Anwendung der Aorta-Gonade-Wachstum Explant Kultursystem in Developmental Hämatopoese

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt mit kultivierten Aorta-Gonade-Wachstum für Expressionsanalysen, Koloniebildenden Einheiten in die Kultur und die Milz und die langfristige Wiederherstellung um zu bestimmen, die Auswirkungen der regulatorischen Faktoren und Signalwege auf hämatopoetischen Stammzellen Zellentwicklung. Dies wurde als ein wirksames System zur Untersuchung von hämatopoetischen Stammzellen-Biologie und Funktion nachgewiesen.

Zusammenfassung

Die Einschränkung bei der Verwendung von Mäuseembryonen für Blutbildung Studien ist die zusätzliche Unannehmlichkeiten bei Operationen, weitgehend aufgrund der intrauterinen Entwicklung des Embryos. Obwohl genetische Daten von Knockout (KO)-Mäusen überzeugend sind, ist es nicht realistisch, KO Mäuse für alle Gene zu erzeugen, wie gebraucht. Darüber hinaus durchführen in Vivo Rettung Experimente zur Konsolidierung der Daten erhalten von KO-Mäusen ist nicht bequem. Um diese Einschränkungen zu überwinden, entwickelte sich die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Explant Kultur als ein geeignetes System, hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Entwicklung zu studieren. Vor allem für Rettung Experimente es lässt sich die beeinträchtigte Blutbildung in KO-Mäusen zu erholen. Durch das Hinzufügen der entsprechenden Chemikalien in das Medium, die beeinträchtigt Signalisierung kann reaktiviert werden oder Up-regulierten Bahnen gehemmt werden können. Mit dem Einsatz dieser Methode viele Experimente können durchgeführt werden, um die kritischen Regulatoren der HSC Entwicklung identifizieren, einschließlich HSC im Zusammenhang mit gen-Expression auf mRNA und Protein Ebenen, Kolonie Bildung Fähigkeit und Rekonstitution Kapazität. Diese Serie von Experimenten wäre hilfreich bei der Festlegung der zugrunde liegenden Mechanismen für HSC-Entwicklung bei Säugetieren.

Einleitung

Hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) sind gewebespezifischen adulten Stammzellen, der besitzen multilineage Potenzial einschließlich erythroiden, myeloische, und lymphatischen Zellen, sowie die Fähigkeit, selbst zu erneuern. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die frühesten HSCs aus einer spezialisierten Endothelzellen Bevölkerung entstand, bekannt als Hemogenic Endothel (HE), durch die endotheliale hämatopoetischen Übergang (EHT) an der ventralen Wand des dorsalen Aorta^{1,2 ,3,4}. Sobald die Aorta-Gonade-Wachstum (AGM) Region von embryonalen (E) 10,5 bis E12.5 in der Maus-Embryo gebildet, HSCs Wandern in der fetalen Leber für die Erweiterung und schließlich besiedeln das Knochenmark zu adulten Hämatopoese im gesamten Leben eines Individuums zu pflegen ^{5 , 6}. obwohl dies seit vielen Jahren erforscht wird, die zugrunde liegenden Mechanismen der HSC-Entstehung und Entwicklung bleiben unvollständig verstanden.

Im Gegensatz zu in-vitro- Befruchtung und Entwicklung des Zebrafisch-Embryonen macht intrauterinen Entwicklung von Mäuseembryonen das Studium der definitiven Hämatopoese in der Embryogenese viel unbequemer. Obwohl genetische Experimente mit Knockout (KO)-Mäusen allgemein verwendet sind, schränkt das Fehlen von bestimmten KO-Mäusen auch ihre Verwendung im Bereich hämatopoetischen Forschung. Darüber hinaus werden in Vivo Rettung Versuche nicht leicht in KO-Mäusen durchgeführt. Seit 1996 wurde die AGM Explant Kultur für hämatopoetische Studien von den Pionieren im Bereich⁷entwickelt. Mit Hilfe dieses Kultur-Systems identifizierten ventralen Gewebe der AGM-Region HSC Aktivität zu fördern, während dorsalen Gewebe eine entgegengesetzte Wirkung^8,9ausüben. Die AGM Explant Kultursystem wurde auch angewendet, um festzustellen, die Rolle von Serotonin, Mpl, SCF, BMP und Igel Signalisierung in HSC Entwicklung^{10,11,12,13, 14}. wichtiger ist, es ist auch eine beliebte Methode, hämatopoetischen Mängel in der mutierten Embryonen^13,15zu retten.

Protokoll

alle Verfahren, die unter anderem tierische Themen von der ethischen Review Committee im Institut für Zoologie, chinesische Akademie der Wissenschaften, Peking, China genehmigt worden.

1. Material Vorbereitung

1. Sterilisation der 0,65 µm Filter mit UV Strahlen produziert unter dem ultravioletten Strahl der Lampe auf die sauberen Werkbank für 4 h und die Filter nach 2 h-Kennzeichen umdrehen.
   Hinweis: Wenn Sie mit UV-Licht arbeiten, entsprechende Verschleißschutz.
2. Edelstahl-Netze mit dem Autoklav Sterilisator bei 121 ° C für 30 Minuten sterilisieren.
   Hinweis: Eine bestimmte Höhe Edelstahlgeflecht ist notwendig, um die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit zu unterstützen und dadurch realisiert werden, mit dem Draht auf das Stahlgitter ( Abb. 1 A).
3. Verdünnen Fluoxetin, eine Endkonzentration von 10 µM in langfristige M5300 Kultur Medium und Mischung gleichmäßig.
   Hinweis: Für eine sechs-Well-Platte ist 2 mL M5300 langfristige Kulturmedium für jedes gut geeignet. Hydrocortison bei 10 ^-6 M kann selektiv in das Medium verdünnt werden.
4. Das Medium ergänzt mit Fluoxetin bei 10 µM in sechs-Well Platten oder Gerichte zu übertragen und setzen die sterilisierten Edelstahl-Gitter in das Medium.
5. Waschen die 0,65 µm-Filter mit kochendem Wasser zwei Mal für 3 Minuten jedes Mal in der Kulturschale Glas Zelle für die Sterilisation. Nach jeder Wäsche, setzen die Filter in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für 2 Minuten und Platz Nässe auf der Edelstahl-Filter stehen an der Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle, Maschen wie in Abbildung 1 A [schematisch dargestellt in der Mitte].
   Hinweis: Kochendes Wasser kann erzeugt werden mit dem Autoklav Sterilisator, die Asepsis zu erreichen und Ausrüstung aus Autoklav Sterilisator rechtzeitig getroffen werden, um eine Abnahme der Temperatur zu vermeiden.

2. AGM Explant Kultur

1. trennen Sie vorsichtig die AGM-Regionen aus den Embryonen im E10.5 oder E11 mit der Pinzette.
   1. Streifen die Gebärmutter von schwangeren Mäusen mit der sezierenden Schere und die Embryonen aus der Gebärmutter zu trennen.
   2. Der Dottersack, der Nabelschnur und Eingeweide aus dem Körper des Embryos abwischen.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die dorsale Nerv Gewebe und die umliegenden Muskelgewebe.
   4. Cut off das Gewebe mit der Zange auf dem Gelände des vorderen und hinteren Gliedmaßen und die AGM-Region aus dem Embryo Körper zu trennen. Figuren 1 B-C zeigen die schematische Darstellung und Morphologie der seziert AGM.
2. Explant sezierten Hauptversammlungen separat auf die Filter im Air-Liquid-Schnittstelle ( Abb. 1 A) und 5 % CO ₂ bei 37 ° C für ca. 2-3 Tage.
   Hinweis: Nicht legen Sie seziert AGM auf den Draht von der Stahlgitter und sicherstellen Sie, dass die Filter an der Grenzfläche Luft-Flüssigkeit während der Kultur sind. Neben der Jahreshauptversammlung, Dottersack und fetalen Leber können auch gezüchtet werden mit diesem System ⁷.

3. Expressionsanalysen

1. mRNA-Ebene
   1. sammeln die kultivierten Hauptversammlungen in 1 mL PBS und Zentrifugieren bei 4 ° C, 310 X g für 6 min.
   2. Nach dem Entfernen des Überstands, Gesamt-RNS wird extrahiert aus den gesammelten Hauptversammlungen mit einer monophasischen Lösung aus Phenol, nach Angaben des Herstellers ' Anweisungen s.
   3. Gesamt-RNS (2 µg) ist dann umgekehrt transkribiert, mit M-MLV Reverse Transkriptase cDNA als Vorlage zu erhalten. Die quantitative Echtzeit-PCR-Assays erfolgen mit SYBR Green und Gapdh dient als interne Kontrolle.
2. Protein-Ebene
   1. der kultivierten AGM zu sammeln, wie oben beschrieben in Schritt 3.1.1.
   2. Bereiten das Protein von der kultivierten GV mit der Zelle Lysis Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl und 0,5 % NP-40) mit Protease-Inhibitor und Einsatz für das westliche Beflecken um die Protein-Ebene erkennen, wie zuvor beschrieben ¹³.

4. Koloniebildenden Einheiten in der Kultur (KBE-C) Assay

1. nach Kultivierung für 2-3 Tage, sammeln die AGM-Regionen in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Zentrifuge bei 4 ° C, 310 X g für 6 Minuten und mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) bei 37 distanzieren ° C
   Hinweis: Der Zeitaufwand für die Kollagenase, einzelne Zellsuspensionen zu generieren ist etwa 20 Minuten. Schütteln das Röhrchen mit AGM können alle 5 Minuten die Verdauung beschleunigen. 200 µL 0.1 % Kollagenase dient jedes AGM und 200 µL 10 % Serum wird verwendet, um die Reaktion zu stoppen.
2. Kultur einzelne Zellsuspensionen in M3434 Medium in ultra-niedrigen Anlage 24-Well Platten.
   Hinweis: Zur Vermeidung von Kontaminationen kann Penicillin-Streptomycin-Lösung gezielt in das Medium hinzugefügt werden. Weil das M3434 Medium zähflüssig ist, eine 1,0 cc Spritze ohne Nadel wird verwendet, um die Zellen und Medium mix.
3. Nach 7 - 10 Tagen Kultivierung bei 37 ° C in 5 % CO ₂, die Zahl für jede Art von Kolonien einschließlich Burst bilden Einheit--erythroiden (BFU-E), KBE-Granulo-Monocyte (CFU-GM) und KBE-Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryocyte (KBE-GEMM) Zeichnen auf die Morphologie und erzielte mit einem inversen Mikroskop ( Abbildung 2 C).

5. In Vivo Transplantation-Assay

1. Koloniebildenden Einheiten-Milz (KBE-S) Assay
   1. nach 2 - 3 Tage der modellabhängigen Kultivierung, sammeln die Hauptversammlungen und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.
   2. Führen Sie tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5h vor der Zelle Injektion.
   3. Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.
   4. Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.
   5. Injizieren 0,5 Embryo entspricht (Ee) oder 1 Ee einzelne Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene des bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze.
      Hinweis: Zellen sind mit PBS suspendiert und 0,5 mL PBS pro Empfänger ist eine angemessene Lautstärke. Eine Nadel von 25 Gauge oder 26 Gauge Größe wird für die Injektion mit einer 1,0 cc Spritze verwendet. Keine Luft kann in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.
   6. Elf Tage nach Transplantation, sammeln und reparieren die Milz der Empfänger Mäuse in Bouin ' s Lösung (15 mL 1,22 % Pikrinsäure gesättigte wässrige Lösung, 2 mL 40 % Methanol und 1 mL Essigsäure) für 1-2 Tage und waschen mit 80 % Alkohol für weitere 1-2 Tage. Zählen Sie Makroskopisch sichtbaren Kolonien in der Milz und bestimmen Sie die Anzahl der Kolonien pro Ee.
      ​ Hinweis: Bouin ' s Fixiermittel, geeignete Verschleißschutz.
2. Langfristige Transplantation Assay
   1. nach 2-3 Tagen explant Kultivierung, die Hauptversammlungen zu sammeln und bereiten Sie einzelne Zellsuspensionen durch Inkubation mit 200 µL Kollagenase (0,1 % mit PBS-Puffer) für 20 min.
   2. Tödliche Bestrahlung (9 Gy Röntgenstrahlung) von 8 bis 10 - Wochen alten männlichen C57BL/6 Mäusen 4-5 Std. vor der Zelle Injektion durchführen.
   3. Eine einschränkende beschränkt seine Tätigkeit die bestrahlte Maus gesteckt.
   4. Wischen Sie die Rute mit einem Wattestäbchen in 75 % Alkohol durchdrungen, um Vasodilatation der Vene zu fördern.
   < lich > injizieren entspricht 0,5 Embryo (Ee) oder 1 Ee single Zellsuspensionen von AGM intravenös in die Rute Vene einer bestrahlten Maus mit einer 1,0 cc Spritze. Hauptversammlung werden bei einer Dosis von 1 Ee pro Empfänger mit 2 × 10 ⁵ Knochenmarkzellen (CD45.1 Hintergrund) injiziert.
   Hinweis: Es kann keine Luft in die Spritze eingeführt werden. Drücken Sie die Injektionsstelle mit einem antiseptischen Tupfer um Blutungen zu stoppen.
   5. Vier Monate nach Transplantation, das Knochenmark des Empfängers zu sammeln und verwenden Sie es für die Rekonstitution Assay durch FACS. Nur die Empfänger mit ≥ 10 % Spender abgeleitet Chimerism gelten als erfolgreiche Rekonstitution aufweisen.

Ergebnisse

Eine kürzlich erschienenen Publikation berichtet, endothelial Zelle abgeleitet Serotonin das Überleben der HSCs fördert durch die Hemmung des Pro-apoptotische Weges in der AGM-¹³. Um die Förderung Wirkung von Serotonin auf HSC Entwicklung bestätigen, war Fluoxetin enthalten. Als eine selektive Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) nachweislich die Fluoxetin hemmen Serotonin-Re-Absorption in peripheren Geweben^16,

Diskussion

Es ist bekannt, dass Reife HSCs im Knochenmark können das Blutsystem der bestrahlten Empfänger neu zu besiedeln. Im Gegensatz zu diesen funktionalen HSCs sind die aufstrebenden HSCs an der Hauptversammlung von Mäuseembryonen unreif. Direkte Transplantation Ergebnisse zeigten, dass Typ ich (VE-CAD-⁺ CD45^– CD41⁺) und Typ II (VE-CAD-⁺ CD45⁺) Pre-HSCs besitzen keine Rekonstitution Fähigkeit²⁰. Unter Ausnutzung der AGM Explant Kultursystem, d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
durapore 0.65 µm filters	Millipore	R5BA63787	AGM explant culture
M5300 long-term culture medium	Stem Cell Technologies	5300	AGM explant culture
Trizol	Tiangen	5829	RNA extration
M-MLV reverse transcriptase	Promega	90694	reverse transcription
SYBR Green	Qiagen	A6002	quantatitive real-time PCR
protease inhibitor	Roche	55622	Protein extration
collagenase	Sigma	C2674	digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium	Stem Cell Technologies	3434	CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates	Costar	3473	CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		Long-term transplantation
phosphate buffered saline	Life Technologines	8115284	AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution	HyClone	SV30010	AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7	eBioscience	25-0454-80	Long-term transplantation
anti-CD45-FITC	eBioscience	11-0451-81	Long-term transplantation
UV lamp	Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD	039-14402	power: 30W
stainless steel mesh	AS ONE SHANGHAI Corporation	2-9817-10	aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone	Sigma	H0396	selectively diluted into M5300 medium