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摘要

本协议描述了传输电子显微镜所需的各种技术, 包括阴性染色, 超薄切片的详细结构, 和免疫金标签, 以确定特定的蛋白质在体的位置。

摘要

体是一种由体液分泌的纳米细胞胞外囊, 它能代表分泌它们的细胞的特征。分泌囊泡的含量和形态反映细胞的行为或生理状态, 例如细胞生长、迁移、分裂和死亡。体的角色可能高度依赖于大小, 体的大小从30到 300 nm 不等。最广泛使用的方法外切成像是阴性染色, 而其他结果是基于低温透射电镜, 扫描电镜, 和原子力显微镜。典型的外切的形态通过阴性染色评估是一个杯子形状, 但进一步细节还不清楚。通过结构研究的外切良好在医学和药学领域是必要的。因此, 功能相关的形态学应该通过电子显微镜技术来验证, 例如在外切的详细结构中标注特定的蛋白质。对体的结构、超薄切片图像和负染色图像进行了对比观察。在本协议中, 我们建议传输电子显微镜的成像体包括阴性染色, 全贴剂免疫染色, 块准备, 薄切片, 免疫金标签。

引言

胞外囊泡 (EVs) 是由细胞分泌的脂质双层囊泡, 其大小范围介于30和 300 nm 之间。EVs 是第一次报告在 1978年, 与证据从囊性霍奇金病患者的水泡1。据报道, 这些小泡的大小是40到120纳米。据报道, 在 1980年, EVs 参与了凝血系统和血栓形成, 在癌症患者的血管内产生了血块2。30年后, EVs 被报道是促进肿瘤侵袭、免疫逃逸和血管生成的重要因素3。此外, 在炎症、免疫紊乱、神经系统疾病和癌症等领域的细胞相互作用中, EVs 的功能已被研究为调节因子4。由于 EVs 包含特定的生物分子, 如蛋白质, mRNA, 和 rna5, 它们在诊断和治疗方面的潜在应用已被分析6,7。EVs 是一个由子群组成的类别, 包括体、prostasomes、oncosomes、dexosomes、微粒、promininosomes、argosomes 和外切样泡, 这取决于它们的细胞来源和生物学功能3。此外, 根据它们的生物, 这些 EVs 可分为微 (棚微、100-1000 nm) 和体 (30-300 nm)8,9。其中, 外切被报告为免疫应答的细胞通信器10、癌症11、12和传染性疾病13。

对体作为早期诊断的生物标记物的兴趣正在迅速增加, 体的纯化和鉴定必须伴有分子成像技术。不同的大小和形态的体, 根据它们的起源和功能14, 可以区分高分辨率的显微镜技术, 如电子显微镜。大多数体是由负染色透射电镜 (TEM)15,16,17, 这些结果是通过 immunolabeling 的一个特定的蛋白在整个芒泡的确认18. 有几个研究小组通过扫描电子显微镜、原子力显微镜、19、20、低温-TEM21、22来报告该结构。然而, 虽然这些技术是有用的研究外切结构, 他们是不足够的观察位置的特定蛋白质位于外切。因此, 我们介绍了一个协议的成像体与特定的蛋白质的标签。我们采用了块制备, 超薄切片和免疫, 以确定蛋白质的详细位置在外切。这是与阴性染色和整个芒免疫, 这是传统用于表征的外切。

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研究方案

1. 外切块的制备、切片、染色和成像

  1. 将 HCT116 细胞培养上清液中的体, 在 10万 x g 为 1.5 h23进行离心。去除培养上清液, 在1° c 的 0.1 M 钠甲溶液 (pH 7.0) 中, 用1毫升2.5% 戊二醛仔细修复纯化的外切颗粒, 4 小时。对0.1 米甲钠, 溶解4.28 克胂酸在160毫升蒸馏水 (DW)。将 pH 值调整到7.4 与0.1 米 HCl, 然后用蒸馏水构成200毫升。
  2. 在室温下用1毫升的0.1 米甲缓冲液去除固定剂并冲洗颗粒。重复三次, 每次变化持续10分钟。
  3. 在4° c 的情况下, 用1毫升2% 锇氧化在1小时后修复样品。
  4. 取下定影液, 冲洗三次, 每10分钟用0.1 米甲缓冲。
  5. 用分级丙酮系列 (50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、分别) 在振动筛上孵育10分钟。
  6. 除去丙酮, 孵育3:1 丙酮的溶液: 低粘度嵌入混合物30分钟。外切颗粒在试管里。
  7. 去除培养基, 加入1:1 丙酮: 低粘度的嵌入混合物培养基, 然后孵育30分钟。
  8. 去除培养基, 加入1:3 丙酮: 低粘度的嵌入混合物培养基, 然后孵育30分钟。
  9. 去除培养基, 加入100% 低粘度的嵌入混合物, 在室温下过夜。
  10. 将样品嵌入纯低粘度的嵌入混合物中, 并在65° c 下烘烤24小时。
  11. 通过 ultra-microtome 准备 60 nm 厚度的剖面。
  12. 双色染色, 2% 铀醋酸20分钟, 柠檬酸铅10分钟。
    对于雷诺铅溶液, 添加1.33 克硝酸铅和1.76 克柠檬酸钠, 总共50毫升蒸馏水。
  13. 在 80 kV 的透射电镜下观察网格。
  14. 单击 "获取", 然后在 80 kV 的电子显微镜下, 在 CCD 摄像系统中单击 "文件" 和 "另存为"。按照曝光时间的自动设置进行。

2. 切片和成像的免疫染色 (图 1)

  1. 使用 ultra-microtome 切割60纳米超薄切片, 并在镍网格上收集。
  2. 孵育网格在50µL 滴0.02 米甘氨酸为10分钟到淬火游离醛组。
  3. 在100μ l 的 DW 中冲洗三次, 每次10分钟, 在室温下孵育 1 h 在含有 1% BSA 的 PBS 中。
  4. 孵育网格在 50-100 µL 滴抗 KRS 抗体24 (1:100 在 PBS 中含有 0.1% BSA) 为 1 h (如有必要, 此步骤应在夜间在4° c 进行。
  5. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。
  6. 传输网格到下落 2nd抗体为 1 h (兔 IgG 共轭到10毫微米金微粒 (1:100) 在 PBS 包含 0.1% BSA)。
  7. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 每 10 min。
  8. 双染色2% 铀醋酸20分钟在黑暗条件下, 并与雷诺的铅柠檬酸10分钟, 分别。
  9. 单击 "获取", 然后在 80 kV 的 TEM 下, 在 CCD 摄像系统中点击 "文件" 和 "另存为"。曝光时间遵循自动设置。

figure-protocol-1717
图 1: 样品制备和免疫的过程.(A)双固定外切的脱水和渗透低粘度嵌入混合树脂。(B)树脂嵌入。(C)超薄截面带金刚石刀。(D)设置免疫金标签。与超薄部分的网格放在液滴上的膜, 这是放置在湿纸巾。每节都用 50-100 µL 抗体的飞沫孵育, 然后用缓冲液冲洗。(E)双染色, 醋酸铀和柠檬酸铅。盖子上覆盖着铝箔, 用于重金属染色。(F)染色液由滤纸移除。请单击此处查看此图的较大版本.

3. 阴性染色

  1. 辉光放电的薄 formvar/碳膜覆盖200网状铜 EM 栅1分钟的辉光料器。
  2. 1毫升2% 甲醛 (粉煤灰) 固定纯化体5分钟。
    警告: 甲醛的烟雾是有毒的。所有工作应在通风油烟罩。
  3. 在网格上加载 5-7 µL 外切悬浮液, 孵育1分钟。如果外切浓度过高, 稀释浓度为 1/2-1/5。
  4. 立即染色与〜20滴过滤1% 铀醋酸盐 (UA) 解决方案在表面的 EM 网格的注射器。
  5. 通过与过滤纸接触网格边缘, 删除网格上多余的 UA 解决方案。
  6. 用一滴水迅速冲洗网格。此步骤将删除多余的染色液。
  7. 用镊子把网格放在桌上, 用一个培养皿把网格部分盖住, 在室温下晾干10分钟。
  8. 将网格存储在 EM 网格框中, 以便在80伏的 TEM 上进行观察。

4. 全山免疫

  1. 辉光放电薄 formvar/碳膜涂层200网状铜 EM 网三十年代。
  2. 1毫升2% 甲醛 (粉煤灰) 固定纯化体5分钟。
    警告: 甲醛的烟雾是有毒的。所有工作应在通风油烟罩。
  3. 在网格上加载 5-7 µL 固定外切溶液, 孵育5分钟, 100 µL PBS 三次, 每10分钟冲洗一次。
  4. 治疗50µL 0.05 米甘氨酸10分钟, 以淬火游离醛组的网格。
  5. 将网格转移到一滴阻塞缓冲器 (PBS 含有 1% BSA), 用于30分钟。
  6. 孵育网格与 50-100 µL 抗 PD-L1 抗体 (1:100 在 PBS 包含 0.1% BSA) 为 1 h (如果需要, 这步应该执行在4° c 隔夜)。
  7. 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。
  8. 将网格传输到 1 h 的 2nd抗体的下落。
抗鼠 IgG 共轭 9-11 nm 的黄金粒子稀释在1:100 在 PBS 含有 0.1% BSA。
  • 洗涤网格与五单独下落 (50 µL) PBS 包含 0.1% BSA 为10分钟每个。用两个单独滴 (50 µL) 的 DW 洗涤网格。用2% 铀醋酸酯进行阴性染色, 描述从3.4 到3.8。
  • 将网格存储在 EM 网格框中, 以便在80伏的 TEM 上进行观察。

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    结果

    目前, 体被分为大小和形状类别的透射电子显微镜。图 2显示了负染色外切和免疫标签外切在整个安装状态。图 3显示了切片后的分段外切和免疫标记体。免疫金染色使用特异蛋白抗体, 用于积极识别外切和分类的蛋白质类型的外切。本协议采用全贴免疫和免疫塑料分段外切。

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    讨论

    本文提出了一个协议, 以观察详细的外切的结构和标签的具体蛋白质。阴性染色被认为是外切成像17的最佳方法。这种传统的技术已经显示体的杯状结构。然而, 这个杯子形状是一种形式的人造制品, 可能发生由于干燥过程。低温透射电镜结果表明, 体在水溶液中具有完美的球形结构25,26。低温透射电镜技术是检测天然结构的一种非常有?...

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    披露声明

    作者没有什么可透露的。

    致谢

    这项研究得到了生物和 #38 的支持; 国家研究基金会 (NRF) 和 #38 的医疗技术发展方案; 由韩国政府资助 (MSIP 和 #38; 保健) (No. 2016M3A9B6904244)。我们还感谢医学 Bioconvergence 研究中心的成员外切纯化。

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    材料

    NameCompanyCatalog NumberComments
    GlutaraldehydeEMS16200
    Sodium cacodylate EMS12300
    Osmium tetroxide 1 g crystalEMS19100Use only in fume hood
    acetoneJUNSEI1B2031
    Spurr mediumTED PELLA18108
    Ultra-microtomeLeicaUCT
    Uranyl acetateEMS22400Hazardous chemical
    Lead citrateEMS17900
    Transmission Electron MicroscopyHitachiH7600
    nickel gridEMSG200-Ni
    Copper gridEMSG200-Cu
    glycineSIGMA022K5404
    Phosphate buffer salineSIGMAP4417
    Bovine serum albuminAurion25557
    1st Antibodypurification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) AntibodyBioLegend329710Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype CtrlBioLegend401202Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particlesigmaG7652
    Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM2200FS
    Glow dischargerJEOLJFC1100E
    Carbon gridEMS121119
    ParaformaldehydeEMS19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh)EMSFCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh)EMSFCF200-NI

    参考文献

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