היישום של מערכת העורקים-בלוטת המין-mesonephros Explant התרבות Hematopoiesis התפתחותית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.

Abstract

המגבלה של שימוש בעכבר העוברים ללימודי hematopoiesis היא הנוחיות הנוספת במבצעים, אשר נובע במידה רבה התפתחות העובר תוך רחמי. למרות משכנעים מידע גנטי של עכברים knockout (KO), זה לא מציאותי ליצירת עכברים KO עבור כל הגנים כנדרש. בנוסף, ביצוע ויוו הצלה ניסויים כדי לאחד את הנתונים המתקבלים KO עכברים אינה נוחה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התרבות explant של אבי העורקים-בלוטת המין-Mesonephros (AGM) פותחה כמערכת המתאימה ללמוד פיתוח תאי גזע hematopoietic (HSC). במיוחד לניסויים הצלה, זה יכול לשמש כדי לשחזר את hematopoiesis לקוי בעכברים KO. על ידי הוספת כימיקלים המתאימים לתוך האמצעי, האיתות לקוי ניתן להפעיל מחדש או מסלולים מוסדר למעלה ניתן והשרירי אותו. עם השימוש בשיטה זו, ניסויים רבים שניתן לבצע כדי לזהות הרגולטורים קריטיים של התפתחות מועדון הכדורגל מונפלייה, כולל מועדון הכדורגל מונפלייה הקשורים גנים ב mRNA ורמות החלבון, המושבה היווצרות יכולת והקיבולת הכינון. זו סדרה של ניסויים יהיה מועיל בהגדרת המנגנונים המשמשת כבסיס חיוני לפיתוח HSC ביונקים.

Introduction

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאי גזע בוגרים רקמות ספציפיות כי בעלי פוטנציאל multilineage כולל erythroid, מיאלואידית, ו הלימפה התאים, כמו גם לחדש את עצמי. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי HSCs המוקדם התעוררו מתוך אוכלוסיה אנדותל מיוחדים, המכונה אנדותל hemogenic (HE), דרך אנדותל המעבר hematopoietic (בובה) בכותל הגחון של אבי העורקים הגבי^{1,2 3, ,4}. לאחר שהוקמה באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros (AGM) מעובריים (E) 10.5 כדי E12.5 העובר העכבר, HSCs נודדים אל הכבד העוברי של הרחבה, בסופו של דבר ליישב את מח העצם כדי לשמור על hematopoiesis למבוגרים לאורך החיים של הפרט ^{5 , 6}. למרות זה נחקר במשך שנים רבות, המנגנון הבסיסי של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה ופיתוח נשארים שהיישום מובן.

בניגוד הפריה במבחנה ופיתוח של דג זברה עוברי, פיתוח תוך רחמי העוברים העכבר הופך המחקר של hematopoiesis מוחלטת בזמן מופרה הרבה יותר נוח. למרות ניסויים גנטיים באמצעות הסתרה (KO) עכברים שאינם מנוצלים בדרך כלל, חוסר של עכברים KO מסוימים מגביל גם את השימוש בשטח המחקר hematopoietic. בנוסף, אין ויוו הצלה ניסויים לא בקלות מבוצעות בעכברים KO. מאז 1996, התרבות explant AGM פותחה ללימודי hematopoietic על ידי חלוצי בתעשיית השדה⁷. בעזרת מערכת זו תרבות, רקמות הגחון של האזור AGM זוהו לקדם פעילות מועדון הכדורגל מונפלייה, ואילו רקמות הגבי מפעילים של^8,מול אפקט⁹. מערכת התרבות explant AGM הוחל גם כדי לקבוע את התפקידים של סרוטונין, הרישיון הציבורי של מוזילה, SCF, BMP וקיפוד איתות HSC פיתוח^{10,11,12,13, 14}. חשוב, זה גם שיטה פופולארית נהגה להציל פגמים hematopoietic עוברי מוטציה^13,15.

Protocol

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת ביקורת אתית המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, בייג'ינג, סין.

1. הכנת חומר

1. Sterilize 0.65 מסננים מיקרומטר עם אולטרה סגול קרני מיוצר תחת אולטרה סגול ריי המנורה על הספסל נקייה במשך 4 שעות, להסגיר את המסננים לאחר הסימן 2 h.
   הערה: בעת עבודה עם אור UV, לענוד הגנה הולמת.
2. לחטא את רשתות נירוסטה עם המעקר אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 mins.
   הערה: גובה מסוים של רשת נירוסטה יש צורך לתמוך את מסנני-הממשק אוויר נוזלי, זה יכול להתממש עם החוט על רשת השינוי פלדה ( איור 1 א').
3. פלואוקסטין לדלל את ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתוך M5300 לטווח ארוך תרבות בינונית, מערבבים באופן שווה.
   הערה: על צלחת שש-. טוב, 2 מ"ל M5300 התרבות ארוכת טווח בינוני מתאים מכל קידוח. הידרוקורטיזון-10 ^-6 מ' יכול להיות סלקטיבי מדולל המדיום.
4. להעביר את המדיום בתוספת פלואוקסטין-10 מיקרומטר. ובכן שש צלחות או מנות והכניסו את רשתות נירוסטה סטיריליים המדיום.
5. לרחוץ את המסננים 0.65 מיקרומטר עם מים רותחים פעמיים במשך 3 דקות בכל פעם בצלחת תרבות תא זכוכית עבור עיקור. לאחר כל הכביסה, מכניסים את המסננים פוספט buffered מלוחים (PBS) במשך 2 דקות, במקום רטובה מסננת על גבי הנירוסטה רשתות שינוי עומדים על הממשק אוויר נוזלי כפי שמוצג באיור 1 A [סכמטי במרכז].
   הערה: מים רותחים יכול להיווצר עם המעקר החיטוי כדי להשיג את asepsis ואת הציוד צריך להילקח מתוך אוטוקלב מעקר במועד כדי למנוע ירידה בטמפרטורה.

2. AGM Explant תרבות

1. הפרד בזהירות את האזורים AGM מן העוברים E10.5 או E11 עם מלקחיים.
   1. להסיר את uteruses של עכברים בהריון עם המספריים ויבתר, להפריד את העוברים uteruses.
   2. לנגב את שק החלמון הטבור, מעיים בגוף העובר.
   3. הסר בזהירות את רקמות עצב הגבי ואת הרקמות הסובבות שרירים.
   4. גזור הרקמות עם המלקחיים באתר של הגפיים הקדמיות, האחוריות לסירוגין להפריד את אזור AGM בגוף העובר. 1 דמויות B-C להראות הסמלית של המורפולוגיה של ביתור AGM-
2. Explant את AGMs גזור בנפרד על גבי מסנני אוויר נוזלי ממשק ( איור 1 א'), תרבות 5% CO ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
   הערה: לא למקם את AGM גזור על החוט של רשת השינוי פלדה ולוודא שהמסננים הינם הממשק אוויר נוזלי במהלך תרבות. חוץ ומזכיר האסיפה, שק החלמון והכבד בעובר יכול גם להיות תרבותי עם זו מערכת ⁷.

3. ניתוח ביטוי

1. ברמת mRNA
   1. לאסוף את AGMs בתרבית לתוך 1 מ"ל PBS, צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 מינימלית
   2. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, RNA הכולל מופק מן AGMs שנאספו עם פתרון monophasic של פנול, על פי היצרן ' הוראות s.
   3. סה כ RNA (2 µg) הוא אז הפוך עיבד באמצעות M-קמפנילה MLV רוורס טרנסקריפטאז כדי להשיג cDNA כתבנית. מבחני ה-PCR כמותי בזמן אמת מתבצעות עם SYBR Green ו- Gapdh משמש את בקרה פנימית-
2. רמת חלבון
   1. לאסוף את AGM בתרבית כמתואר לעיל בשלב 3.1.1.
   2. להכין את החלבון ומזכיר האסיפה תרבותי עם המאגר פירוק התא (10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 0.5% NP-40) המכיל מעכבי פרוטאז ושימוש עבור סופג המערבי כדי לזהות את רמת החלבון כפי שצוין בעבר תיאר ¹³.

4. המושבה יוצרי יחידות וזמינותו תרבות (CFU-C)

1. לאחר culturing במשך 2-3 ימים, לאסוף את האזורים AGM 1 מ"ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) לתוך צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 דקות ו מביצועם עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS)-37 מעלות צלזיוס
   הערה: הזמן הדרוש עבור collagenase ליצור תא יחיד-המתלים הוא כ-20 דקות. טלטול את הצינור המכיל AGM כל 5 דקות יכול להאיץ את תהליך העיכול. 200 µL 0.1% collagenase משמש עבור כל AGM ו 200 סרום 10% µL משמש כדי לעצור את התגובה.
2. תרבות תא יחיד-המתלים M3434 בינוני ב מצורף נמוך במיוחד טוב 24 צלחות.
   הערה: כדי למנוע זיהום, פניצילין-סטרפטומיצין הפתרון ניתן באופן סלקטיבי להוסיף לתוך האמצעי. מכיוון המדיום M3434 צמיגה, מזרק cc 1.0 בלי מחט משמשת כדי לערבב את התאים ואת בינונית.
3. לאחר 7 - 10 ימים culturing-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂, את המספר עבור כל סוג של מושבות כולל פרץ ויוצרים יחידה - erythroid (BFU-E), CFU-granulo-מונוציט (CFU-GM) ו- CFU-גרנולוציט, כדוריות דם אדומות, macrophage, מגקריוציט (CFU-GEMM) הם מכובדים התבסס על המורפולוגיה וכבש עם מיקרוסקופ הפוכה ( איור 2 ג).

5. אין ויוו השתלת Assay

1. המושבה יוצרי assay יחידות-הטחול (CFU-S)
   1. לאחר 2 - 3 ימים של explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד-המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) 20 הגבלת
   2. לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של צילומי רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.
   3. להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-
   4. לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.
   5. להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או יחידה להנדסת חשמל 1 תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0.
      הערה: תאים מושעים עם PBS, 0.5 mL PBS לכל נמען הוא אמצעי מתאים. מחט של מד 25 או 26 מד בגודל משמש הזרקה בעזרת מזרק cc 1.0. אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.
   6. אחד עשר ימים פוסט ההשתלה, לאסוף ולתקן את טחולים של העכברים הנמען ב Bouin ' s פתרון (תמיסה מימית של חומצה Picric 1.22% רווי 15 mL, 2 mL 40% מתנול ו 1 מ"ל חומצה אצטית) 1-2 ימים לשטוף עם 80% אלכוהול עוד 1-2 ימים. לספור את המושבות גלוי בהטחול בעין בלתי מזוינת, לקבוע את מספר מושבות לכל ee.
      ​ הערה: Bouin ' s מקבע, ללבוש הגנה הולמת.
2. Assay השתלת לטווח ארוך
   1. אחרי 2-3 ימים explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד - המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) במשך 20 דקות
   2. לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.
   3. להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-
   4. לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.
   < lאני > להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או הנדסת חשמל 1 יחיד תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0. AGM מוזרקים במינון של הנדסת חשמל 1 לכל נמען עם × 10 2 ⁵ תאים במח העצם (CD45.1 ברקע).
   הערה: אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.
   5. ארבעה חודשים שלאחר ההשתלה, לאסוף את מח העצם של הנמען ולהשתמש בו עבור וזמינותו שיחזור על ידי FACS. רק הנמענים עם ≥ 10% נגזר התורם chimerism נחשבים שהפגינו שיחזור מוצלח.

תוצאות

פרסום האחרונה דיווחו סרוטונין נגזר תא אנדותל מקדם ההישרדות של HSCs על ידי עיכוב מסלול פרו-אפופטוטיים להיפגע AGM¹³. כדי לאשר את ההשפעה קידום של סרוטונין על פיתוח HSC, נכללה פלואוקסטין. כמו מעכב ספיגת סרוטונין בררניים (SSRI), פלואוקסטין הוכח לעכב ספיגת סרוטונין מחדש רק...

Discussion

זה ידוע כי HSCs בוגרת במח העצם לשקם מערכת הדם של נמענים לקרינה. בניגוד HSCs פונקציונליים אלה, HSCs המתעוררים ב ומזכיר האסיפה של העכבר העוברים הן ילדותי. השתלת ישירה התוצאות הראו סוג זה אני (VE-cad⁺ CD45^– CD41⁺) לבין סוג II (VE-cad⁺ CD45⁺) טרום-HSCs בעלי אין יכולת שיחזור²⁰. נ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
durapore 0.65 µm filters	Millipore	R5BA63787	AGM explant culture
M5300 long-term culture medium	Stem Cell Technologies	5300	AGM explant culture
Trizol	Tiangen	5829	RNA extration
M-MLV reverse transcriptase	Promega	90694	reverse transcription
SYBR Green	Qiagen	A6002	quantatitive real-time PCR
protease inhibitor	Roche	55622	Protein extration
collagenase	Sigma	C2674	digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium	Stem Cell Technologies	3434	CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates	Costar	3473	CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		Long-term transplantation
phosphate buffered saline	Life Technologines	8115284	AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution	HyClone	SV30010	AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7	eBioscience	25-0454-80	Long-term transplantation
anti-CD45-FITC	eBioscience	11-0451-81	Long-term transplantation
UV lamp	Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD	039-14402	power: 30W
stainless steel mesh	AS ONE SHANGHAI Corporation	2-9817-10	aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone	Sigma	H0396	selectively diluted into M5300 medium