Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Résumé

Ce protocole décrit les différentes techniques nécessaires à la microscopie électronique en transmission dont une coloration négative, coupes ultraminces pour structure détaillée et l’immuno-or étiquetage afin de déterminer les positions des protéines spécifiques dans les exosomes.

Résumé

Exosomes sont de taille nanométrique des vésicules extracellulaires sécrétées par les fluides corporels et sont connus pour représenter les caractéristiques des cellules qui sécrètent les. Le contenu et la morphologie des vésicules sécrétées reflètent le comportement cellulaire ou l’état physiologique, par exemple la croissance cellulaire, migration, clivage et la mort. Rôle des exosomes peut dépendre fortement de taille, et la taille des exosomes varie de 30 à 300 nm. La méthode la plus utilisée pour l’imagerie de l’exosome est une coloration négative, tandis que les autres résultats sont basés sur la microscopie à Force atomique, microscopie électronique à balayage et Cryo-microscopie électronique. Morphologie de l’exosome typique évaluée au moyen d’une coloration négative est une forme de coupe, mais davantage de détails ne sont pas encore claires. L’exosome bien caractérisée par l’étude structurelle est nécessaire notamment dans le domaine médical et pharmaceutique. Par conséquent, morphologie fonction dépendant doit être vérifiée par des techniques de microscopie électronique tels que l’étiquetage d’une protéine spécifique dans la structure détaillée de l’exosome. Pour observer la structure détaillée, images coupes ultraminces et images colorées négatives des exosomes ont été comparés. Dans ce protocole, nous vous suggérons de microscopie électronique à transmission pour l’imagerie des exosomes dont une coloration négative toute monture immunomarquage, préparation de bloc, lame mince et étiquetage immuno-or.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules de bicouche lipidique sécrétées par les cellules, et leur taille varie entre 30 et 300 nm. EVs ont été pour la première fois en 1978, avec preuve de vésicules des patients atteints de maladie de Hodgkin¹. Ces vésicules ont été signalés à être 40 à 120 nanomètres dans la taille. En 1980, il a été signalé que les EVs sont impliqués dans le système de coagulation et de la thrombose, la formation d’un caillot de sang à l’intérieur d’un vaisseau sanguin dans le cancer patients². Après 30 ans, les EVs ont été signalés à être un facteur important pour promouvoir l’invasion tumorale, évasion immunitaire et angiogenèse³. En outre, les fonctions du serveur virtuel Exchange ont été étudiées comme régulateurs dans les interactions cellulaires dans les domaines de l’inflammation, troubles immunitaires, maladie neurologique et le cancer⁴. Puisque EVs contiennent des biomolécules spécifiques tels que des protéines, ARNm et des micro-ARN⁵, leur application potentielle dans le diagnostic et la thérapeutique a été analysé^6,7. Véhicules électriques constituent une catégorie composée des sous-groupes dont les exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticules, promininosomes, argosomes et vésicules exosome semblable, selon leur origine cellulaire et leur fonction biologique³. En outre, basé sur leur biogenèse, ces EVs peuvent être divisés en microvésicules (hangar microvésicules, 100-1000 nm) et exosomes (30-300 nm)^8,9. Parmi ceux-ci, l’exosome a été signalé comme un communicateur cellulaire pour¹⁰de la réponse immunitaire, cancer^11,12et maladies infectieuses¹³.

Intérêt pour les exosomes comme biomarqueurs pour diagnostic précoce augmente rapidement, et la purification et la caractérisation des exosomes doivent s’accompagner avec des techniques d’imagerie moléculaires. Les différentes tailles et morphologies des exosomes, selon leur origine et fonction¹⁴, se distingués par des techniques de microscopie à haute résolution, telles que la microscopie électronique. La plupart exosomes ont été visualisées par négatifs colorés microscopie électronique à Transmission (TEM)^15,16,17, et ces résultats sont confirmés par immunomarquage d’une protéine spécifique dans la vésicule de support entier ¹⁸. plusieurs groupes de recherche ont rapporté la structure par microscopie électronique à balayage, microscopie à Force atomique^19,20et Cryo-TEM^21,22. Cependant, bien que ces techniques sont utiles pour étudier la structure de l’exosome, elles sont insuffisantes pour observer la position des protéines spécifiques situés à l’intérieur de l’exosome. Par conséquent, nous vous présentions un protocole d’imagerie exosomes avec l’étiquetage d’une protéine spécifique. Nous avons appliqué la préparation du bloc, coupes ultraminces et immunostaining pour déterminer l’emplacement détaillé de la protéine dans l’exosome. Cela a été comparé avec une coloration négative et toute monture immunomarquage, qui est traditionnellement utilisée pour la caractérisation de l’exosome.

Protocole

1. bloc préparation, coupes, coloration et d’imagerie de l’Exosome

1. Pellet les exosomes de surnageant de culture de cellules HCT116 par centrifugation à 100 000 x g pendant 1,5 h²³. Retirer le surnageant de culture et de Difficulté soigneusement le culot de l’exosome purifié avec 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % en solution de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,0) pendant 1 h à 4 ° C. Pour cacodylate de sodium 0,1 M, dissoudre 4,28 g d’acide cacodylique dans 160 mL d’eau distillée (DW). Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl puis faire jusqu'à 200 mL d’eau distillée.
2. Retirez le fixateur et rincez les boulettes avec 1 mL de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à la température ambiante. Répétez trois fois à chaque changement d’une durée de 10 min.
3. Fixer les échantillons avec 1 mL de tétroxyde d’Osmium 2 % pendant 1 h à 4 ° C.
4. Retirez le fixateur et rincer trois fois à cacodylate de sodium 0,1 M de tampon toutes les 10 min.
5. Incuber pendant 10 min avec une série graduée de l’acétone (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, respectivement) sur l’agitateur.
6. Retirez l’acétone et incuber la solution de mélange encastrement de 3:1 acétone : faible viscosité pendant 30 min. Le culot de l’exosome est dans le tube.
7. Enlever le milieu et ajouter 1:1 acétone : faible viscosité encastrement mélange moyen, puis incuber pendant 30 minutes.
8. Enlever le milieu et ajouter 1 / 3 acétone : faible viscosité encastrement mélange moyen, puis incuber pendant 30 minutes.
9. Retirer le milieu et ajouter 100 % faible viscosité enrobage mélange et incuber une nuit à température ambiante.
10. Incorporer l’échantillon en pure basse viscosité, incorporer le mélange à l’aide de l’enrobage moule et cuire au four pendant 24 h à 65 ° C.
11. Préparer les sections d’épaisseur 60 nm grâce à un ultra-microtome.
12. Double-tache avec de l’acétate d’uranyle 2 % pendant 20 min et citrate pendant 10 min de plomb.
    Pour la solution de Reynolds de plomb, ajouter 1,33 g de nitrate de plomb et 1,76 g de citrate de sodium à un total de 50 mL d’eau distillée.
13. Observer la grille sous microscopie électronique à transmission à 80 kV.
14. Cliquez sur « Acquérir », puis cliquez sur « Fichier » et « Enregistrer sous » dans le système à caméra CCD en microscopie électronique à 80 kV. Suivez les paramètres automatiques pour la durée d’exposition.

2. immunomarquage de Sections et d’imagerie (Figure 1)

1. Coupe des coupes ultrafines de 60 nm à l’aide d’un microtome-ultra et recueillir sur la grille de nickel.
2. Incuber les grilles dans 50 gouttes µL de glycine de 0,02 M pendant 10 min étancher les groupes aldéhyde libre.
3. Rincez dans 100 μL de DW trois fois chacun pour 10 min. laisser incuber à température ambiante pendant 1 h dans du PBS contenant 1 % de BSA.
4. Incuber les grilles dans 50 à 100 gouttes µL d’anti KRS anticorps²⁴ (au 1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA) pendant 1 h (si nécessaire, que cette étape doit être effectuée à 4 ° C durant la nuit.)
5. Laver les grilles avec 5 gouttes distincts (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pour 10 min chacun.
6. Transférer des grilles à gouttes de 2^nd anticorps pendant 1 h (anti-lapin IgG conjugué à 10 particules d’or nm (1/100) dans du PBS contenant 0,1 % de BSA).
7. Grilles de lavage avec cinq séparent gouttes (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA chaque 10 min.
8. Double-tache avec l’acétate d’uranyle de 2 % pendant 20 min dans des conditions sombres et citrate de plomb de Reynold pendant 10 min, respectivement.
9. Cliquez sur « Acquérir », puis cliquez sur « Fichier » et « Enregistrer sous » dans le système à caméra CCD sous un TEM à 80 kV. Temps d’exposition suivie de réglages automatiques.

Figure 1 : processus de préparation des échantillons et immunostaining. (A) Double fixe exosome est déshydraté et infiltré avec enrobage résine mélange de faible viscosité. (B) résine enrobage. (C) section ultra-mince avec couteau diamant. (D) le programme d’installation pour le marquage Immuno-or. Les grilles avec les coupes ultrafines sont mis sur les gouttelettes de liquide sur une parafilm, qui est placé avec la serviette de papier humide. Chaque section est incubée avec des gouttelettes d’anticorps de 50-100 µL, puis lavée avec un tampon. (E) Double coloration avec l’acétate d’uranyle et citrate de plomb. Le couvercle est recouvert de papier d’aluminium pour la coloration des métaux lourds. (F) solution de coloration est enlevée par le papier filtre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. coloration négative

1. Les grilles de EM mince formvar/carbone pelliculés cuivre 200 mailles pendant 1 min de déchargeur de lueur décharge luminescente.
2. Difficulté des exosomes purifié avec 1 mL de 2 % paraformaldéhyde (PFA) pendant 5 min.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques. Tout travail doit être fait sous une hotte ventilée.
3. 5-7 µL de solution de suspension exosome sur la grille de charge et incuber pendant 1 min. Si la concentration de l’exosome est trop élevée, diluer la concentration à 1/2 - 1/5.
4. Souillez immédiatement avec les ~ 20 gouttes de la solution filtrée 1 % uranyle acétate (UA) sur la surface de la grille de l’EM de la seringue.
5. Retirer l’excédent de solution UA sur la grille en communiquant avec le bord de la grille avec du papier filtre.
6. Rapidement, rincez la grille avec une goutte d’eau. Cette étape va supprimer la solution de coloration excessive.
7. Placez la grille sur la table en organisant avec des pincettes et recouvrir la grille partiellement avec une boîte de Petri sécher pendant 10 min sous la température ambiante.
8. Conserver la grille dans une boite de grille d’EM pour future observation par un TEM à 80 kV.

4. toute monture pour Immunostaining

1. Décharge luminescente le film mince formvar/carbone enduit 200 grilles d’EM de maille en cuivre pendant 30 s.
2. Difficulté des exosomes purifié avec 1 mL de 2 % paraformaldéhyde (PFA) pendant 5 min.
   ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques. Tout travail doit être fait sous une hotte ventilée.
3. 5-7 µL fixe exosome solution sur la grille de charge et incuber pendant 5 min. Rincer à 100 µL de PBS trois fois chacun pendant 10 min.
4. Traiter les grilles avec 50 µL de glycine 0,05 M pendant 10 min étancher les groupes aldéhyde libre.
5. Transfert des grilles à une goutte de tampon de blocage (PBS contenant 1 % de BSA) pendant 30 min.
6. Incuber les grilles avec 50-100 µL anti anticorps PD-L1 (1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA) pendant 1 h (si nécessaire, que cette étape doit être effectuée à 4 ° C durant la nuit).
7. Laver grille avec cinq gouttes distincts (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pour 10 min chacun.
8. Grille de transfert à une baisse de 2^nd anticorps pendant 1 h.

IgG anti-souris conjugués à particule d’or nm 9-11 dilué au 1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA.

Laver grille avec cinq gouttes distincts (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pour 10 min chacun. Laver la grille avec deux gouttes distincts (50 µL) de DW. Effectuer une coloration négative avec 2 % d’acétate d’uranyle décrits de 3,4 à 3,8.

Conserver la grille dans une boite de grille d’EM pour future observation par un TEM à 80 kV.

Résultats

Actuellement, les exosomes sont classées en catégories de taille et la forme par microscopie électronique à transmission. La figure 2 illustre négatifs colorés exosome et immunitaire marqué exosome support entier du statut. La figure 3 montre l’exosome sectionné et immuno-étiqueté exosomes après lamélisation mince. Immuno-or en utilisant des anticorps des protéines spécifiques de coloration est utilisée pour iden...

Discussion

Cet article présente un protocole pour observer la structure de l’exosome détaillée et le marquage de ses protéines spécifiques. Une coloration négative a été considérée comme la meilleure méthode pour exosome d’imagerie¹⁷. Cette technique classique a montré la structure en forme de tasse des exosomes. Cependant, cette forme de coupe est une forme d’artefact qui peut se produire en raison du processus de séchage. Résultats de la Cryo-TEM ont montré que les exosomes ont une str...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 1 g crystal	EMS	19100	Use only in fume hood
acetone	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-microtome	Leica	UCT
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	H7600
nickel grid	EMS	G200-Ni
Copper grid	EMS	G200-Cu
glycine	SIGMA	022K5404
Phosphate buffer saline	SIGMA	P4417
Bovine serum albumin	Aurion	25557
1st Antibody			purification in manually
Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody	BioLegend	329710	Whole mount Immumogold
Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl	BioLegend	401202	Whole mount Immumogold (Control)
2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle	sigma	G7652
silver paint	CANS	CTP100
aluminum stub	EMS	75622
FIB-SEM	Zeiss	AURIGA
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM2200FS
Glow discharger	JEOL	JFC1100E
Carbon grid	EMS	121119
Paraformaldehyde	EMS	19210
Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)	EMS	FCF200-NI