Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول مختلف التقنيات اللازمة مجهر إلكتروني بما في ذلك صبغة سلبية، وتمزيقها سامسونج للهيكل المفصل، ووضع العلامات لتحديد مواقف محددة من البروتينات في اكسوسوميس المناعية والذهب.

Abstract

اكسوسوميس هي حويصلات خارج الخلية نانو الحجم يفرزها سوائل الجسم، ومن المعروف أن تمثل خصائص الخلايا التي تفرز لهم. وتعكس محتويات ومورفولوجية الحويصلات يفرز سلوك الخلية أو الحالة الفسيولوجية، على سبيل المثال نمو الخلايا، والهجرة والانقسام، والموت. قد يتوقف دور اكسوسوميس عاليا في الحجم، ويختلف حجم اكسوسوميس من 30 إلى 300 نانومتر. الأسلوب الأكثر استخداماً لتصوير اكسوسومي تلطيخ سلبية، في حين تستند النتائج الأخرى في البرد مجهر إلكتروني، وفحص المجهر الإلكتروني، ومجهر القوة الذرية. مورفولوجيا اكسوسومي نموذجية لتقييمها عن طريق تلطيخ السلبي شكل كوب، ولكن المزيد من التفاصيل ليست واضحة بعد. اكسوسومي تتسم جيدا من خلال دراسة الهيكلية اللازمة خاصة في المجالات الطبية والصيدلانية. ولذلك، ينبغي التحقق من مورفولوجيا تعتمد على الدالة بتقنيات الميكروسكوب الإلكتروني مثل وسم بروتين محددة في هيكل اكسوسومي مفصلة. لمراقبة الهيكل المفصل، قورنت سامسونج مقطعة والصور السلبية الملون من اكسوسوميس. ونقترح في هذا البروتوكول، مجهر إلكتروني لتصوير اكسوسوميس بما في ذلك صبغة سلبية وتلطيخ المناعية جبل كله وإعداد كتلة، قسم رقيقة ووسمها المناعية والذهب.

Introduction

حويصلات خارج الخلية (EVs) حويصلات بلير الدهن يفرز من الخلايا، ويتراوح حجمها بين 30 و 300 نانومتر. تم الإبلاغ عن المركبات الكهربائية أولاً في عام 1978، مع الأدلة من حويصلات من المرضى الذين يعانون من مرض هودجكن1. هذه الحويصلات أفيد بأن 40 إلى 120 نانومتر في الحجم. في عام 1980، أفيد بأن المركبات الكهربائية وتشارك في نظام تخثر وتجلط الدم، تشكيل تجلط الدم داخل الأوعية الدموية في مرضى السرطان2. بعد 30 عاماً، أبلغ المركبات الكهربائية لتكون عاملاً مهما لتعزيز غزو الورم، ومحصنة ضد الهرب، وتولد الأوعية3. وبالإضافة إلى ذلك، قد درست وظائف المركبات الكهربائية حسب المنظمين في التفاعلات الخلوية في المناطق من الالتهابات والاضطرابات المناعية والأمراض العصبية والسرطان4. المركبات الكهربائية تحتوي على الجزيئات الحيوية المحددة مثل البروتين، ومرناً، وميكرورنا5، إمكانية تطبيقها في التشخيص والمداواة منذ تم تحليلها6،7. المركبات الكهربائية فئة تتألف من مجموعات فرعية بما في ذلك اكسوسوميس، بروستاسوميس، أونكوسوميس، ديكسوسوميس، المجهرية الدقيقة، برومينينوسوميس، أرجوسوميس، وحويصلات مثل اكسوسومي، تبعاً للمنشأ الخلوي والوظيفة البيولوجية3. وبالإضافة إلى ذلك، استناداً على نشوء حيوي، يمكن تقسيم هذه المركبات إلى ميكروفيسيكليس (تسليط ميكروفيسيكليس، 100-1000 نيوتن متر) واكسوسوميس (30-300 نانومتر)8،9. ومن بين هذه أبلغ اكسوسومي وصفها محاورا خلية للسرطان11،12، الاستجابة المناعية10و13من الأمراض المعدية.

يتزايد الاهتمام في اكسوسوميس كالعلامات البيولوجية للتشخيص المبكر بسرعة، وتنقية وتوصيف اكسوسوميس يجب أن تقترن مع تقنيات التصوير الجزيئي. ويمكن تمييز بأحجام مختلفة ومورفولوجيس من اكسوسوميس، اعتماداً على الأصل والدالة14، باستخدام تقنيات الفحص المجهري بدقة عالية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني. معظم اكسوسوميس كانت تصور سلبي الملون انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)15،16،17، وتأكدت هذه النتائج قبل إيمونولابيلينج بروتين معين في حويصلة جبل كله 18-مجموعات بحثية عديدة أبلغت عن الهيكل من خلال "المسح الضوئي المجهر الإلكتروني" و "مجهر القوة الذرية"19،2021،Cryo-ال22. ومع ذلك، بينما هذه التقنيات مفيدة لدراسة هيكل اكسوسومي، هم غير كافية لمراقبة موقف محدد البروتينات الموجودة داخل اكسوسومي. ولذلك، قمنا بعرض بروتوكول للتصوير اكسوسوميس مع وضع العلامات المحددة للبروتين. قمنا بتطبيق إعداد كتلة وتمزيقها سامسونج، وإيمونوستاينينج للتحقق من موقع البروتين مفصلة في اكسوسومي. هذا كان مقارنة تلطيخ السلبية وكله جبل إيمونوستينينج، الذي يستخدم عادة لوصف اكسوسومي.

Protocol

1-كتلة إعداد، تمزيقها وتلطيخ والتصوير من اكسوسومي

  1. بيليه اكسوسوميس من المادة طافية الثقافة من خلايا HCT116 بالطرد المركزي في ز 100,000 x 1.5 ح23. إزالة ثقافة طافية وإصلاح بيليه اكسوسومي المنقي بعناية مع 1 مل من 2.5 ٪ glutaraldehyde في الحل كاكوديلاتي الصوديوم 0.1 M (pH 7.0) ح 1 في 4 درجات مئوية. كاكوديلاتي الصوديوم 0.1 M، إذابة حمض الكاكوديليك ز 4.28 في 160 مل ماء المقطر (DW). ضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.4 مع 0.1 M HCl ثم جعل يصل إلى 200 مل بالماء المقطر.
  2. إزالة مثبت وشطف الكريات مع 1 مل من المخزن المؤقت كاكوديلاتي الصوديوم 0.1 M في درجة حرارة الغرفة. كرر ثلاث مرات مع كل تغيير دائم 10 دقيقة.
  3. بعد إصلاح العينات مع 1 مل أكسيد الاوزميوم 2% ح 1 في 4 درجات مئوية.
  4. إزالة مثبت وشطف ثلاث مرات مع كاكوديلاتي الصوديوم 0.1 M المخزن المؤقت كل 10 دقيقة.
  5. احتضان لمدة 10 دقائق مع سلسلة متدرجة الأسيتون (50%، 60%، 70%، 80%، 90%، 95%، 100%، على التوالي) على شاكر.
  6. إزالة الأسيتون واحتضان الحل 3:1 الأسيتون: منخفض اللزوجة خليط التضمين لمدة 30 دقيقة. بيليه اكسوسومي في الأنبوب.
  7. إزالة المتوسطة وإضافة 1:1 الأسيتون: منخفضة اللزوجة التضمين خليط متوسطة، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة.
  8. إزالة المتوسطة وإضافة 1:3 الأسيتون: منخفض متوسط اللزوجة خليط التضمين، ثم احتضانها لمدة 30 دقيقة.
  9. إزالة المتوسطة وإضافة 100% منخفضة اللزوجة التضمين الخليط واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  10. تضمين العينة في نقية منخفضة اللزوجة التضمين المخلوط باستخدام التضمين العفن وخبز عن 24 ساعة عند 65 درجة مئوية.
  11. إعداد المقاطع مع 60 سمك شمال البحر الأبيض المتوسط من خلال الترا-مبضع.
  12. مزدوج-وصمة عار مع خلات اليورانيل 2% لمدة 20 دقيقة وتؤدي سترات لمدة 10 دقائق.
    لحل يؤدي رينولدز، إضافة 1.33 g من نترات الرصاص و 1.76 جم من سترات الصوديوم لما مجموعة 50 مل مقطر من الماء.
  13. مراقبة الشبكة تحت مجهر إلكتروني في 80 كيلو فولت.
  14. انقر فوق "الحصول على" ومن ثم انقر فوق "ملف" و "حفظ باسم" في نظام الكاميرا CCD تحت المجهر الإلكتروني في 80 كيلو فولت. اتبع الإعدادات التلقائية لوقت التعرض.

2-تلوين المناعية للمقاطع وتصوير (الشكل 1)

  1. قطع 60 نانومتر المقاطع سامسونج استخدام الترا-مبضع، وجمع على الشبكة النيكل.
  2. تبني شبكات في 50 ميليلتر قطرات من جليكاين 0.02 م لمدة 10 دقيقة إخماد مجموعات ألدهيد مجاناً.
  3. شطف في 100 ميكروليتر من دويتشه فيلة ثلاث مرات كل 10 دقيقة إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة ح 1 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة.
  4. تبني شبكات في 50-100 ميليلتر قطرات من مكافحة كرس جسم24 (1: 100 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة) ح 1 (إذا لزم الأمر، هذه الخطوة ينبغي أن يتم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.)
  5. غسل الشبكات مع خمس قطرات منفصلة (50 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة لمدة 10 دقائق.
  6. نقل الشبكات إلى قطرات من 2nd جسم ح 1 (الأرنب المضادة مترافق مفتش إلى 10 نانومتر الذهب الجسيمات (1: 100) في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة).
  7. شبكات المياه والصرف الصحي مع خمسة فصل قطرات (50 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني يحتوي على جيش صرب البوسنة 0.1% كل 10 دقائق.
  8. مزدوج-وصمة عار مع خلات اليورانيل 2% لمدة 20 دقيقة تحت ظروف مظلمة وسترات الرصاص رينولد لمدة 10 دقيقة، على التوالي.
  9. انقر فوق "الحصول على" ومن ثم انقر فوق "ملف" و "حفظ باسم" في نظام الكاميرا CCD تحت ال 80 كيلو فولت. زمن التعرض للضوء بعد الإعدادات التلقائية.

figure-protocol-3464
رقم 1: عملية إعداد العينة وإيمونوستاينينج- (أ) اكسوسومي ثابتة مزدوجة المجففة وتسلل مع اللزوجة منخفضة التضمين الراتنج المخلوط. (ب) الراتنج التضمين. (ج) قسم رقيقة جداً مع سكين الماس. (د) الإعداد لوضع العلامات المناعية والذهب. توضع الشبكات مع أقسام سامسونج قطرات السائل في بارافيلم، الذي يوضع مع منشفة ورقية رطبة. كل مقطع المحتضنة مع قطرات من 50-100 ميليلتر جسم، ثم غسلها مع المخزن المؤقت. (ه) ضعف تلطيخ مع خلات اليورانيل وتؤدي سترات. الغطاء مغطى برقائق الألومنيوم لتلوين المعادن الثقيلة. (و) تلطيخ الحل هو إزالة بواسطة ورق الترشيح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3-السلبية تلطيخ

  1. توهج التفريغ الفيلم رقيقة فورمفار/الكربون المغلفة مش النحاس 200 م الشبكات لمدة 1 دقيقة قبل مفرغ توهج.
  2. فيكس اكسوسوميس المنقي مع 1 مل 2% بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 5 دقائق.
    تنبيه: بارافورمالدهيد الأبخرة السامة. ينبغي أن يتم كل العمل في غطاء دخان التهوية.
  3. تحميل 5-7 ميليلتر اكسوسومي حل تعليق على الشبكة، واحتضان لمدة 1 دقيقة. إذا كان تركيز اكسوسومي مرتفع جداً، تخفف من التركيز على 1/2-1/5.
  4. فورا وصمة عار مع القطرات ~ 20 من 1% الذي تم تصفيته خلات (UA) اليورانيل على سطح الشبكة م بحقنه.
  5. إزالة الحل UA الزائدة على الشبكة عن طريق الاتصال على حافة الشبكة مع أوراق الترشيح.
  6. شطف بسرعة الشبكة مع قطره الماء. سيتم إزالة هذه الخطوة الحل المصبوغة الزائدة.
  7. ضع الشبكة على الطاولة بعقد مع ملاقط، وتغطية الشبكة جزئيا مع طبق ثقافة لتجف لمدة 10 دقائق تحت درجة حرارة الغرفة.
  8. تخزين الشبكة في مربع م شبكة للمراقبة المستقبلية التي ال 80 كيلو فولت.

4-كله جبل إيمونوستينينج

  1. توهج التفريغ الفيلم رقيقة فورمفار/الكربون المغلفة النحاس مش 200 م الشبكات لمدة 30 ثانية.
  2. فيكس اكسوسوميس المنقي مع 1 مل 2% بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 5 دقائق.
    تنبيه: بارافورمالدهيد الأبخرة السامة. ينبغي أن يتم كل العمل في غطاء دخان التهوية.
  3. تحميل ميليلتر 5-7 ثابتة حل اكسوسومي على الشبكة واحتضانها لأدنى 5 شطف مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات كل منها لمدة 10 دقائق.
  4. التعامل مع الشبكات مع 50 ميليلتر من جليكاين 0.05 متر مكعب لمدة 10 دقيقة إخماد مجموعات ألدهيد مجاناً.
  5. نقل الشبكات إلى هبوط حظر المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة) لمدة 30 دقيقة.
  6. تبني شبكات مع 50-100 ميليلتر المضادة لجسم PD-L1 (1: 100 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة) ح 1 (إذا لزم الأمر، هذه الخطوة ينبغي أن يتم في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها).
  7. أغسل الشبكة مع خمس قطرات منفصلة (50 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة لمدة 10 دقائق.
  8. نقل الشبكة إلى قطره 2nd جسم ح 1.
مفتش الماوس المضادة مترافق إلى 9-11 نانومتر الذهب الجسيمات تضعف في 1: 100 في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة.
  • أغسل الشبكة مع خمس قطرات منفصلة (50 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% جيش صرب البوسنة لمدة 10 دقائق. أغسل الشبكة مع نقطتين منفصلتين (50 ميليلتر) من دويتشه فيلة. أداء تلطيخ السلبية مع خلات اليورانيل 2% كما هو موضح من 3.4 إلى 3.8.
  • تخزين الشبكة في مربع م شبكة للمراقبة المستقبلية التي ال 80 كيلو فولت.

    • النتائج

    حاليا، يتم تصنيف اكسوسوميس في فئات الحجم والشكل مجهر إلكتروني. ويبين الشكل 2 سلبية الملون اكسوسومي والمناعة المسمى اكسوسومي في مركز جبل كله. ويبين الشكل 3 اكسوسومي مقطعة والمناعية المسمى اكسوسوميس بعد تقطيع رقيقة. تلطيخ المناعية والذهب ب?...

    Discussion

    تعرض هذه المقالة بروتوكول لمراقبة الهيكل اكسوسومي مفصلاً ووسم البروتينات المحددة لها. واعتبرت تلطيخ السلبية كأفضل طريقة لتصوير17اكسوسومي. وقد أظهرت هذه التقنية التقليدية هيكل على شكل كوب اكسوسوميس. ومع ذلك، هذا الشكل كأس شكل من أشكال الحرفية التي يمكن أن تحدث بسبب عملية التج...

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgements

    أيد هذه البحوث الحيوية & "برنامج تطوير التكنولوجيا الطبية" لمؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني) & التي تمولها الحكومة الكورية (مسيب & الاجتماعية) (رقم 2016M3A9B6904244). ونشكر أيضا أعضاء من مركز بحوث الأدوية بيوكونفيرجينسي لتنقية اكسوسومي.

    Materials

    NameCompanyCatalog NumberComments
    GlutaraldehydeEMS16200
    Sodium cacodylate EMS12300
    Osmium tetroxide 1 g crystalEMS19100Use only in fume hood
    acetoneJUNSEI1B2031
    Spurr mediumTED PELLA18108
    Ultra-microtomeLeicaUCT
    Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
    Lead citrateEMS17900
    Transmission Electron MicroscopyHitachiH7600
    nickel gridEMSG200-Ni
    Copper gridEMSG200-Cu
    glycineSIGMA022K5404
    Phosphate buffer salineSIGMAP4417
    Bovine serum albuminAurion25557
    1st Antibodypurification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) AntibodyBioLegend329710Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particlesigmaG7652
    silver paintCANSCTP100
    aluminum stubEMS75622
    FIB-SEMZeissAURIGA
    Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM2200FS
    Glow dischargerJEOLJFC1100E
    Carbon gridEMS121119
    ParaformaldehydeEMS19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)EMSFCF200-NI

    References

    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Explore More Articles

    131

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Privacy

    Terms of Use

    Policies

    Contact Us

    Recommend to library

    JoVE NEWSLETTERS

    Research

    Education

    Authors

    Librarians

    ABOUT JoVE

    Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved