造血の発達における大動脈生殖巣中植文化システムのアプリケーション

要約

このプロトコルを記述する発現解析、文化と脾臓、および長期的な再構成のコロニー形成単位の培養大動脈生殖巣中腎を使用して造血幹に及ぼす制御因子、シグナル伝達経路を決定するには細胞の開発。これは、造血幹細胞生物学、機能を研究するための効果的なシステムとして実証されています。

要約

マウス胚を用いた造血研究の制限は、主に胚の子宮内開発のための操作で追加の不便です。ノックアウト (KO) マウスの遺伝データが説得力のある、すべて遺伝子 KO マウスを必要に応じて生成するは現実的ではありません。さらに、生体内で実行する KO マウスから得られたデータを統合するレスキュー実験不便です。これらの制限を克服するために、大動脈性腺発生 (AGM) 培養は、造血幹細胞 (HSC) の開発を検討する適切なシステムとして開発されました。特にレスキュー実験の KO マウスの造血の障害を回復に使えます。適切な化学物質をメディアに追加すると、障害信号を再開することができます。 または調整された細道を禁じることができます。このメソッドの使用は、多くの実験は HSC の開発の重要な調整装置を識別するために実行することができます、HSC など関連する遺伝子の発現 mRNA および蛋白質レベル、コロニー形成能力および再構成能力。この一連の実験は哺乳類における HSC 開発に欠かせない根本的なメカニズムを定義するのに役立つでしょう。

概要

造血幹細胞 (造血)、組織固有成体幹細胞多能性赤芽球、骨髄性を含むリンパ球様細胞と自己更新する能力を持っています。最近の研究は、初期の HSCs が背側大動脈^{1,2 の腹側の壁で造血転移 (EHT) 血管内皮を介して hemogenic 内皮 (彼) と呼ばれる特殊な血管内皮人口に生じた示されています。 ,3,4}。マウス胚における E12.5 に胚 (E) 10.5 から大動脈生殖巣中の (AGM) 地域に結成され、一度 HSCs が拡張のため胎児の肝臓に移行、最終的に個人の生活の中で成人の造血を維持するために骨髄を植民地化^5,6。 これは、長年にわたって研究されている、HSC の出現と発展の基になるメカニズムの不完全な理解まま。

体外受精やゼブラフィッシュ胚の開発と違ってマウス胚の子宮内開発研究を行う決定的な造血の胚形成の間にはるかに不便。ノックアウト (KO) マウスを用いた遺伝子実験が一般に利用が特定の KO マウスの不足はまた造血研究分野での使用を制限します。さらに、レスキューを実験する生体内では、KO マウスで簡単には実行されません。1996 年以来、AGM 培養は、フィールド⁷の開拓者によって造血研究開発されています。この文化システムの助けを借りて、AGM 部腹側の組織は、背側の組織は、反対の効果^8,9を発揮しながら、HSC の活動を促進するために識別されています。AGM 植文化システムは、セロトニン、Mpl、SCF、BMP、および HSC 開発^{10、11,12,13,}におけるヘッジホッグのロールを判断に適用されています。¹⁴します。 重要なことは、また変異胚^13,15造血欠陥を救助するために使用人気のある方法です。

プロトコル

動物科目を含むすべてのプロシージャは、中国科学院動物研究所の北京、中国の倫理審査委員会によって承認されている

。

1 材料準備

1. 定置滅菌、0.65 μ m フィルター紫外線光線の紫外線の下で生産 4 h 用クリーン ベンチ内でランプをレイと 2 h マークの後にフィルターを裏返して。
   。 注: UV ライトを使用して、適切な保護を着用します
。
2. 滅菌オートクレーブ殺菌剤 30 分のための 121 ° c でステンレス メッシュします
   。 注: 気液界面でフィルターをサポートするステンレス メッシュのある特定の高さが必要し、スチール メッシュ ( 図 1 A) にワイヤーとそれを実現すます
。
3. 長期的な M5300 に 10 μ M の最終濃度に希釈フルオキセチン文化メディアとミックスに均等にします
   。 注: 6 ウェル プレート 2 mL M5300 長期培養培地は各ウェルに適したです。10 ^-6 M でヒドロコルチゾンを媒体に選択的に希釈できる
。
4. 6 ウェル プレートや料理に 10 μ M でフルオキセチンを添加した培地を転送し、媒体に滅菌のステンレス メッシュを入れて
。
5. は、殺菌のためガラス細胞培養皿のたびに 2 回 3 分の沸騰水で 0.65 μ m フィルターを洗ってください。[スケマティック 図 1 A のように、それぞれの洗浄、入れフィルター リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2 分とウェット フィルター ステンレスの上に場所をメッシュ気液界面に立ってを後センター] にします
   。 注: 無菌状態を達成するためにオートクレーブ滅菌器で生成水を沸騰と温度低下を避けるために機器をタイムリーにオートクレーブ滅菌器から取り除いてください
。

2。AGM 外植体文化

1. は慎重に鉗子で E10.5 または E11 で胚から AGM の領域を分離します。
   1. 解剖はさみで妊娠マウスから子宮を除去し、子宮の胚の区別します
   。
   2. 卵黄嚢、臍帯、胎児の体から内臓をふき取りなさい
   。
   3. 背側神経組織や周囲の筋肉組織を慎重に削除します
   。
   4. カットは、前部と後部の肢のサイトで鉗子で組織をオフ、胚体から AGM 地域を区切ります。 図 1B C を示す模式図と解剖 AGM の形態
   。
2. 2 〜 3 日の 37 ° C で 5% CO ₂ 液体空気インターフェイス ( 図 1 A) 文化でフィルターに別々 に切り裂かれた議事録を外植体します
   。 注: はないスチール メッシュのワイヤーに切り裂かれた AGM を配置し、フィルターは、気液界面培養中かどうかを確認します。AGM、以外にも卵黄嚢と胎仔肝することができますはまた培養するこのシステム ⁷ と
。

3。発現解析

1. mRNA レベル
   1. 1 mL の PBS に培養された議事録を収集し 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離
   2. 上清を除去した後フェノールの単相性ソリューションで収集した定時から総 RNA を抽出、メーカーによると ' の指示
   。
   3. 総 RNA (2 μ g) は、逆 M MLV 逆転写酵素を使用して、テンプレートとして cDNA を取得するを転写。定量的リアルタイム PCR の試金は SYBR グリーンで実行され、Gapdh は内部統制として使用されます
   。
2. 蛋白質のレベル
   1. 3.1.1 の手順で上記のように培養 AGM を収集します
   。
   2. セル換散バッファーと培養の AGM から蛋白質の準備 (10 mM トリス塩酸、10 mM の NaCl、および 0.5% NP 40) ¹³ プロテアーゼ阻害剤と前述の蛋白質のレベルを検出する西部のしみのための使用を含む説明
   。

4。文化 (CFU-C) アッセイでのコロニー形成単位

1. 2-3 日培養後 1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 4 ° C、6 分 310 × g で遠心分離機に AGM 地域を収集し、37 で 200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) との関連付けを解除° C
   注: コラゲナーゼ単一細胞懸濁液を生成するために必要な時間は約 20 分です。AGM を格納筒を振るごとに 5 分は消化プロセスを加速できます。200 μ L 0.1% コラゲナーゼは各 AGM 用、200 μ L 10% 血清反応を停止するために使用します
。
2. 文化 M3434 超低添付ファイル 24 ウェル プレート中の単一細胞を懸濁液します
   。 注: 汚染を避けるためには、ペニシリン ・ ストレプトマイシン液選択追加できます媒体に。M3434 媒体は粘性、ため針なし 1.0 cc 注射器が細胞と培地を混合する使用されます
。
3. 後 7 - 10 日間培養 5% CO ₂ の 37 ° C でコロニー形成単位の赤芽球 (BFU E)、CFU granulo, 単球 (CFU-GM) と CFU-顆粒球、バーストを含む赤血球、巨核球 (CFU ジェム) マクロファージの種類ごとの数識別形態に基づいて、倒立顕微鏡 ( 図 2 C) を獲得します
。

5。生体内で移植アッセイ

植を培養、

1. コロニー形成単位脾臓 (CFU-S) 試金
   1. 後 2 - 3 日議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 のと孵化によって単一細胞を懸濁液の準備分
   2. 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの致死照射 (x 線の 9 Gy) を行う細胞の注入の前に 4-5 h
   。
   3. 照射マウスを入れてその活動を制限する落
   。
   4. 静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く
   。
   5. 0.5 の胚と同等 (ee) または 1 ee 単一セル中断 AGM の静脈内に注入照射マウスの尾静脈 1.0 cc 注射器です
      。 注: セル PBS を中断している、受信者ごとの 0.5 mL PBS、適切な音量。25 ゲージまたはサイズ 26 ゲージの針は、1.0 cc 注射器で注入に使用されます。注射器に空気を導入することができます。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します
   。
   6. 11 日ポスト移植を収集、ブアンで受信者のマウスの脾臓を修正 ' s ソリューション (1.22% ピクリン酸飽和溶液 15 mL、2 mL 40% メタノールと酢酸 1 mL) 1-2 日の別の 1 〜 2 日の 80% のアルコールで洗浄。肉眼的脾臓における目に見えるコロニーをカウントし、ee あたりのコロニーの数を決定します
      。 ​ 注: ブアン ' s 定着剤、摩耗の適切な保護します
   。
2. 長期的な移植アッセイ
   1. 後 2-3 日培養外植体議事録を収集し、200 μ L コラゲナーゼ (PBS で 0.1%) 20 分と孵化によって単一細胞を懸濁液の準備
   2. 致命的な照射 (x 線の 9 Gy) 男性 8 に 10 週齢の c57bl/6 マウスの細胞の注入の前に 4-5 時間を実行します
   。
   3. 照射マウスを入れてその活動を制限する落
   。
   4. 静脈の血管拡張を促進するために 75% アルコールで綿棒を使って尾を拭く
   。 < l私 > 0.5 胚と同等 (ee) を挿入または 1 ee 1.0 cc 注射器で照射マウスの尾静脈に静脈内 AGM のセル中断のシングルします。AGM は 2 × 10 ⁵ 骨髄細胞 (CD45.1 背景) と受信者ごと 1 ee の用量で注入される
   。 注: 空気を導入していない注射器に。出血を止めるため防腐剤綿棒と注射部位を押します。
   5. 4 ヶ月間は、移植後、受信者の骨髄を収集し、FACS による再構成の試金のためにそれを使用します。持つ受信者のみ ≥ 10% ドナー由来のキメリズムが成功した再構成を展示すると見なされます
   。

結果

最近の出版物は、血管内皮細胞由来セロトニン AGM¹³pro のアポトーシスを阻害することによって造血の生存を促進する報告しました。HSC におけるセロトニンの促進効果を確認、フルオキセチンが含まれていた。選択的セロトニン再取り込み阻害剤 (SSRI)、としてフルオキセチンは、末梢組織^16,17,

ディスカッション

骨髄で成熟した造血が照射受信者の血システムを再作成することができますが知られています。異なり、これらの機能の HSCs マウス胚の AGM で新興の HSCs は熟女ではありません。直接移植結果このような私 (VE cad⁺ CD45^- CD41⁺) と II 型 (VE cad⁺ CD45⁺) 前 HSCs が再構成能力²⁰を所有していません。AGM 植文化システム、AGM 地域における初期の HSC...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
durapore 0.65 µm filters	Millipore	R5BA63787	AGM explant culture
M5300 long-term culture medium	Stem Cell Technologies	5300	AGM explant culture
Trizol	Tiangen	5829	RNA extration
M-MLV reverse transcriptase	Promega	90694	reverse transcription
SYBR Green	Qiagen	A6002	quantatitive real-time PCR
protease inhibitor	Roche	55622	Protein extration
collagenase	Sigma	C2674	digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium	Stem Cell Technologies	3434	CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates	Costar	3473	CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		Long-term transplantation
phosphate buffered saline	Life Technologines	8115284	AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution	HyClone	SV30010	AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7	eBioscience	25-0454-80	Long-term transplantation
anti-CD45-FITC	eBioscience	11-0451-81	Long-term transplantation
UV lamp	Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD	039-14402	power: 30W
stainless steel mesh	AS ONE SHANGHAI Corporation	2-9817-10	aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone	Sigma	H0396	selectively diluted into M5300 medium