Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı gerekli transmisyon elektron mikroskobu negatif boyama, ayrıntılı yapısı ve IMMUNO-altın spesifik proteinlerin konumlarda exosomes belirlemek için etiketleme için ultrathin kesit dahil olmak üzere için çeşitli teknikler açıklanır.

Özet

Exosomes hücre dışı veziküller nano boyutlu vücut sıvıları tarafından salgılanan vardır ve onları salgılar hücre özellikleri temsil etmek için bilinir. İçeriği ve salgılanan veziküller morfolojisi hücre davranış ya da fizyolojik durum, örneğin hücre büyümesi, geçiş, bölünme ve ölüm yansıtır. Exosomes rolü son derece boyutuna bağlı olabilir ve exosomes boyutu 30 ila 300'e değişir nm. En çok kullanılan eksozom görüntüleme için diğer sonuçlar Cryo-transmisyon elektron mikroskobu, elektron mikroskobu tarama ve Atomik kuvvet mikroskobu dayalı iken negatif boyama yöntemidir. Tipik eksozom'ın Morfoloji negatif boyama ile değerlendirildi, bir fincan şekli olmakla birlikte, daha fazla ayrıntılı bilgi henüz net değildir. Bir eksozom yapısal çalışma ile iyi karakterize gerekli özellikle de sağlık ve ilaç alanlar var. Bu nedenle, işlev bağımlı Morfoloji eksozom detaylı yapısında belirli bir protein etiketleme gibi elektron mikroskobu teknikleri tarafından doğrulanması gerekir. Ayrıntılı yapısı gözlemlemek için ultrathin kesitli görüntülerini ve exosomes negatif lekeli görüntüleri karşılaştırıldı. Bu protokol için iletim elektron mikroskopi exosomes negatif boyama, Bütün Dağı IMMUNO-boyama, blok hazırlık, ince bölüm ve IMMUNO-altın etiketleme gibi görüntüleme için öneririz.

Giriş

Ekstrasellüler veziküller (EVs) hücreleri tarafından salgılanan lipid bilayer veziküller vardır ve büyüklükleri 30 ve 300 nm arasında değişmektedir. EVs veziküller Hodgkin Hastaligi1hastalarda kanıt ile 1978 yılında ilk bildirildi. Bu veziküller 40-120 nanometre boyutunda bulunduğu rapor edilmiştir. 1980 yılında, bu EVs pıhtılaşma sistemi ve tromboz, bir damar kanseri hastalar2içinde bir kan pıhtısı oluşumu katılmaktadırlar bildirildi. 30 yıl sonra EVs tümör işgali, bağışıklık kaçış ve anjiogenezi3tanıtmak için önemli bir faktör olarak bildirilmiştir. Buna ek olarak, EVs fonksiyonları alanlarda hücresel etkileşimlerin iltihabı, bağışıklık bozukluğu, nörolojik hastalık ve kanser4düzenleyiciler olarak incelenmiştir. EVs protein, mRNA ve mikroRNA5gibi belirli biomolecules içerdiğinden, teşhis ve tedavi uygulama onların potansiyel analiz6,7oldu. EVs exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ve hücresel kökeni ve biyolojik fonksiyon3bağlı eksozom benzeri veziküller dahil olmak üzere alt gruplar oluşan bir kategori vardır. Buna ek olarak, onların Biyogenez üzerinde bağlı olarak, bu EVs microvesicles (döken microvesicles, 100-1000 nm) ve exosomes (30-300 nm)8,9bölünmüş olabilir. Bunlar arasında ya bir hücre iletişim bağışıklık yanıtı10, kanser11,12ve bulaşıcı hastalık13olarak bildirilmiştir.

Exosomes olarak bir biyomarker erken tanı için ilgi hızla artıyor ve arıtma ve exosomes karakterizasyonu moleküler görüntüleme teknikleri ile eşlik etmelidir. Farklı boyutlarda ve türleri exosomes, kendi kökeni ve işlev14, bağlı olarak, Morfoloji mikroskobu teknikleri gibi elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü tarafından ayrılır. Çoğu exosomes negatif lekeli transmisyon elektron mikroskobu (TEM)15,16,17tarafından görüntülenmiştir ve bu sonuçlar immunolabeling bütün Dağı vezikül içinde belirli bir protein tarafından teyit edildi 18. birkaç araştırma grubu aracılığıyla tarama elektron mikroskobu, Atomik kuvvet mikroskobu19,20ve Cryo-TEM21,22yapısı bildirdin. Ancak, bu teknikler eksozom yapısı eğitim için yararlı olsa da, ya içinde bulunan spesifik proteinlerin konumunu gözlemlemek için yetersiz bunlar. Bu nedenle, belirli protein etiketleme ile exosomes görüntüleme için bir protokol tanıttı. Biz blok hazırlanması, ultrathin kesit ve immunostaining protein'ın detaylı eksozom konumda ascertaining için uygulanır. Bu negatif boyama ve geleneksel eksozom karakterizasyonu için kullanılan bütün Dağı immunostaining ile karşılaştırıldı.

Protokol

1. blok hazırlık, kesit, boyama ve ya görüntüleme

  1. Santrifüjü 100.000 x g 1,5 saat23de tarafından gelen Kültür süpernatant HCT116 hücre exosomes cips. Kültür süpernatant kaldırmak ve dikkatle 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate çözüm (pH 7,0) 1 h 4 ° C'de % 2.5 oxazolidin ile arıtılmış eksozom Pelet düzeltmek 0.1 M sodyum cacodylate için 160 mL distile su (DW) 4,28 g Kakodilik asit geçiyoruz. PH 7.4 0,1 M HCl o zaman ilâ 200 mL distile su ile yapmak için ayarlayın.
  2. Sabitleştirici kaldırmak ve granül 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate arabelleği ile oda sıcaklığında durulayın. 10 dk süren her değişiklikle üç kez tekrarlayın.
  3. Sonrası 4 ° C'de % 2 Osmiyum tetroxide 1 h için 1 mL örnekleriyle düzeltmek
  4. Sabitleştirici kaldırmak ve durulama üç kez 0.1 M sodyum cacodylate ile tampon her 10 min.
  5. Kademeli aseton serisi ile 10 min için kuluçkaya (% 50, % 60, % 70, %80, % 90'ı, % 95, % 100, sırasıyla) shaker üzerinde.
  6. Aseton kaldırmak ve 3:1 aseton: düşük viskozite gömme karışımı 30 dk için çözüm kuluçkaya. Ya Pelet tüp var.
  7. Orta kaldırmak ve 1:1 aseton: düşük viskozite gömme karışımı orta ekleyin, sonra 30 dk için kuluçkaya.
  8. Orta kaldırmak ve 1:3 aseton: düşük viskozite gömme karışımı orta ekleyin, sonra 30 dk için kuluçkaya.
  9. Orta kaldırın ve % 100 karışımı katıştırma viskozitesi düşük ve gecede oda sıcaklığında kuluçkaya ekleyin.
  10. Örnek saf düşük viskozite 65 ° C'de 24 h için gömme kalıp ve fırında kullanarak karışımı katıştırma katıştırılmış
  11. Bir ultra-microtome üzerinden 60 nm kalınlı¤ında bölümleri hazırlayın.
  12. % 2 uranyl asetat için 20 dk ile çift-leke ve sitrat 10 min için yol.
    Reynolds götürmek eriyik için fazla 50 mL distile su ile 1.33 g kurşun nitrat ve sodyum sitrat 1.76 g ekleyin.
  13. Kılavuz 80, transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlemek kV.
  14. "Al" düğmesini tıklatın ve ardından "Dosya" ve "80, elektron mikroskobu altında CCD kamera sisteminde farklı kaydet" seçeneğini tıklatın kV. Otomatik ayarları pozlama süresi için izleyin.

2. IMMUNO-boyama bölümü ve görüntüleme (şekil 1)

  1. 60 nm ultrathin bölümleri bir ultra-microtome kullanarak kesme ve nikel ızgara üzerinde toplamak.
  2. 0,02 M glycine için ücretsiz aldehit gruplarını gidermek 10 dk 50 µL damla kılavuzlarda kuluçkaya.
  3. DW 100 μL içinde üç kez her 1s içinde % 1 BSA içeren PBS için oda sıcaklığında 10 dk. Incubate için durulayın.
  4. 50-100 µL damla KRS antikor24 (1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde) anti kılavuzlarda kuluçkaya 1 h (gerekirse, bu adım 4 ° C'de gecede yapılmalıdır.)
  5. 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, Izgaralar beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın.
  6. Izgaralar 2nd antikor için 1 h (Anti-tavşan IgG % 0,1 BSA içeren PBS 10 nm altın parçacık (1: 100) Birleşik) damla aktarın.
  7. Yıkama Izgaralar beş damla % 0,1 BSA içeren PBS (50 µL) her 10 dk ayırın.
  8. Çift-%2 uranyl asetat için karanlık koşullarda 20 dk ve Reynolds kurşun sitrat 10 dk, sırasıyla leke.
  9. "Al" düğmesini tıklatın ve ardından "Dosya" ve "80, TEM altında CCD kamera sisteminde farklı kaydet" seçeneğini tıklatın kV. Pozlama süresi otomatik ayarları izledi.

figure-protocol-3451
Şekil 1: sürecin numune hazırlama ve immunostaining. (A) Çift Kişilik sabit eksozom susuz ve düşük viskozite karışımı reçine katıştırma sızmış. (B) katıştırma reçine. (C) elmas bıçak ile Ultra ince bölümü. IMMUNO-altın etiketleme için (D) kurulum. Izgaralar ultrathin bölümleri ile ıslak kağıt havlu ile yerleştirilen bir parafilm üzerinde sıvı damlacıkları olarak konur. Her bölüm 50-100 µL antikor damlacıkları ile inkübe sonra arabellek ile yıkanır. (E) uranyl asetat ile boyama çift ve sitrat yol. Kapağı heavy metal boyama için alüminyum folyo ile kaplı. (F) çözüm boyama filtre kağıdı tarafından kaldırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. negatif boyama

  1. Parlaklık-ince formvar/karbon film kaplı 200 mesh bakır EM Izgaralar için 1dk kızdırma deşarj tarafından terhis edildi.
  2. % 2 ile 1 mL saf exosomes saptamak Paraformaldehyde (PFA) 5 min için.
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir. Tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  3. 5-7 µL eksozom süspansiyon çözüm ızgara üzerinde yük ve 1 dk. için kuluçkaya. Ya konsantrasyonu çok yüksek ise, konsantrasyon ile 1/2 - 1/5 oranında seyreltin.
  4. Hemen filtre uygulanan % 1'uranyl asetat (UA) çözüm EM ızgara yüzeyi şırınga tarafından ~ 20 damla ile leke.
  5. Aşırı UA çözüm çizgilerini kılavuz kenar filtre kağıdı ile irtibata geçerek kaldırın.
  6. Hızlı kılavuz bir damla su ile durulayın. Bu adımı aşırı boyama çözüm kaldırır.
  7. Izgarayı cımbızla tutup masaya koyun ve kılavuz altında oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya kısmen kültür yemeği ile kapsar.
  8. Kılavuz tarafından TEM 80, gelecekteki gözlem için bir EM kılavuz kutusunda saklamak kV.

4. bütün dağ Immunostaining için

  1. Parlaklık-deşarj ince formvar/karbon film kaplı 200 mesh bakır EM Izgaralar için 30 s.
  2. % 2 ile 1 mL saf exosomes saptamak Paraformaldehyde (PFA) 5 min için.
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir. Tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  3. 5-7 µL eksozom çözüm kılavuz üzerinde sabit yük ve 5 dk. için durulama ile 100 µL PBS, üç kez her 10 min için kuluçkaya.
  4. Izgaralar 0,05 M glycine için ücretsiz aldehit gruplarını gidermek 10 dk 50 µL ile tedavi.
  5. Izgaralar engelleme arabellek (%1 BSA içeren PBS) atmak için 30 dk aktarın.
  6. Izgaralar ile 50-100 µL PD-L1 antikor (1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde) anti 1 h (gerekirse, bu adım 4 ° C'de gecede yapılmalıdır) kuluçkaya.
  7. 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, kılavuz beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın.
  8. Kılavuz için 1 h 2nd antikor bir damla aktarın.
9-11, 1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde seyreltilmiş nm altın parçacık için anti-fare IgG Birleşik.
  • 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, kılavuz beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın. İki ayrı damla (50 µL) kılavuzla DW ile yıkayın. 3.4 3,8 için açıklandığı gibi % 2 uranyl asetat ile negatif boyama gerçekleştirmek.
  • Kılavuz tarafından TEM 80, gelecekteki gözlem için bir EM kılavuz kutusunda saklamak kV.

    • Sonuçlar

    Şu anda, exosomes transmisyon elektron mikroskobu tarafından boyutu ve şekli kategoride sınıflandırılır. Şekil 2 negatif lekeli eksozom ve bağışıklık etiketli eksozom tüm bağlama durumu gösterir. Şekil 3 kesitli eksozom ve immün etiketli exosomes ince kesit sonra gösterir. IMMUNO-altın belirli proteinlerin antikorları kullanarak boyama olumlu bir eksozom tanımlamak ve proteinler arasında eksozom türleri s...

    Tartışmalar

    Bu makalede ayrıntılı eksozom'ın yapısı gözlemleyerek ve onun belirli proteinlerin etiketleme için bir protokol sunar. Negatif boyama eksozom17görüntüleme için en iyi yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu geleneksel teknik exosomes Kupası şeklindeki yapı göstermiştir. Ancak, bu fincan şekli bir kurutma işlemi nedeniyle oluşan yapay doku biçimidir. Cryo-TEM sonuçları exosomes sulu çözüm25,26yılında tamamen kürese...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Bu araştırma Bio tarafından desteklenen & tıbbi teknoloji geliştirme programı Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) & Kore hükümeti tarafından finanse (MSIP & MOHW) (No. 2016M3A9B6904244). Biz de eksozom arıtma Medicinal Bioconvergence Araştırma Merkezi üyeleri teşekkür ederiz.

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    GlutaraldehydeEMS16200
    Sodium cacodylate EMS12300
    Osmium tetroxide 1 g crystalEMS19100Use only in fume hood
    acetoneJUNSEI1B2031
    Spurr mediumTED PELLA18108
    Ultra-microtomeLeicaUCT
    Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
    Lead citrateEMS17900
    Transmission Electron MicroscopyHitachiH7600
    nickel gridEMSG200-Ni
    Copper gridEMSG200-Cu
    glycineSIGMA022K5404
    Phosphate buffer salineSIGMAP4417
    Bovine serum albuminAurion25557
    1st Antibodypurification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) AntibodyBioLegend329710Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particlesigmaG7652
    silver paintCANSCTP100
    aluminum stubEMS75622
    FIB-SEMZeissAURIGA
    Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM2200FS
    Glow dischargerJEOLJFC1100E
    Carbon gridEMS121119
    ParaformaldehydeEMS19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)EMSFCF200-NI

    Referanslar

    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    H cresel biyolojisay 131yanegatif boyamaultramicrotomyIMMUNO boyamatransmisyon elektron mikroskobuh cre d vezik ller

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır