Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שימוש בתרבית העורקים-בלוטת המין-Mesonephros עבור הביטוי ניתוחים, יחידות המושבה יוצרי תרבות, הטחול ולאחר שיחזור לטווח ארוך כדי לקבוע את ההשפעה של גורמים רגולטוריים, איתות המסלולים על גזע hematopoietic תא פיתוח. זה הוכח כמו מערכת יעילה ללמוד ביולוגיה של התא גזע hematopoietic ותפקוד.

Abstract

המגבלה של שימוש בעכבר העוברים ללימודי hematopoiesis היא הנוחיות הנוספת במבצעים, אשר נובע במידה רבה התפתחות העובר תוך רחמי. למרות משכנעים מידע גנטי של עכברים knockout (KO), זה לא מציאותי ליצירת עכברים KO עבור כל הגנים כנדרש. בנוסף, ביצוע ויוו הצלה ניסויים כדי לאחד את הנתונים המתקבלים KO עכברים אינה נוחה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התרבות explant של אבי העורקים-בלוטת המין-Mesonephros (AGM) פותחה כמערכת המתאימה ללמוד פיתוח תאי גזע hematopoietic (HSC). במיוחד לניסויים הצלה, זה יכול לשמש כדי לשחזר את hematopoiesis לקוי בעכברים KO. על ידי הוספת כימיקלים המתאימים לתוך האמצעי, האיתות לקוי ניתן להפעיל מחדש או מסלולים מוסדר למעלה ניתן והשרירי אותו. עם השימוש בשיטה זו, ניסויים רבים שניתן לבצע כדי לזהות הרגולטורים קריטיים של התפתחות מועדון הכדורגל מונפלייה, כולל מועדון הכדורגל מונפלייה הקשורים גנים ב mRNA ורמות החלבון, המושבה היווצרות יכולת והקיבולת הכינון. זו סדרה של ניסויים יהיה מועיל בהגדרת המנגנונים המשמשת כבסיס חיוני לפיתוח HSC ביונקים.

Introduction

תאי גזע hematopoietic (HSCs) הם תאי גזע בוגרים רקמות ספציפיות כי בעלי פוטנציאל multilineage כולל erythroid, מיאלואידית, ו הלימפה התאים, כמו גם לחדש את עצמי. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי HSCs המוקדם התעוררו מתוך אוכלוסיה אנדותל מיוחדים, המכונה אנדותל hemogenic (HE), דרך אנדותל המעבר hematopoietic (בובה) בכותל הגחון של אבי העורקים הגבי1,2 3, ,4. לאחר שהוקמה באזור אבי העורקים-בלוטת המין-mesonephros (AGM) מעובריים (E) 10.5 כדי E12.5 העובר העכבר, HSCs נודדים אל הכבד העוברי של הרחבה, בסופו של דבר ליישב את מח העצם כדי לשמור על hematopoiesis למבוגרים לאורך החיים של הפרט 5 , 6. למרות זה נחקר במשך שנים רבות, המנגנון הבסיסי של מועדון הכדורגל מונפלייה הופעתה ופיתוח נשארים שהיישום מובן.

בניגוד הפריה במבחנה ופיתוח של דג זברה עוברי, פיתוח תוך רחמי העוברים העכבר הופך המחקר של hematopoiesis מוחלטת בזמן מופרה הרבה יותר נוח. למרות ניסויים גנטיים באמצעות הסתרה (KO) עכברים שאינם מנוצלים בדרך כלל, חוסר של עכברים KO מסוימים מגביל גם את השימוש בשטח המחקר hematopoietic. בנוסף, אין ויוו הצלה ניסויים לא בקלות מבוצעות בעכברים KO. מאז 1996, התרבות explant AGM פותחה ללימודי hematopoietic על ידי חלוצי בתעשיית השדה7. בעזרת מערכת זו תרבות, רקמות הגחון של האזור AGM זוהו לקדם פעילות מועדון הכדורגל מונפלייה, ואילו רקמות הגבי מפעילים של8,מול אפקט9. מערכת התרבות explant AGM הוחל גם כדי לקבוע את התפקידים של סרוטונין, הרישיון הציבורי של מוזילה, SCF, BMP וקיפוד איתות HSC פיתוח10,11,12,13, 14. חשוב, זה גם שיטה פופולארית נהגה להציל פגמים hematopoietic עוברי מוטציה13,15.

Protocol

כל ההליכים לרבות נושאים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת ביקורת אתית המכון לזואולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים, בייג'ינג, סין.

1. הכנת חומר

  1. Sterilize 0.65 מסננים מיקרומטר עם אולטרה סגול קרני מיוצר תחת אולטרה סגול ריי המנורה על הספסל נקייה במשך 4 שעות, להסגיר את המסננים לאחר הסימן 2 h.
    הערה: בעת עבודה עם אור UV, לענוד הגנה הולמת.
  2. לחטא את רשתות נירוסטה עם המעקר אוטוקלב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 mins.
    הערה: גובה מסוים של רשת נירוסטה יש צורך לתמוך את מסנני-הממשק אוויר נוזלי, זה יכול להתממש עם החוט על רשת השינוי פלדה ( איור 1 א').
  3. פלואוקסטין לדלל את ריכוז סופי של 10 מיקרומטר לתוך M5300 לטווח ארוך תרבות בינונית, מערבבים באופן שווה.
    הערה: על צלחת שש-. טוב, 2 מ"ל M5300 התרבות ארוכת טווח בינוני מתאים מכל קידוח. הידרוקורטיזון-10 -6 מ' יכול להיות סלקטיבי מדולל המדיום.
  4. להעביר את המדיום בתוספת פלואוקסטין-10 מיקרומטר. ובכן שש צלחות או מנות והכניסו את רשתות נירוסטה סטיריליים המדיום.
  5. לרחוץ את המסננים 0.65 מיקרומטר עם מים רותחים פעמיים במשך 3 דקות בכל פעם בצלחת תרבות תא זכוכית עבור עיקור. לאחר כל הכביסה, מכניסים את המסננים פוספט buffered מלוחים (PBS) במשך 2 דקות, במקום רטובה מסננת על גבי הנירוסטה רשתות שינוי עומדים על הממשק אוויר נוזלי כפי שמוצג באיור 1 A [סכמטי במרכז].
    הערה: מים רותחים יכול להיווצר עם המעקר החיטוי כדי להשיג את asepsis ואת הציוד צריך להילקח מתוך אוטוקלב מעקר במועד כדי למנוע ירידה בטמפרטורה.

2. AGM Explant תרבות

  1. הפרד בזהירות את האזורים AGM מן העוברים E10.5 או E11 עם מלקחיים.
    1. להסיר את uteruses של עכברים בהריון עם המספריים ויבתר, להפריד את העוברים uteruses.
    2. לנגב את שק החלמון הטבור, מעיים בגוף העובר.
    3. הסר בזהירות את רקמות עצב הגבי ואת הרקמות הסובבות שרירים.
    4. גזור הרקמות עם המלקחיים באתר של הגפיים הקדמיות, האחוריות לסירוגין להפריד את אזור AGM בגוף העובר. 1 דמויות B-C להראות הסמלית של המורפולוגיה של ביתור AGM-
  2. Explant את AGMs גזור בנפרד על גבי מסנני אוויר נוזלי ממשק ( איור 1 א'), תרבות 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
    הערה: לא למקם את AGM גזור על החוט של רשת השינוי פלדה ולוודא שהמסננים הינם הממשק אוויר נוזלי במהלך תרבות. חוץ ומזכיר האסיפה, שק החלמון והכבד בעובר יכול גם להיות תרבותי עם זו מערכת 7.

3. ניתוח ביטוי

  1. ברמת mRNA
    1. לאסוף את AGMs בתרבית לתוך 1 מ"ל PBS, צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 מינימלית
    2. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, RNA הכולל מופק מן AGMs שנאספו עם פתרון monophasic של פנול, על פי היצרן ' הוראות s.
    3. סה כ RNA (2 µg) הוא אז הפוך עיבד באמצעות M-קמפנילה MLV רוורס טרנסקריפטאז כדי להשיג cDNA כתבנית. מבחני ה-PCR כמותי בזמן אמת מתבצעות עם SYBR Green ו- Gapdh משמש את בקרה פנימית-
  2. רמת חלבון
    1. לאסוף את AGM בתרבית כמתואר לעיל בשלב 3.1.1.
    2. להכין את החלבון ומזכיר האסיפה תרבותי עם המאגר פירוק התא (10 מ מ טריס-HCl, 10 מ מ NaCl ו- 0.5% NP-40) המכיל מעכבי פרוטאז ושימוש עבור סופג המערבי כדי לזהות את רמת החלבון כפי שצוין בעבר תיאר 13.

4. המושבה יוצרי יחידות וזמינותו תרבות (CFU-C)

  1. לאחר culturing במשך 2-3 ימים, לאסוף את האזורים AGM 1 מ"ל תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) לתוך צנטריפוגה ב 4 ° C, g x 310 עבור 6 דקות ו מביצועם עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS)-37 מעלות צלזיוס
    הערה: הזמן הדרוש עבור collagenase ליצור תא יחיד-המתלים הוא כ-20 דקות. טלטול את הצינור המכיל AGM כל 5 דקות יכול להאיץ את תהליך העיכול. 200 µL 0.1% collagenase משמש עבור כל AGM ו 200 סרום 10% µL משמש כדי לעצור את התגובה.
  2. תרבות תא יחיד-המתלים M3434 בינוני ב מצורף נמוך במיוחד טוב 24 צלחות.
    הערה: כדי למנוע זיהום, פניצילין-סטרפטומיצין הפתרון ניתן באופן סלקטיבי להוסיף לתוך האמצעי. מכיוון המדיום M3434 צמיגה, מזרק cc 1.0 בלי מחט משמשת כדי לערבב את התאים ואת בינונית.
  3. לאחר 7 - 10 ימים culturing-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2, את המספר עבור כל סוג של מושבות כולל פרץ ויוצרים יחידה - erythroid (BFU-E), CFU-granulo-מונוציט (CFU-GM) ו- CFU-גרנולוציט, כדוריות דם אדומות, macrophage, מגקריוציט (CFU-GEMM) הם מכובדים התבסס על המורפולוגיה וכבש עם מיקרוסקופ הפוכה ( איור 2 ג).

5. אין ויוו השתלת Assay

  1. המושבה יוצרי assay יחידות-הטחול (CFU-S)
    1. לאחר 2 - 3 ימים של explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד-המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) 20 הגבלת
    2. לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של צילומי רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.
    3. להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-
    4. לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.
    5. להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או יחידה להנדסת חשמל 1 תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0.
      הערה: תאים מושעים עם PBS, 0.5 mL PBS לכל נמען הוא אמצעי מתאים. מחט של מד 25 או 26 מד בגודל משמש הזרקה בעזרת מזרק cc 1.0. אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.
    6. אחד עשר ימים פוסט ההשתלה, לאסוף ולתקן את טחולים של העכברים הנמען ב Bouin ' s פתרון (תמיסה מימית של חומצה Picric 1.22% רווי 15 mL, 2 mL 40% מתנול ו 1 מ"ל חומצה אצטית) 1-2 ימים לשטוף עם 80% אלכוהול עוד 1-2 ימים. לספור את המושבות גלוי בהטחול בעין בלתי מזוינת, לקבוע את מספר מושבות לכל ee.
      ​ הערה: Bouin ' s מקבע, ללבוש הגנה הולמת.
  2. Assay השתלת לטווח ארוך
    1. אחרי 2-3 ימים explant culturing, לאסוף את AGMs ולהכין תא יחיד - המתלים מאת המקננת עם collagenase µL 200 (0.1% ב- PBS) במשך 20 דקות
    2. לבצע הקרנה קטלני (9 Gy של רנטגן) של 8 עד 10 - בן שבועיים עכברים C57BL/6 זכרים 4-5 שעות לפני הזרקת תא.
    3. להכניס את העכבר לקרינה restrainer להגביל את פעילותה-
    4. לנגב את הזנב באמצעות מקלון צמר גפן ספוגים 75% אלכוהול כדי לקדם את vasodilatation של הווריד של.
      5. < lאני > להזריק 0.5 העובר המקביל (ee) או הנדסת חשמל 1 יחיד תא-המתלים של AGM לווריד לתוך וריד הזנב העכבר לקרינה עם מזרק cc 1.0. AGM מוזרקים במינון של הנדסת חשמל 1 לכל נמען עם × 10 2 5 תאים במח העצם (CD45.1 ברקע).
      הערה: אין אוויר שיוכל להיכנס לתוך המזרק. הקש ההזרקה עם ספוגית חיטוי כדי לעצור את הדימום.
    5. ארבעה חודשים שלאחר ההשתלה, לאסוף את מח העצם של הנמען ולהשתמש בו עבור וזמינותו שיחזור על ידי FACS. רק הנמענים עם ≥ 10% נגזר התורם chimerism נחשבים שהפגינו שיחזור מוצלח.

תוצאות

פרסום האחרונה דיווחו סרוטונין נגזר תא אנדותל מקדם ההישרדות של HSCs על ידי עיכוב מסלול פרו-אפופטוטיים להיפגע AGM13. כדי לאשר את ההשפעה קידום של סרוטונין על פיתוח HSC, נכללה פלואוקסטין. כמו מעכב ספיגת סרוטונין בררניים (SSRI), פלואוקסטין הוכח לעכב ספיגת סרוטונין מחדש רק...

Discussion

זה ידוע כי HSCs בוגרת במח העצם לשקם מערכת הדם של נמענים לקרינה. בניגוד HSCs פונקציונליים אלה, HSCs המתעוררים ב ומזכיר האסיפה של העכבר העוברים הן ילדותי. השתלת ישירה התוצאות הראו סוג זה אני (VE-cad+ CD45– CD41+) לבין סוג II (VE-cad+ CD45+) טרום-HSCs בעלי אין יכולת שיחזור20. נ...

Disclosures

המחברים יש אינטרסים כלכליים לא סותרים.

Acknowledgements

אנו מודים Suwei גאו לעזרה בהכנה איור. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81530004, 31425016) ואת משרד המדע הטכנולוגיה של סין (2016YFA0100500). J.L. לבצע את הניסויים, ניסח את כתב היד; F.L. לערוך את כתב היד. שני מחברים לקרוא ואושר היצירה הסופית.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
durapore 0.65 µm filtersMilliporeR5BA63787AGM explant culture
M5300 long-term culture mediumStem Cell Technologies5300AGM explant culture
Trizol Tiangen5829RNA extration
M-MLV reverse transcriptasePromega90694reverse transcription
SYBR GreenQiagenA6002quantatitive real-time PCR
protease inhibitorRoche55622Protein extration
collagenaseSigmaC2674digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 mediumStem Cell Technologies3434CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well platesCostar3473CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 miceBeijing HFK Bioscience Co. LtdCFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 miceBeijing HFK Bioscience Co. LtdLong-term transplantation
phosphate buffered salineLife Technologines8115284AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solutionHyCloneSV30010AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7eBioscience25-0454-80Long-term transplantation
anti-CD45-FITCeBioscience11-0451-81Long-term transplantation
UV lampBeijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD039-14402power: 30W
stainless steel meshAS ONE SHANGHAI Corporation2-9817-10 aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisoneSigmaH0396selectively diluted into M5300 medium

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129hematopoiesisMesonephrosexplant

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved