ולמקם את הצלחת רב טוב בחזרה מתחת למכסה המנוע fume עבור דגירה לילה.
4. באמצעות מלקחיים, להניע בעדינות את ניצני פרחים שנוקה על שקופית חדשה. מאז כמה carry-over של הפתרון של אלכסנדר עלולה להתרחש, להשתמש בנייר סופג כדי להסיר כמה שיותר פתרון סליקה ככל האפשר.
5. האבקנים לנתח ולהסיר כל רקמות אחרות. בצע את השלבים בסעיף 3 באמצעות פתרון 4½ של הר.

5. הסרת Exine את גרגרי אבקה

הערה: מומלץ להשתמש לשבועיים של Carnoy עבור צביעת דאפי.

1. בצע את ההליכים קיבעון, דיסקציה שמתואר בסעיפים 1 ו- 2. עד עכשיו, אחד צריך אחד כדי האבקנים רבים בשקופית בתוך סכום מינימלי של 70% אתנול.
2. להשתמש בנייר סופג כדי להסיר עודפי אתנול, ולהוסיף 5 – 10 µL של דאפי פתרון. באמצעות כמה מזרקים עם מחטים, שחרר את גרגרי אבקה בתוך זה כמות קטנה של פתרון (למשל, שימוש במזרק אחד על מנת לשתק את האבקן והשני כדי לשחרר את גרגרי אבקה). להוסיף עוד 5 µL של דאפי אם הפתרון מתייבש.
3. הסרת כל פסולת של האבקן הוא שלב קריטי, כזה רק גרגרי אבקה נותרו בין השקופית את coverslip.
4. במקום coverslip בשקופית מניבי הדגימה על ידי הורדתו לצדדים ולהוסיף את כמות מינימלית של דאפי הפתרון הנדרש כדי למלא את החלל. במקום של האצבע המורה על coverslip, בלי מועך גם הרבה תפני מהר, המשרד, וקצר התנועה החלקה.
   הערה: כדי לאמוד את הכוח הדרוש ואת משרעת של התנועה הזזה, שלב זה צריך להיות מתורגל מספר פעמים, בדיקת התוצאות בכל פעם תחת המיקרוסקופ.
5. הוספת פתרון דאפי במידת הצורך ולשפר את המקום שהשקופית בקופסה לח בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות 1 ח' להמשיך להתבונן דגימות תחת שדה רחב זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך ה 24 מנסים לשלב הליך זה עם מרחביות ניקוי כדי לבדוק אם נוספת ניתן להשיג את הקצאות.

6. נתרן גופרתי Dodecyl (מרחביות) ניקוי

הערה: בהתאם האיבר פרחוני כדי להיות מנותח, על המיומנויות של החוקר לנתח דגימות מאוד רך וקטן, הטיפול מרחביות יכול להתבצע גם בעבר (עבור חוקרים מנוסים) או לאחר הקרע צעד (עבור פחות מנוסים חוקרים) על חומצה אצטית-מתנול קבוע חומר.

1. השתמש הזכוכית של מכונת watch, שקופית קעורה או צינור microcentrifuge כדי דגירה דגימות ביתור או שאינם גזור ב 1% מרחביות והפתרון 0.2 N NaOH ללילה בטמפרטורת החדר.
2. לטפל כי המדגם הוא רך מאוד ובעל מראה שקוף. לשטוף מספר פעמים עם מים.
   הערה: שרידי הפתרון מרחביות עלול להוביל משקעים בעת הוספת מכתימים הפתרון, למשל, אנילין כחול.
3. לקבלת דוגמאות ללא-גזור, בצע את ההליך לנתיחה המתוארות בסעיף 2, באמצעות מים במקום 70% אתנול. לאחר לנתח את הרקמה הרצויה, להסיר את כל שאריות פסולת ואת כל המים העודפים עם נייר סופג, ולאחר מכן להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים, להמשיך עם שלב 6.5.
4. לקבלת דוגמאות גזור, בזהירות להעביר את הדגימה הפתרון כביסה למקם אותו לשקופית נקי ו להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים.
5. הנח בעדינות coverslip בשקופית על-ידי הורדת אותו לצדדים. הקפידו לא למעוך את ההכנה. אם הרקמה רכה מדי, במקום כל דק המפריד בין השקופית את coverslip בפינות שלו (למשל, קלטת או של coverslip שבורים), משאיר רווח קאמרית כמו בין שקופיות coverslip, כך coverslip לא לרסק את הדגימה.
6. מקם כל השקופיות בתוך קופסה לח, לכסות אותו ברדיד אלומיניום, ומקם אותו ב 4 ° C לפחות 1 ח' להמשיך להתבונן הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך 24 שעות.

תוצאות

תודרנית שייך למשפחת Brassicacea, הנושאת את התפרחות עם פרחים דו מיניים מסודרים בתפרחת (איור 1). כל פרח יש ארבעה עלי גביע, 4 עלי כותרת, 6 אבקנים (ארבעה ארוך וקצר שני), שחלה syncarpous המורכבת carpels שני מלידה מאוחה (איור 1F-H) מסודרים ארבעת המעגלים...

Discussion

קיומו של ניצני פרחים רבים בתוך תפרחת בודדת של תודרנית, המתפרסות על-פני כל שלבים התפתחותיים של פרח, מציע הזדמנות ייחודית ללימודי מכוון אפיון אפקט של טיפול או תכונה התפתחותית בו זמנית על פני בשלבים שונים של פיתוח פרח. נקודת התייחסות טובה בין מיני צמחים בודדים הוא פתיחת הפרח הראשון של הת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.