Entier-Montez de compensation et la coloration des Siliques et organes fleur Arabidopsis

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivent des techniques pour la dissection appropriée d’Arabidopsis fleurs et siliques, quelques techniques de base de compensation et sélectionné les procédures pour les observations d’entier-montent des structures reproductrices de coloration.

Résumé

En raison de sa formidables outils pour les études de génétique moléculaire, Arabidopsis thaliana est une des espèces plus en vue de la modèle en biologie végétale et, surtout, en biologie de la reproduction végétale. Cependant, plante morphologique, anatomique et les analyses ultrastructurales comprennent traditionnellement beaucoup de temps l’incorporation et la section procédures de champ lumineux, balayage et au microscope électronique. Les progrès récents dans la microscopie confocal fluorescence, state-of-the-art 3D analyses microscopiques assistée par ordinateur et l’amélioration continue des techniques moléculaires pour être utilisé sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à une augmentation de la demande pour développement de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon. Dans ce protocole, les auteurs décrivent les techniques de dissection correctement Arabidopsis fleurs et siliques, base de techniques, de compensation et certaines méthodes de coloration pour toute monture observations des structures reproductrices.

Introduction

Fleurs sont parmi les plus importantes définissant des organes des angiospermes. Plantes dicotylédones est apparu il y a 90 millions ans¹et diversifié si vite que leur apparition rapide a été décrit comme un « mystère abominable » par Charles Darwin,². Les intérêts des chercheurs de l’usine de développement floral sont diverses. Certaines recherches ont porté sur la compréhension de l’origine évolutive de la fleur dans son ensemble, ni l’évolution des propriétés spécifiques d’anatomiques, structurales et fonctionnelles des fleurs^3,4,5,6 . La forte variation dans la forme florale et structure, ainsi que les modes de reproduction sexuée et asexuée, en s’appuyant sur eux, faire la fleur, une structure très complexe. Cela a conduit à divers efforts pour caractériser les éléments d’anatomie et de la structure des organes floraux, en utilisant des techniques microscopiques photonique et électronique qui pourraient être associées à des études génétiques et moléculaires⁷. En outre, comme la source de graines, de fruits et de fleurs sont d’une importance primordiale pour la nutrition humaine et animale. Donc, la caractérisation du développement de fleurs et de fruits a de nombreuses implications pour la recherche appliquée, y compris la sécurité alimentaire d’une population croissante et des stratégies de conservation écologique portant une mutation de l’environnement^{8 , 9 , 10}.

Développement floral chez Arabidopsis commence avec l’induction florale et la transformation du méristème végétatif d’un méristème de l’inflorescence (groupe de fleurs). Fleur primordiums latéralement sur le flanc de l’inflorescence méristème¹¹. Les primordia des organes floraux forment progressivement en verticilles concentriques de l’extérieur vers le centre de la fleur et éventuellement se développent en des sépales, pétales, étamines et des carpelles⁷. Ces organes floraux remplissent distincte nutritive, protectrice et fonctionnelle (par exemple, l’attraction des pollinisateurs) rôles dans différentes espèces de plantes, avec les organes sexuels, soutenir le développement des gamétophytes mâles et femelles, respectivement^{12 , 13}. les gamétophytes, à son tour, chacun différencient une paire de mâles (spermatozoïdes) et des gamètes femelles (oeuf et cellule centrale), qui s’unissent à la double fécondation pour former la prochaine génération, le zygote et l’endosperme primaire, un terminal tissus soutenant le développement de l’embryon^14,15. Développement des fruits et semences de soutenir la croissance, la maturation et la conservation de l’embryon et, éventuellement, sa dispersion. Une recherche approfondie a été effectuée pour caractériser la fleur et l’embryon développement dans diverses espèces végétales, en particulier en l’espèce modèle Arabidopsis^7,16,17.

Des analyses microscopiques au début du développement floral reposaient sur le traitement des échantillons fastidieux et observation techniques, comme la paraffine ou résine enrobage et sectionnant, combiné avec la lumière ou la microscopie électronique. Ces techniques microscopiques traditionnelles étaient souvent utilisés en combinaison avec des enquêtes génétiques moléculaires, comme les analyses microscopiques de mutants, de la localisation de l’ARN par hybridation in situ ou immuno-détection des protéines. Les progrès récents en microscopie à fluorescence à champ large et confocale, dans les analyses de l’état-of-the-art image assistée par ordinateur en 3D et l’amélioration continue des méthodes moléculaires qui peuvent être utilisés sur des spécimens entiers minimalement transformés, a conduit à un besoin de techniques de traitement efficace et un minimum l’échantillon qui sont préférentiellement se prêtent à des analyses quantitatives. Ces dernières années, des progrès significatifs accomplis dans le développement de techniques de compensation sur les animaux spécimen entier-montent. Ils rendent l’échantillon transparent soit en utilisant des réactifs aqueux ou sucre-base d’urée (p. ex., échelle, SeeDB, cubique)^18,19,20, soit en supprimant sélectivement les lipides (en utilisant le détergent SDS) après incorporant des échantillons dans les hydrogels stables ; l’élimination des lipides peut être atteint soit par diffusion passive (p. ex., modification clarté protocole²¹, Pacte-PARS-jantes²²) ou activement par électrophorèse (original clarté protocole²³ et²⁴de la loi-PRESTO). Encouragée par ces progrès rapides, certaines techniques dérivées apparaissent également pour utilisation dans les usines.

Dans cet article de méthodes axé sur le modèle Arabidopsis, nous décrivons la procédure pour la dissection correcte des boutons floraux, les fleurs et les siliques jeunes et l’enlèvement des échantillons entiers pour colorer diverses et les procédures d’observation à l’aide classique ou d’une méthode axée sur le SDS clairière récente. Exemples d’amidon, callose et coloration de la chromatine sont donnés. Bien que ces procédures peuvent besoin de plus d’améliorations et adaptations lorsqu’il est utilisé avec d’autres espèces, nous espérons qu’ils préparera le terrain pour des recherches ultérieures sur ces méthodes simples mais essentielles qui constituent le point de départ de nombreux projets de recherche.

Protocole

1. fleur et la Fixation de la Silique

1. Récolte de fleurs et siliques de plantes synchronisés lors de l’ouverture de la première fleur.
   Remarque : Dans les conditions expérimentales utilisées ici, les plantes commencent à fleurir environ 21 jours après la transplantation de Murashige et Skoog (MS) des dalles au sol. Graines sont stratifiées pour 3 à 4 jours à 4 ° C et germent/cultivés sur MS plaques à 22 ° C/16 h de lumière et 18 ° C/8 h sombre pendant 8 à 10 jours, avant de transplanter les plants sur un sol riche en éléments nutritifs dans des pots maintenus dans les mêmes conditions (Figure 1). Le nombre de répétitions dépend de l’objectif spécifique de recherche, mais un minimum de 5 inflorescences (à partir de 5 plantes individuelles) pour chaque traitement est recommandé. Si les fleurs sont l’unité expérimentale, un minimum de 10 fleurs par réplicat est recommandé.
2. Couper les inflorescences ou fleurs (Figure 1E-H) à l’aide de petits ciseaux (p. ex., ciseaux à ongles) et les placer immédiatement dans un tube de microcentrifuge (pour la fixation de l’inflorescence/fleur simple) ou un tube conique (pour fixations collectives) fraîchement faite de Carnoy, méthanol/acétique ou FPA50 fixateurs (selon l’application, voir ci-dessous) sur la glace.
   NOTE : Les échantillons devraient être totalement immergés dans le fixateur.
3. Laisser le tissu dans le fixateur pendant 4 h passer la nuit à 4 ° C.
   Remarque : L’infiltration sous vide peut être utilisée pour accélérer la pénétration du fixateur dans le tissu, mais cela risque de nuire à la préservation de la structure du tissu. Les auteurs n’implémentent pas d’infiltration sous vide.
4. Retirer le fixateur, ajouter assez d’éthanol 70 % pour couvrir les échantillons et renvoyez-les à 4 ° C pendant au moins 24 h. les échantillons peuvent rester indéfiniment dans cette solution. Après avoir retiré l’éthanol, procéder immédiatement à l’étape suivante ; dissection ou compensation de SDS.

2. dissection sous le stéréomicroscope

1. Mettez fraîchement 70 % éthanol en verre d’un horloger placé sur une petite boîte de Pétri pour soutien.
2. Lieu l’inflorescence/fleur/silique là-dessus a fraîchement fait fixateur et disséquer sous le stéréomicroscope à l’aide de forceps et une seringue avec une aiguille.
   1. Utiliser d’un horloger verre ou un appareil similaire qui permet aux échantillons d’être totalement couverte avec de l’éthanol (recommandé) pour la dissection des inflorescences et déchirer les organes floraux, des fleurs matures (sépales, pétales et étamines peuvent être disséqués à ce stade ) pour éviter le risque de dessèchement des échantillons.
3. Disséquer les siliques et petits boutons de fleurs sur une lame comme indiqué ci-dessous.
   1. Mettre de côté en verre de l’horloger avec échantillons prétraitées et utiliser une lame normale pour la dissection finale.
   2. L’exemple de l’intérêt à la diapositive et ajoutez 10 µL d’éthanol à 70 % frais. Travailler rapidement sur la dissection finale et ajouter 10 µL d’éthanol, si nécessaire, pour garder l’échantillon humide sans excès de liquide.
   3. Pour libérer les grains de pollen des étamines, reportez-vous à l’étape 5.1. Pour disséquer les carpelles et les ovules, suivez la procédure décrite à la Figure 2. Cette procédure s’applique à tous les stades de développement du carpelle, y compris le stade de développement de siliques vertes.
      Remarque : N’ajoutez pas l’éthanol s’il y a suffisant au report de l’éthanol ne bougent les échantillons ; dissection de très petits échantillons est beaucoup plus facile à une quantité minimale de liquide. Toujours garder seulement les organes d’intérêt (sépales, pétales, étamines, carpelles, ovules, graines ou grains de pollen) sur la diapositive. Cette procédure assurera une épaisseur uniforme entre la lame et lamelle, correspondant à l’épaisseur de l’organe en cours d’examen, ce qui entraîne une homogénéité supérieure et donc l’efficacité pour des examens au microscope (plus grand nombre de spécimens de la cible dans le même plan focal).
4. Utiliser un petit morceau de papier buvard pour absorber et éliminer autant que possible d’éthanol. Procéder rapidement à l’étape suivante (sections 3, 4 ou 6) avant l’assèchement de l’échantillon des.

3. Hydrate de Chloral-basé de compensation et de coloration combinée à compensation

NOTE : Les meilleurs résultats pour compensation basée sur l’hydrate de chloral sont obtenus avec FPA50 fixé le matériel.

1. Place 20 µL de solution de compensation (hydrate de chloral/glycérol, modification moyenne de Hoyer, 4½ de Herr ou solutions de IKI-4½ de Herr) sur la diapositive de spécimen-roulement. À l’aide d’une paire de seringues avec aiguilles hypodermiques, placez les échantillons selon le besoin en réduisant l’espace entre eux et renversant celles où l’organe d’intérêt fait face vers le bas. Supprimer toute bulle d’air restante à l’aide de l’aiguille.
2. Abaisser un lamelle couvre-objet sur le côté et doucement le placer, en appuyant très légèrement et attendre que la solution de compensation remplit l’espace entre les deux. Ajouter la solution de compensation minimale, si nécessaire, pour remplir tout l’espace sous la lamelle.
3. Placer la lame sur un support Dia et laissez-le sous la hotte. Procéder à l’observation au microscope après au moins 4 h et Pendant les 4 à 5 jours suivants.

4. combiné Alexander de coloration et Herr 4½ compensation des anthères

NOTE : Le protocole original de Alexander repose sur la libération des grains de pollen sur la diapositive avant la coloration. Un efficace et plus informatif, modifiés Alexander coloration et procédure de compensation sont la coloration des grains de pollen mûrs dans les anthères matures mais non-déhiscent.

1. Choisissez fraîchement récoltés floraux qui sont sur le point d’ouvrir avec des anthères non-déhiscent.
   NOTE : Ne prenez pas plus jeunes boutons floraux car Alexander coloration est destiné à des grains de pollen matures et ne tache pas efficacement les grains de pollen immatures. Un minimum de 5 fleurs par récoltées sur des inflorescences et des différentes usines de traitement est recommandé.
2. Préparer une plaque à 96 puits avec une solution d’assez Alexandre de submerger un bourgeon de fleur. Exposer les anthères en enlevant les sépales et les pétales et les plonger dans une solution d’Alexandre. Conserver les échantillons sous la hotte pendant 1 à 3 h.
3. Remplacer la solution d’Alexandre avec solution 4½ de Herr et placer la plaque multipuite sous la hotte pour une incubation d’une nuit ou plus.
4. À l’aide de pinces, déplacez doucement les boutons floraux dégagé sur une nouvelle diapositive. Puisque certains report d’une solution d’Alexandre peut se produire, utiliser un papier buvard pour enlever autant solution de compensation possible.
5. Disséquer les étamines et supprimer tous les autres tissus. Suivez les étapes décrites dans l’article 3 à l’aide de la solution 4½ de Herr.

5. Retirer les Grains de Pollen de l’Exine

Remarque : Nous recommandons d’utiliser le fixateur de Carnoy pour coloration DAPI.

1. Suivez les procédures de fixation et la dissection décrites aux paragraphes 1 et 2. Maintenant, on devrait avoir un à nombreuses étamines sur la diapositive dans un minimum de 70 % d’éthanol.
2. Utiliser un papier absorbant pour enlever l’excès d’éthanol et ajouter 5 à 10 µL de solution DAPI. À l’aide de deux seringues avec aiguilles, libérer les grains de pollen au sein de cette petite quantité de solution (par exemple, utiliser une seringue pour immobiliser l’étamine et l’autre pour libérer les grains de pollen). Ajouter un autre 5 µL de DAPI si la solution se dessèche.
3. Enlever tous les débris de l’étamine est une étape critique, telle que seulement les grains de pollen sont laissés entre la lame et la lamelle.
4. Placez un lamelle couvre-objet sur la diapositive de spécimen portant en l’abaissant sur le côté et ajouter la quantité minimale de solution DAPI requise pour remplir l’espace. Placez un index sur la lamelle couvre-objet, et sans les écraser trop beaucoup faire un rapide, ferme et court mouvement de glissement.
   Remarque : Pour mesurer la force nécessaire et l’amplitude du mouvement coulissant, cette étape doit être pratiquée plusieurs fois, vérifiant les résultats chaque fois sous le microscope.
5. Verser la solution DAPI si nécessaire et améliorer la diapositive dans une zone humide dans l’obscurité à 4 ° C pendant 15 min à 1 h. continuer d’observer des échantillons sous fluorescence grand-angulaire ou microscopie confocale dans les 24 h. essayer de combiner cette procédure avec SDS compensation pour vérifier si il y a plus de place ments peuvent être obtenues.

6. dodécylsulfate de sodium (SDS) de compensation

Remarque : Selon l’organe floral à analyser et sur les compétences du chercheur à disséquer très douces et les plus petits spécimens, le traitement SDS peut être effectué avant (pour des chercheurs expérimentés) ou après la dissection étape (pour les moins expérimentés les chercheurs) sur méthanol-acide acétique fixé matériel.

1. Utiliser le verre d’un horloger, une lame concave ou un tube de microcentrifuge à incuber les échantillons disséqués ou non disséqué dans 1 % SDS et 0,2 solution de NaOH N du jour au lendemain à la température ambiante.
2. Manipulez-les avec précaution parce que l’échantillon est très doux et a un aspect transparent. Rincer plusieurs fois avec de l’eau.
   NOTE : Restes de la solution SDS pourraient conduire à la précipitation lors de l’ajout de la solution colorante, par exemple, bleu d’aniline.
3. Pour les échantillons non disséqué, suivez la procédure de dissection décrite à l’article 2, à l’aide de l’eau au lieu de l’éthanol à 70 %. Après dissection du tissu souhaité, enlever des restes et débris et tout surplus d’eau avec un papier absorbant, puis ajouter 20 – 40 µL de solution colorante et passez à l’étape 6.5.
4. Pour les échantillons disséqués, soigneusement passer l’échantillon de la solution de lavage et le placer sur une lame propre et ajouter 20 – 40 µL de solution colorante.
5. Placez délicatement un lamelle couvre-objet sur la diapositive en l’abaissant sur le côté. Prendre soin de ne pas pour écraser la préparation. Si le tissu est trop mou, lieu toute mince séparateur entre la lame et la lamelle à ses angles(par exemple, ruban adhésif ou une lamelle cassée), laissant un espace chambre entre lame et lamelle, telle que la lamelle n’est pas écraser l’échantillon.
6. Placez toutes les diapositives d’une zone humide, couvrez-la de papier d’aluminium et placez-le à 4 ° C pendant au moins 1 h. continuer à observer l’échantillon à l’aide de widefield fluorescence ou microscopie confocale sous 24h.

Résultats

Arabidopsis appartient à la famille des Brassicacées, portant des inflorescences avec des fleurs bisexuées, disposées en corymbe (Figure 1). Chaque fleur comporte quatre sépales, quatre pétales, six étamines (quatre de long et deux courts) et un gynécée syncarpe constitué de deux carpelles congénitalement fusionnés (Figure 1F-H) disposées en verticilles concentriques quatre^...

Discussion

L’existence de nombreux boutons floraux au sein d’une inflorescence unique de l' Arabidopsis, couvrant toutes les étapes du développement de fleur, offre une occasion unique pour les études visant à caractériser l’effet d’un traitement ou d’une caractéristique du développement en même temps à travers les différentes étapes du développement floral. Un bon point de référence entre les différentes plantes individuelles est l’ouverture de la première fleur de l’inflorescence principale....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.