Preparación de la muestra y proyección de imagen de exosomas por microscopía electrónica de transmisión

Resumen

Este protocolo describe las diferentes técnicas necesarias para microscopía electrónica de transmisión como tinción negativa, seccionamiento ultrafino para estructura detallada y etiquetado para determinar las posiciones de proteínas específicas en exosomas de inmuno-oro.

Resumen

Exosomas son tamaño nanométrico vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporales y son conocidos para representar las características de las células que segregan les. El contenido y la morfología de las vesículas de secreción reflejan comportamiento celular o estado fisiológico, por ejemplo el crecimiento celular, migración, escote y la muerte. Papel de los exosomas altamente puede depender de tamaño y el tamaño de exosomas varía de 30 a 300 nm. El método más ampliamente utilizado para la proyección de imagen de exosomas es Tinción negativa, mientras que otros resultados se basan en microscopía electrónica de crio-transmisión, microscopía electrónica y microscopía de fuerza atómica. Morfología de los exosomas típico evaluado mediante tinción negativa es una forma de Copa, pero más detalles no están claros. Un exosomas bien caracterizados a través del estudio estructural es particularmente necesario en campos médicos y farmacéuticos. Por lo tanto, morfología dependiente de la función debe ser verificada mediante técnicas de microscopía electrónica como una proteína específica en la estructura detallada de exosomas de etiquetado. Para la observación detallada de la estructura, se compararon imágenes seccionados ultrafinos y negativa teñida de exosomas. En este protocolo, sugerimos microscopía electrónica de transmisión para la proyección de imagen de exosomas como tinción negativa, todo Monte inmuno-tinción, preparación de bloque, sección delgada y etiquetado inmuno-oro.

Introducción

Las vesículas extracelulares (EVs) son vesículas bicapa de lípidos secretadas por las células y su tamaño oscila entre 30 y 300 nm. EVs primero fueron divulgado en 1978, con la evidencia de las vesículas de los pacientes con enfermedad de Hodgkin¹. Estas vesículas se informaron que 40 a 120 nanómetros de tamaño. En 1980, se informó que EVs están involucrado en el sistema de coagulación y trombosis, formación de un coágulo de sangre dentro de un vaso sanguíneo en los pacientes de cáncer². Después de 30 años, EVs se han divulgado para ser un factor importante para promover la invasión del tumor, escape inmune y angiogénesis³. Además, las funciones de los vehículos eléctricos han sido estudiadas como reguladores de las interacciones celulares en las áreas de inflamación, desorden inmune, enfermedades neurológicas y cáncer⁴. Ya EVs contienen biomoléculas específicas como proteínas, mRNA y microRNA⁵, su potencial aplicación en el diagnóstico y la terapéutica ha sido analizado^6,7. EVs es una categoría conformada por subgrupos incluyendo exosomas prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes y vesículas de exosomas-como, según su origen celular y función biológica³. Además, basado en su biogénesis, estos EVs pueden dividirse en microvesículas (vertiente microvesículas, 100-1000 nm) y exosomas (30-300 nm)^8,9. Entre estos, los exosomas se ha divulgado como un comunicador celular respuesta inmune¹⁰, cáncer^11,12y¹³de enfermedades infecciosas.

Interés en los exosomas como un biomarcador para el diagnóstico precoz está aumentando rápidamente, y la purificación y caracterización de exosomas deben ir acompañados de las técnicas de imagen moleculares. Los diferentes tamaños y morfologías de exosomas, dependiendo de su origen y función¹⁴, pueden distinguirse por técnicas de microscopía de alta resolución, tales como microscopia electrónica. Mayoría de exosomas fueron visualizados por tinción negativa la microscopia electrónica de transmisión (TEM)^15,16,17, y estos resultados fueron confirmados por inmunomarcación de una proteína específica en Monte toda vesícula ¹⁸. varios grupos de investigación han divulgado la estructura a través de microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica^19,20y crio-TEM^21,22. Sin embargo, aunque estas técnicas son útiles para estudiar la estructura de exosomas, que son insuficientes para observar la posición de las proteínas específicas ubicadas dentro de los exosomas. Por lo tanto, hemos introducido un protocolo de exosomas con una proteína específica etiquetado de la imagen. Aplicamos el bloque preparación, seccionamiento ultrafino y el immunostaining para determinar la ubicación detallada de la proteína en los exosomas. Esto se comparó con tinción negativa y todo immunostaining de Monte, que se utiliza tradicionalmente para la caracterización de los exosomas.

Protocolo

1. bloque preparación, corte, coloración y proyección de imagen de los exosomas

1. Los exosomas de sobrenadante de cultivo de células HCT116 de pellets por centrifugación a 100.000 x g durante 1,5 h²³. Quite el sobrenadante del cultivo y cuidadosamente la pelotilla de exosomas purificada con 1 mL de glutaraldehído al 2.5% en solución de cacodilato de sodio de 0.1 M (pH 7.0) por 1 h a 4 ° C. De cacodilato de sodio de 0.1 M, disolver ácido cacodílico 4,28 g en 160 mL de agua destilada (DW). Ajustar el pH a 7,4 con 0.1 M HCl luego realizar hasta 200 mL con agua destilada.
2. Retirar el fijador y lavar el pellet con 1 mL de buffer de cacodilato de sodio de 0,1 M a temperatura ambiente. Repetir tres veces con cada cambio dura 10 minutos.
3. -Fijar las muestras con 1 mL de tetróxido de osmio 2% durante 1 h a 4 ° C.
4. Retirar el fijador y el enjuague tres veces con cacodilato de sodio de 0.1 M tampón cada 10 minutos.
5. Incubar por 10 min con una serie graduada de acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) en el agitador.
6. Eliminar la acetona e incubar la solución de mezcla empotrable de 3:1 acetona: baja viscosidad durante 30 minutos. El diábolo de exosomas está en el tubo.
7. Quitarlo del medio y añadir 1:1 acetona: baja viscosidad empotrar mezcla media, luego incubar por 30 min.
8. Quitarlo del medio y añadir 1:3 acetona: baja viscosidad empotrar mezcla media, luego incubar por 30 min.
9. Quite el medio y añadir 100% baja viscosidad mezcla de incrustación e incubar durante una noche a temperatura ambiente.
10. Embeber la muestra en pura baja viscosidad incrustación de mezcla con el molde y cocer al horno empotrar durante 24 h a 65 ° C.
11. Prepare secciones con espesor de nm 60 a través de un ultra micrótomo.
12. Doble tinción con acetato de uranilo 2% por 20 min y llevar citrato durante 10 minutos.
    Para la solución de plomo de Reynolds, añadir 1,33 g de nitrato de plomo y 1,76 g de citrato de sodio a un total de 50 mL de agua destilada.
13. Observar la cuadrícula bajo microscopía electrónica de transmisión 80 kV.
14. Haga clic en "Adquirir" y haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara bajo el microscopio electrónico de 80 kV. Siguen ajustes automáticos para el tiempo de exposición.

2. inmuno-tinción de secciones y la proyección de imagen (figura 1)

1. Cortar secciones ultradelgadas de 60 nm usando un micrótomo de ultra y recoger en la red de níquel.
2. Incubar las rejillas en gotas de 50 μl de 0.02 M de glicina por 10 min calmar los grupos aldehído libres.
3. Enjuague en 100 μL de DW tres veces cada uno durante 10 minutos incubar a temperatura ambiente durante 1 h en PBS con 1% de BSA.
4. Incubar rejillas en 50-100 gotas de μl de anti KRS anticuerpo²⁴ (1: 100 en PBS con un 0.1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, que este paso debe llevarse a cabo a 4 ° C durante la noche.)
5. Lave las rejillas con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA durante 10 minutos.
6. Rejillas de transferencia con gotas de 2^nd anticuerpo para 1 h (anti-conejo IgG conjugada con partículas de oro nm 10 (1: 100) en PBS con un 0.1% de BSA).
7. Lave las rejillas con cinco separan gotas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA cada 10 minutos.
8. Doble tinción con acetato de uranilo 2% durante 20 minutos bajo condiciones de oscuridad y citrato de plomo de Reynold durante 10 min, respectivamente.
9. Haga clic en "Adquirir" y haga clic en "Archivo" y "Guardar como" en el sistema de cámara bajo un TEM a 80 kV. Tiempo de exposición había seguido de ajustes automáticos.

Figura 1: proceso de preparación de la muestra y el immunostaining. (A) doble fijo exosomas se deshidrata y se infiltraron con baja viscosidad, incrustación de resina de mezcla. (B) resina, incrustación. (C) sección ultra delgada con cuchilla de diamante. (D) instalación de etiquetado inmuno-oro. Las rejillas con las secciones ultrafinas se ponen en las gotitas líquidas en un parafilm, que se coloca con la toalla de papel húmeda. Cada sección es incubada con gotitas de anticuerpo de 50-100 μl, luego lavado con tampón. (E) doble tinción con acetato de uranilo y citrato de plomo. La tapa se cubre con papel de aluminio para la tinción de metales pesados. (F) solución de tinción se elimina por el filtro de papel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Tinción negativa

1. La película de formvar/carbón fino de descarga del resplandor cubrió 200 rejillas de malla de cobre EM durante 1 minuto por descargador de resplandor.
2. Fijar exosomas purificada con 1 mL de 2% paraformaldehido (PFA) durante 5 minutos.
   PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos. Todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada.
3. Solución de suspensión 5-7 μl exosomas en la parrilla de carga e incubar durante 1 minuto. Si la concentración de exosomas es demasiado alta, diluir la concentración a 1/2 - 1/5.
4. Inmediatamente la mancha con el ~ 20 gotas de filtrado solución al 1% uranilo acetato (UA) en la superficie de la rejilla de EM por jeringa.
5. Retire el exceso de solución UA en la parrilla poniéndose en contacto con el borde de la rejilla con papel de filtro.
6. Enjuague rápidamente la rejilla con una gota de agua. Este paso eliminará el exceso de tinción solución.
7. Coloque la rejilla sobre la mesa sujetando con las pinzas y cubrir la cuadrícula parcialmente con una placa de cultivo se seque durante 10 minutos en temperatura ambiente.
8. Almacenar la red en una caja de rejilla de EM para futura observación por un TEM a 80 kV.

4. todo montaje para la inmunotinción

1. La película de formvar/carbón fino de descarga del resplandor cubrió 200 rejillas de malla de cobre EM 30 s.
2. Fijar exosomas purificada con 1 mL de 2% paraformaldehido (PFA) durante 5 minutos.
   PRECAUCIÓN: Los vapores de paraformaldehido son tóxicos. Todo trabajo debe hacerse de una campana ventilada.
3. 5-7 μl solución de exosomas fijo en la parrilla de carga e incube durante 5 minutos enjuague con 100 μl de PBS tres veces cada uno durante 10 minutos.
4. Tratamiento de rejillas con 50 μl de 0.05 M de glicina por 10 min calmar los grupos aldehído libres.
5. Transferencia de rejillas a una gota de solución amortiguadora de bloqueo (PBS con 1% BSA) durante 30 minutos.
6. Incubar rejillas con 50-100 μl anti anticuerpo PD-L1 (1: 100 en PBS con un 0.1% de BSA) durante 1 h (si es necesario, que este paso debe llevarse a cabo a 4 ° C durante la noche).
7. Lavar la rejilla con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA durante 10 minutos.
8. Transferencia de red a una gota de anticuerpo de^nd 2 durante 1 hora.

Anti-ratón IgG conjugado con partículas de oro de nm de 9-11 diluido al 1: 100 en PBS con un 0.1% de BSA.

Lavar la rejilla con cinco gotas separadas (50 μL) de PBS con un 0.1% de BSA durante 10 minutos. Lave la rejilla con dos gotas separadas (50 μL) de DW. Realizar la tinción negativa con acetato de uranilo 2% como se ha descrito de 3.4 a 3.8.

Almacenar la red en una caja de rejilla de EM para futura observación por un TEM a 80 kV.

Resultados

En la actualidad, exosomas se clasifican en categorías de tamaño y forma por microscopía electrónica de transmisión. La figura 2 muestra negativa teñida de exosomas y etiquetada inmune exosomas en el Monte todo Estado. La figura 3 muestra los exosomas seccionado y el inmuno-etiquetado exosomas después de secciones delgadas. Tinción de inmuno-oro utilizando anticuerpos de proteínas específicas se usa positivamente un exo...

Discusión

Este artículo presenta un protocolo para observar la estructura de los exosomas detallada y etiquetado de sus proteínas específicas. Tinción negativa ha sido considerado como el mejor método de exosomas imagen¹⁷. Esta técnica convencional ha mostrado estructura en forma de Copa de exosomas. Sin embargo, esta forma de la taza es la forma del artefacto que puede ocurrir debido al proceso de secado. Crio-TEM resultados han mostrado que los exosomas tienen una estructura perfectamente esférica ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 1 g crystal	EMS	19100	Use only in fume hood
acetone	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-microtome	Leica	UCT
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	H7600
nickel grid	EMS	G200-Ni
Copper grid	EMS	G200-Cu
glycine	SIGMA	022K5404
Phosphate buffer saline	SIGMA	P4417
Bovine serum albumin	Aurion	25557
1st Antibody			purification in manually
Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody	BioLegend	329710	Whole mount Immumogold
Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl	BioLegend	401202	Whole mount Immumogold (Control)
2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle	sigma	G7652
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM2200FS
Glow discharger	JEOL	JFC1100E
Carbon grid	EMS	121119
Paraformaldehyde	EMS	19210
Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)	EMS	FCF200-NI