Preparação da amostra e a imagem latente de Exosomes por microscopia eletrônica de transmissão

Resumo

Este protocolo descreve as várias técnicas necessárias para microscopia eletrônica de transmissão incluindo coloração negativa, seccionamento ultrafinos de estrutura detalhada e imuno-ouro rotulagem para determinar as posições de proteínas específicas em exosomes.

Resumo

Exosomes são nanométricas vesículas extracelulares secretadas por fluidos corporais e são conhecidos para representar as características das células que secretam-los. O conteúdo e a morfologia das vesículas secretadas refletem o comportamento celular ou estado fisiológico, por exemplo, crescimento celular, migração, decote e morte. Papel do exosomes pode dependem altamente tamanho e o tamanho de exosomes varia de 30 a 300 nm. O método mais utilizado para tratamento de imagens exossomo é coloração negativa, enquanto outros resultados baseiam-se na microscopia de elétron de Cryo-transmissão, microscopia eletrônica de varredura e microscopia de força atômica. Morfologia do exossomo o típico avaliada através de coloração negativa é uma em forma de taça, mas ainda mais detalhes ainda não estão claras. Um exossomo bem caracterizado por meio de estudo estrutural é especialmente necessário nas áreas médicas e farmacêuticas. Portanto, a morfologia função dependente deve ser verificada por técnicas de microscopia eletrônica, por exemplo marcando uma proteína específica da estrutura detalhada do exossomo. Para observar a estrutura detalhada, imagens secionadas ultrafinos e imagens negativas manchadas, de exosomes foram comparadas. Neste protocolo, sugerimos a microscopia eletrônica de transmissão para a imagem latente de exosomes incluindo coloração negativa, toda montagem imuno-coloração, preparação de bloco, seção fina e rotulagem imuno-ouro.

Introdução

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas de bicamada lipídica secretadas pelas células, e seu tamanho varia entre 30 e 300 nm. SVE foram relatados primeiramente em 1978, com evidência de vesículas de pacientes com doença de Hodgkin¹. Essas vesículas foram relatadas para ser de 40 a 120 nanômetros de tamanho. Em 1980, foi relatado que EVs estão envolvidos no sistema de coagulação e trombose, formação de um coágulo de sangue dentro de um vaso sanguíneo no câncer pacientes². Depois de 30 anos, registaram-se um fator importante para promover a invasão do tumor, fuga imune e angiogênese³EVs. Além disso, as funções de EVs têm sido estudadas como reguladores em interacções celulares nas áreas de inflamação, distúrbio imunológico, doenças neurológicas e câncer⁴. Desde EVs contêm biomoléculas específicas tais como proteínas e RNAm microRNA⁵, sua potencial aplicação no diagnóstico e terapêutica tem sido analisados^6,7. Sve é uma categoria composta por subgrupos, incluindo exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, micropartículas, promininosomes, argosomes e exossomo como vesículas, dependendo da sua origem celular e função biológica³. Além disso, com base na sua biogênese, esses EVs podem ser divididos em aumentada (galpão aumentada, 100-1000 nm) e exosomes (30-300 nm)^8,9. Entre estes, o exossomo tem sido relatado como um comunicador de célula para resposta imune¹⁰, câncer^11,12e doenças infecciosas¹³.

Interesse no exosomes como um biomarcador para o diagnóstico precoce está a aumentar rapidamente, e a purificação e caracterização de exosomes devem ser acompanhados com técnicas de imagem moleculares. Os diferentes tamanhos e morfologias de exosomes, dependendo de sua origem e função¹⁴, podem ser distinguidas por técnicas de microscopia de alta resolução, tais como a microscopia eletrônica. Exosomes maioria dos foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM) negativo manchada^15,16,17, e esses resultados foram confirmados por immunolabeling de uma proteína específica em toda montagem vesículas ¹⁸. diversos grupos de pesquisa relataram a estrutura através de microscopia eletrônica de varredura, microscopia de força atômica^19,20e^21,de Cryo-TEM²². No entanto, enquanto estas técnicas são úteis para estudar a estrutura do exossomo, eles são insuficientes para observar a posição de proteínas específicas, localizado no interior do exossomo. Portanto, nós introduzimos um protocolo para exosomes com uma proteína específica rotulagem de imagem. Nós aplicamos a preparação do bloco, seccionamento ultrafinos e imunocoloração para determinar a localização detalhada da proteína do exossomo. Isso foi comparado com coloração negativa e todo imunocoloração de montagem, que é tradicionalmente utilizada para a caracterização do exossomo.

Protocolo

1. bloco preparação, corte, coloração e imagem do exossomo

1. Pelota a exosomes do sobrenadante de cultura de células HCT116 por centrifugação a 100.000 x g durante 1,5 h²³. Remover a sobrenadante de cultura e fixar cuidadosamente a pelota exossomo purificado com 1 mL de glutaraldeído 2,5% em solução de cacodylate de sódio 0,1 M (pH 7.0) para 1 h a 4 ° C. Para cacodylate de sódio 0,1 M, dissolva ácido cacodílico 4,28 g em 160 mL de água destilada (DW). Ajuste o pH para 7,4 com 0.1 M HCl, em seguida, fazer a 200 mL com água destilada.
2. Retire o fixador e enxágue as pelotas com 1 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,1 M à temperatura ambiente. Repita três vezes com cada alteração de duração de 10 min.
3. Fixar as amostras com 1 mL de tetróxido de ósmio de 2% para 1 h a 4 ° C.
4. Retire o fixador e lavar três vezes com cacodylate de sódio 0,1 M buffer cada 10 min.
5. Incubar durante 10 min com uma série de classificados acetona (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respectivamente) no agitador.
6. Remover a acetona e incubar a solução da mistura incorporação de 3:1 acetona: baixa viscosidade durante 30 min. A pelota exossomo está no tubo.
7. Remover o meio e adicionar médio de encastre mistura 1:1 acetona: baixa viscosidade, e incube por 30 min.
8. Remover o meio e adicione 3:1 acetona: baixa viscosidade encastre mistura média e, em seguida, incube durante 30 min.
9. Remover o meio e adicione 100% baixa viscosidade, incorporando a mistura e incubar durante uma noite em temperatura ambiente.
10. Incorporar a amostra em pura baixa viscosidade, incorporando a mistura usando o molde de encastre e asse por 24 h a 65 ° C.
11. Prepare-se seções com espessura de 60 nm através de um ultramicrótomo.
12. Duplo-mancha com 2% de acetato de uranilo por 20 min e levar citrato por 10 min.
    Para solução de chumbo de Reynolds, adicione 1,33 g de nitrato de chumbo e 1,76 g de citrato de sódio para um total de 50 mL de água destilada.
13. Observar a grade sob microscopia eletrônica de transmissão em 80 kV.
14. Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" sistema de câmera CCD sob o microscópio de elétron em 80 kV. Siga as configurações automáticas para o tempo de exposição.

2. imuno-coloração de seções e de imagem (Figura 1)

1. Corte 60 seções ultra-finas nm usando um ultramicrótomo e recolher a grelha de níquel.
2. Incube grades em 50 gotas de µ l de glicina de 0,02 M por 10 min saciar os grupos aldeído livre.
3. Enxague em 100 μL de DW três vezes cada 10 min. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h em PBS contendo 1% de BSA.
4. Incubar as grades em gotas de 50-100 µ l de anti KRS anticorpo²⁴ (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) para 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite.)
5. Lave as grades com cinco gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
6. Transferência de grades para gotas de 2^nd anticorpo por 1h (anti-coelho IgG conjugada com partículas de ouro nm 10 (1: 100) em PBS contendo 0,1% BSA).
7. Grades de lavagem com cinco separam gotas (50 μL) de PBS contendo 0,1% BSA cada 10 min.
8. Duplo-mancha com acetato de uranilo 2% por 20 min em condições escuras e com citrato de chumbo de Reynold para 10 min, respectivamente.
9. Clique em "Adquirir" e clique em "Arquivo" e "Salvar como" no sistema de câmera CCD sob uma temperatura de 80 kV. Tempo de exposição seguido configurações automáticas.

Figura 1: processo de preparação da amostra e imunocoloração. (A) duplo fixo exossomo é desidratado e infiltrado com baixa viscosidade, incorporação de resina de mistura. (B) a incorporação de resina. (C) seção ultra fina com faca de diamante. (D) configuração para rotulagem de imuno-ouro. As grades com as seções ultra-finas são colocadas sobre as gotas de líquido em um parafilm, que é colocado com a toalha de papel molhada. Cada seção é incubada com gotículas de anticorpo de 50-100 µ l e, em seguida, lavada com tampão. (E) dupla coloração com acetato de uranilo e citrato de chumbo. A tampa é coberta com papel alumínio para a coloração de heavy metal. (F) solução de coloração é removido pelo filtro de papel. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. coloração negativa

1. Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre para 1 min de descarregador de brilho.
2. Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
   Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada.
3. Carregar 5-7 µ l exossomo suspensão solução da grelha e incubar durante 1 min. Se a concentração do exossomo é muito elevada, dilua a concentração de 1/2 - 1/5.
4. Imediatamente a mancha com as ~ 20 gotas de solução de acetato (UA) de uranilo 1% filtrada na superfície da grade EM por seringa.
5. Remova a excesso solução UA na grelha entrando em contato com a borda de grade com papel de filtro.
6. Rapidamente lave a grelha com uma gota de água. Esta etapa irá remover a solução de coloração em excesso.
7. Coloque a grelha na mesa, segurando com uma pinça e cobrir a grade parcialmente com um prato de cultura para secar por 10 minutos em temperatura ambiente.
8. Armazenar a grade em uma caixa de grade EM para futura observação por um TEM 80 kV.

4. toda montagem para imunocoloração

1. Brilho da descarga-a película fina formvar/carbono revestido 200 grades de EM malha de cobre por 30 s.
2. Fix exosomes purificado com 1ml de 2% paraformaldeído (PFA) por 5 min.
   Cuidado: Paraformaldehyde vapores são tóxicos. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa ventilada.
3. Carga de 5 a 7 µ l solução de exossomo fixo na grade e incubar por 5 min. enxaguar com 100 µ l de PBS três vezes cada um por 10 min.
4. Trate de grades com 50 µ l de glicina de 0,05 M para 10 min saciar os grupos aldeído livre.
5. Transferência de grades a uma queda do tampão de bloqueio (PBS contendo 1% de BSA) por 30 min.
6. Incube as grades com 50-100 µ l anti anticorpo PD-L1 (1: 100 em PBS contendo 0,1% BSA) por 1h (se for necessário, que nesta etapa deve ser efectuada a 4 ° C durante a noite).
7. Lave a grade com 5 gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada.
8. Transferi a grade para uma gota de anticorpo de^nd 2 por 1h.

Anti-mouse IgG conjugada com partículas de ouro nm 9-11 diluído a 1: 100 em PBS contendo 0,1% de BSA.

Lave a grade com 5 gotas separadas (50 μL) de PBS contendo BSA de 0,1% por 10 min cada. Lave a grade com duas gotas separadas (50 μL) de DW. Execute a coloração negativa com 2% de acetato de uranilo, conforme descrito de 3,4 para 3,8.

Armazenar a grade em uma caixa de grade EM para futura observação por um TEM 80 kV.

Resultados

Atualmente, exosomes são classificados em categorias de tamanho e forma por microscopia eletrônica de transmissão. A Figura 2 mostra negativo manchado exossomo e imunológico-rotulados exossomo no monte todo status. A Figura 3 mostra exossomo secionado e imuno-rotulados exosomes após corte fino. Usando anticorpos de proteínas específicas de coloração imuno-ouro é usado positivamente identificar um exossomo e classificar ...

Discussão

Este artigo apresenta um protocolo para observar a estrutura do exossomo a detalhada e rotulagem de suas proteínas específicas. Coloração negativa tem sido considerado como o melhor método para exossomo de imagem¹⁷. Esta técnica convencional mostrou-se estrutura de forma de Taça dos exosomes. No entanto, esta forma de xícara é uma forma de artefato que pode ocorrer devido ao processo de secagem. Cryo-TEM resultados têm mostrado que o exosomes tem uma estrutura perfeitamente esférica em ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glutaraldehyde	EMS	16200
Sodium cacodylate	EMS	12300
Osmium tetroxide 1 g crystal	EMS	19100	Use only in fume hood
acetone	JUNSEI	1B2031
Spurr medium	TED PELLA	18108
Ultra-microtome	Leica	UCT
Uranyl acetate	EMS	22400	Hazardous chemical
Lead citrate	EMS	17900
Transmission Electron Microscopy	Hitachi	H7600
nickel grid	EMS	G200-Ni
Copper grid	EMS	G200-Cu
glycine	SIGMA	022K5404
Phosphate buffer saline	SIGMA	P4417
Bovine serum albumin	Aurion	25557
1st Antibody			purification in manually
Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody	BioLegend	329710	Whole mount Immumogold
Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl	BioLegend	401202	Whole mount Immumogold (Control)
2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle	sigma	G7652
silver paint	CANS	CTP100
aluminum stub	EMS	75622
FIB-SEM	Zeiss	AURIGA
Transmission Electron Microscopy	JEOL	JEM2200FS
Glow discharger	JEOL	JFC1100E
Carbon grid	EMS	121119
Paraformaldehyde	EMS	19210
Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)	EMS	FCF200-CU
Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)	EMS	FCF200-NI