Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول استخدام مثقف الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس لتعبير تحاليل، الوحدات المكونة للمستعمرة في الثقافة والطحال، وإعادة بناء طويلة الأجل لتحديد تأثير العوامل التنظيمية ومسارات الإشارات على الجذعية المكونة للدم خلية التنمية. وقد ثبت كنظام فعال لدراسة بيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم ووظيفة.

Abstract

الحد من استخدام الماوس الأجنة للدراسات هيماتوبويسيس من الإزعاج وأضاف في العمليات، وإلى حد كبير نتيجة لتطور الجنين داخل الرحم. على الرغم من أن تكون مقنعة البيانات الوراثية من الفئران خروج المغلوب (كو)، أنه من غير الواقعي لتوليد الفئران كو لجميع الجينات حسب الحاجة. وبالإضافة إلى ذلك، تؤدي في فيفو تجارب الإنقاذ لتوحيد البيانات المستقاة من الفئران كو ليست مريحة. للتغلب على هذه القيود، تم تطوير ثقافة explant الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس (AGM) كنظام مناسب لدراسة تطوير الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC). خاصة بالنسبة لتجارب الإنقاذ، يمكن استخدامه لاسترداد هيماتوبويسيس البصر في الفئران كو. بإضافة المواد الكيميائية المناسبة في المتوسط، مما يشير إلى ضعف يمكن إعادة تنشيط أو يمكن أن تعوق ينظم متابعة مسارات. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن إجراء تحديد المنظمين الحرجة للتنمية HSC العديد من التجارب، بما في ذلك HSC المتصلة بالتعبير الجيني في مستويات البروتين ومرناً، والقدرة على تشكيل مستعمرة، وإعادة تشكيل القدرات. هذه السلسلة من التجارب ستكون مفيدة في تحديد الآليات الكامنة ضروري للتنمية HSC في الثدييات.

Introduction

الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) هي خاصة بأنسجة الخلايا الجذعية البالغة التي تمتلك إمكانيات مولتيلينيجي بما في ذلك محمر، النقوي، والخلايا اللمفاوية، فضلا عن القدرة على تجديد نفسها. وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن هسكس أقرب نشأت من سكان غشائي متخصصة، المعروفة باسم البطانة هيموجينيك (أنه)، عن طريق بطانية للانتقال المكونة للدم (ات) في الجدار البطني الاورطي الظهرية1،2 ،،من34. حالما تتشكل في الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس المنطقة (AGM) الجنينية (ﻫ) 10.5 من إلى E12.5 في الجنين الماوس، هسكس سوف تهاجر إلى كبد الجنين للتوسع واستعمار وأخيراً نخاع العظام للحفاظ على هيماتوبويسيس الكبار طوال حياة الفرد 5 , 6-على الرغم من أن هذا قد درست لسنوات عديدة، الآليات الكامنة وراء ظهور HSC والتنمية ما زالت مفهومة.

خلافا للاخصاب في الأنابيب وتطوير الأجنة الزرد، التنمية داخل الرحم للأجنة الماوس يجعل دراسة هيماتوبويسيس نهائي خلال embryogenesis غير مريح أكثر بكثير. على الرغم من أن التجارب الجينية باستخدام الفئران خروج المغلوب (كو) تستخدم عادة، عدم وجود بعض الفئران كو كما يحد من استخدامها في مجال الأبحاث المكونة للدم. وبالإضافة إلى ذلك، لا يقوم في فيفو تجارب الإنقاذ بسهولة في الفئران كو. منذ عام 1996، وضعت ثقافة explant الجمعية العمومية للدراسات المكونة للدم من الرواد في حقل7. مع المساعدة من هذا النظام الثقافي، تم تحديد الأنسجة البطني لمنطقة الجمعية العمومية لتشجيع النشاط HSC، بينما الأنسجة الظهرية ممارسة معاكس8،تأثير9. كما تم تطبيق نظام الثقافة explant AGM لتحديد دور كل من السيروتونين والمكتبة، وصندوق إنقاذ الطفولة، BMP والقنفذ إشارات في HSC التنمية10،11،،من1213، 14-الأهم من ذلك، وأيضا طريقة شعبية تستخدم لإنقاذ العيوب المكونة للدم في الأجنة متحولة13،15.

Protocol

جميع الإجراءات بما في ذلك المواد الحيوانية أقرتها "لجنة المراجعة الأخلاقية" في معهد علم الحيوان، الأكاديمية الصينية للعلوم، بيجين، الصين.

1-"إعداد مواد"

  1. تعقيم 0.65 ميكرون المرشحات مع الأشعة فوق البنفسجية الأشعة المنتجة تحت الأشعة فوق البنفسجية شعاع مصباح على مقاعد البدلاء نظيفة ح 4 وتشغيل عوامل التصفية على مدى بعد علامة ح 2-
    ملاحظة: عند العمل مع الأشعة فوق البنفسجية، ارتداء حماية ملائمة.
  2. تعقيم تنسجم الفولاذ المقاوم للصدأ مع معقم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة-
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ارتفاع معين من الفولاذ المقاوم للصدأ شبكة لدعم عوامل التصفية على واجهة الهواء السائل، ويمكن أن يتحقق هذا مع السلك المعني الشبكة من الصلب ( الشكل 1 أ)-
  3. "فلوكستين تمييع" لتركيز نهائي من 10 ميكرون في M5300 طويلة الأجل الثقافة المتوسطة والمزيج بالتساوي.
    ملاحظة: لوحة الستة، حسنا، 2 مل M5300 طويلة الأجل المتوسط الثقافة مناسبة لكل بئر. الهيدروكورتيزون في 10 -6 M يمكن أن تضعف بشكل انتقائي في المتوسط-
  4. نقل المتوسطة وتستكمل مع فلوكستين في 10 ميكرون في لوحات ستة آبار أو أطباق ووضع تنسجم معقمة الفولاذ المقاوم للصدأ في المتوسط-
    5. أغسل
  5. 0.65 ميكرون المرشحات مع الماء المغلي مرتين لمدة 3 دقائق في كل مرة في الطبق ثقافة الخلية الزجاج للتعقيم. بعد أن تنسجم كل الغسيل، وضع عوامل التصفية في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) 2 دقيقة والمكان الرطب مرشحات على الفولاذ المقاوم للصدأ الدائمة في واجهة الهواء السائل كما هو مبين في الشكل 1 ألف [التخطيطي في المركز].
    ملاحظة: الماء المغلي يمكن إنشاؤها مع معقم اﻷوتوكﻻف لتحقيق أسيبسيس وينبغي أن تؤخذ المعدات خارج معقم اﻷوتوكﻻف في الوقت مناسب لتجنب حدوث انخفاض في درجة الحرارة-

2. الثقافة الجمعية العمومية اكسبلانت

  1. بعناية منفصلة في المناطق AGM من الأجنة في E10.5 أو E11 مع الملقط.
    1. قطاع أوتيروسيس من الفئران الحوامل مع مقص تشريح وفصل الأجنة أوتيروسيس-
    2. تمحو كيس ألمح والحبل السري، والأحشاء من جسم الجنين-
    3. بعناية إزالة الأنسجة العصبية الظهرية وأنسجة العضلات المحيطة.
    4. قطع الأنسجة مع الملقط في الموقع أطرافه الأمامية وهند وفصل منطقة الجمعية العمومية من جسم الجنين. 1 الأرقام ب-ج إظهار التمثيل التخطيطي ومورفولوجيا تشريح AGM-
  2. اكسبلانت AGMs تشريح بشكل منفصل على عوامل التصفية على واجهة الهواء السائل ( الشكل 1 أ) والثقافة في 5% CO 2 في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام-
    ملاحظة: لا تضع AGM تشريح على سلك الشبكة من الصلب والتأكد من عوامل التصفية على واجهة الهواء السائل خلال الثقافة. وباﻹضافة إلى الجمعية العمومية، ساك صفار البيض وكبد الجنين يمكن أيضا أن تكون مثقف مع هذا النظام 7-

3. تعبير تحاليل

  1. مستوى مرناً
    1. جمع AGMs المستزرعة في 1 مل برنامج تلفزيوني والطرد المركزي في 4 درجات مئوية، ز x 310 للحد الأدنى 6
    2. بعد إزالة المادة طافية، يتم استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من AGMs التي تم جمعها مع حل أحادي الطور من الفينول، وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-
    3. "مجموع الحمض النووي الريبي" (2 ميكروغرام) ومن ثم عكس نسخها باستخدام المنتسخة العكسية م-ملف للحصول على كدنا كالقالب. يتم إجراء فحوصات PCR الوقت الحقيقي الكمية مع "الأخضر سيبر" و جابده كالمراقبة الداخلية-
  2. مستوى بروتين
    1. جمع AGM مثقف كما هو موضح أعلاه في الخطوة 3.1.1.
    2. إعداد البروتين من عمومية مثقف مع المخزن المؤقت تحلل الخلية (10 ملم تريس-HCl، 10 مم كلوريد الصوديوم و 0.5% NP-40) التي تحتوي على مثبطات البروتياز واستخدام النشاف الغربية للكشف عن مستوى البروتين كما سبق وصف 13-

4. الوحدات المكونة للمستعمرة في مقايسة الثقافة (زيمبابوي-ج)

  1. بعد استزراع لمدة 2-3 أيام، جمع المناطق الجمعية العمومية في 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وأجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، ز x 310 لمدة 6 دقائق وتنأى مع 200 ميليلتر كولاجيناز (0.1% في برنامج تلفزيوني) في 37 ° C.
    ملاحظة: الوقت اللازم كولاجيناز لتوليد تعليق خلية واحدة من حوالي 20 دقيقة. هز الأنبوب الذي يحتوي على ملخص كل 5 دقائق يمكن تسريع عملية الهضم. يستخدم كولاجيناز 0.1% ميليلتر 200 لكل اجتماع الجمعية العمومية العادية ويستخدم 200 ميليلتر 10% مصل للتوقف عن رد فعل-
  2. الثقافة تعليق خلية واحدة في المتوسط M3434 في لوحات 24-كذلك مرفق منخفضة للغاية.
    ملاحظة: لتفادي التلوث، البنسلين والستربتوميسين الحل يمكن بشكل انتقائي إضافة في المتوسط. نظراً لأن متوسط M3434 لزج، حقنه نسخة 1.0 دون إبرة يستخدم لخلط الخلايا والمتوسطة-
    3. استزراع
  3. بعد 7-10 أيام في 37 درجة مئوية في 5% CO 2، وعدد لكل نوع من المستعمرات بما في ذلك تشكيل وحدة-محمر (أولما-E)، زيمبابوي-جرانولو-الوحيدات (زيمبابوي-الآلية العالمية)، وزيمبابوي-المحببات، انفجر كرات الدم الحمراء، بلعم، megakaryocyte (زيمبابوي-جيم) هي الموقر استناداً إلى مورفولوجية وسجل مع مجهر مقلوب ( الشكل 2-ج)-

5. في فيفو زرع الإنزيم

  1. فحص وحدات-الطحال (زيمبابوي-S) تشكيل مستعمرة
    1. بعد 2-3 أيام لاستزراع explant، جمع في AGMs وإعداد تعليق خلية واحدة بحضانة مع 200 ميليلتر كولاجيناز (0.1% في برنامج تلفزيوني) 20 الحد الأدنى
    2. أداء الإشعاعات المميتة (9 غراي من الأشعة السينية) من 8 إلى 10-أسبوع عمرها ذكور الفئران C57BL/6 ح 4-5 قبل حقن الخلايا.
    3. موضع الماوس المشع ريسترينير لتقييد نشاطها.
    4. يمسح الذيل استخدام مسحه القطن الغارقين في الكحول 75% لتشجيع التوسع في هذا السياق-
    5. حقن 0.5 الجنين أي ما يعادل (ee) أو هة 1 وحيد الخلية-تعليق للجمعية العمومية عن طريق الوريد الوريد ذيل الماوس المشع بحقنه نسخة 1.0.
      ملاحظة: يتم تعليق الخلايا مع برنامج تلفزيوني و 0.5 مل برنامج تلفزيوني كل مستلم حجم مناسب. يتم استخدام إبرة قياس 25 أو 26 قياس حجم لحقن بحقنه نسخة 1.0. ويمكن إدخال لا الهواء في المحاقن. اضغط على مكان الحقن بمسحه مطهر لوقف النزيف.
    6. أحد عشر يوما بعد زرع الأعضاء، جمع وإصلاح الطحال الفئران المستفيدة في بوين ' حل s (15 مل حامض البكريك 1.22 في المائة المشبعة المحلول، 2 مل 40 ٪ الميثانول وحامض الخليك 1 مل) 1-2 أيام وتغسل بالكحول 80% لمدة 1-2 يوما. عد المستعمرات مرئية في الطحال الميكروسكوب وتحديد عدد المستعمرات كل هة.
      ​ ملاحظة: بوين ' s مثبت، وملابس حماية ملائمة.
  2. الطويلة الأجل زرع الإنزيم
    1. بعد 2-3 أيام explant استزراع وجمع في AGMs وإعداد تعليق خلية واحدة بحضانة مع 200 ميليلتر كولاجيناز (0.1% في برنامج تلفزيوني) عن 20 دقيقة
    2. أداء الإشعاعات المميتة (9 غراي من الأشعة السينية) من 8 إلى 10-أسبوع عمرها ذكور الفئران C57BL/6 4-5 ساعات قبل حقن الخلايا.
    3. موضع الماوس المشع ريسترينير لتقييد نشاطها.
    4. يمسح الذيل استخدام مسحه القطن الغارقين في الكحول 75% لتشجيع التوسع في هذا السياق-
      5. < lأنا > ضخ ما يعادل 0.5 الجنين (ee) أو واحد هة 1 تعليق خلية للجمعية العمومية عن طريق الوريد الوريد ذيل الماوس المشع مع حقنه نسخة 1.0. اجتماع الجمعية العمومية العادية يتم حقنها بجرعة 1 هة كل مستلم مع 2 × 10 5 خلايا نخاع العظام (CD45.1 الخلفية)-
      ملاحظة: يمكن إدخال لا الهواء في المحاقن. اضغط على مكان الحقن بمسحه مطهر لوقف النزيف. جمع نخاع العظام للمستلم
    5. أربعة أشهر بعد الزرع، واستخدامها للمقايسة إعادة تشكيل من نظام مراقبة الأصول الميدانية. فقط المستلمين مع ≥ تشيميريسم المستمدة من المانحين 10% ويعتبر معرض ناجح إعادة تشكيل-

النتائج

ذكرت نشرة صدرت مؤخرا السيروتونين المستمدة من الخلايا غشائي تعزز بقاء هسكس عن طريق تثبيط في مسار برو-أبوبتوتيك في الجمعية العمومية13. للتأكد من تعزيز تأثير السيروتونين على التنمية HSC، أدرج فلوكسيتين. كمثبط إعادة امتصاص سيروتونين (SSRI)، أظهرت فلوكستين لتمنع امت...

Discussion

فمن المعروف جيدا أن هسكس الناضجة في نخاع العظام يمكن إعادة ملء نظام الدم المستلمين المشع. على عكس هذه هسكس الفنية، هسكس الناشئة في الجمعية العمومية للأجنة الماوس غير ناضجة. أظهرت نتائج الزرع المباشر هذا النوع أنا (VE-كندي+ CD45– CD41+) والنوع الثاني (VE-كندي+ CD45+) هسكس...

Disclosures

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

ونحن نشكر قاو صاوي للحصول على مساعدة في إعداد الشكل. وأيد هذا العمل المنح المقدمة من الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81530004, 31425016) ووزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2016YFA0100500). ج. ل. إجراء التجارب وصياغة هذه المخطوطة؛ تحرير المخطوطة. قراءة كلا المؤلفين ووافق المخطوط النهائي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
durapore 0.65 µm filtersMilliporeR5BA63787AGM explant culture
M5300 long-term culture mediumStem Cell Technologies5300AGM explant culture
Trizol Tiangen5829RNA extration
M-MLV reverse transcriptasePromega90694reverse transcription
SYBR GreenQiagenA6002quantatitive real-time PCR
protease inhibitorRoche55622Protein extration
collagenaseSigmaC2674digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 mediumStem Cell Technologies3434CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well platesCostar3473CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 miceBeijing HFK Bioscience Co. LtdCFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 miceBeijing HFK Bioscience Co. LtdLong-term transplantation
phosphate buffered salineLife Technologines8115284AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solutionHyCloneSV30010AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7eBioscience25-0454-80Long-term transplantation
anti-CD45-FITCeBioscience11-0451-81Long-term transplantation
UV lampBeijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD039-14402power: 30W
stainless steel meshAS ONE SHANGHAI Corporation2-9817-10 aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisoneSigmaH0396selectively diluted into M5300 medium

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved