Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف لنا أسلوب يعزز انجرافتمينت أورثوتوبيك من خلايا سرطان الرئة في الرئتين مورين بتكييف قبل الخطوط الجوية مع الإصابة. وهذا النهج يمكن أيضا أن تطبق لدراسة التفاعلات اللحمية داخل الرئة المكروية، نشر المنتشر، وسرطان الرئة المراضات المشارك، وأكثر كفاءة توليد المريض المستمدة تكثيفها.

Abstract

سرطان الرئة هو مرض صهر علاج القاتل بيولوجيا غير متجانسة. هناك حاجة لفهم وعلاج فعال الطيف الكامل السريرية للأورام الخبيثة والصدر، نماذج حيوانية الإضافية التي يمكن إيجاز الأنواع الفرعية سرطان الرئة البشرية المتنوعة والمراحل. نماذج allograft أو xenograft تنوعاً وتمكين التحديد الكمي للقدرات الورمية في فيفو، باستخدام الخلايا الخبيثة أما مورين أو بشرية المنشأ. ومع ذلك، تم إجراء الأساليب المذكورة سابقا من سرطان الرئة الخلية انجرافتمينت في مواقع غير الفسيولوجية، مثل الجناح الفئران، بسبب عدم كفاءة أورثوتوبيك زرع الخلايا إلى الرئتين. في هذه الدراسة، يصف لنا طريقة لتعزيز engraftment خلية سرطان الرئة أورثوتوبيك من قبل التكييف الهوائية للفئران مع بليوميسين عامل حمل التليف. كتجربة من بين مفهوم الإثبات، قمنا بتطبيق هذا النهج انجرافت الخلايا السرطانية للرئة غدية النوع الفرعي، التي تم الحصول عليها من مصادر بشرية، أو الماوس في سلالات مختلفة من الفئران. نظهر أن إصابة الخطوط الجوية مع بليوميسين قبل حقن الخلايا السرطانية يزيد engraftment الخلايا السرطانية من 0-17% إلى 71-100%. عزز هذا الأسلوب كثيرا، حدوث ورم الرئة وثمرة اللاحقة باستخدام نماذج مختلفة وسلالات الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، نشر خلايا سرطان الرئة انجرافتيد من الرئتين إلى الأجهزة البعيدة ذات الصلة. وهكذا، نحن نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها لإنشاء وصيانة نماذج أورثوتوبيك جديدة من سرطان الرئة مع الحد من كميات من الخلايا أو بيوسبيسيمين وتقييم كمي الورمية قدرة خلايا سرطان الرئة في الإعدادات ذات الصلة فسيولوجيا .

Introduction

سرطان الرئة هو أبرز سبب السرطان المتعلقة بالوفيات في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة في نهاية المطاف الاستسلام من ورم خبيث على الأجهزة البعيدة، وخصوصا على الجهاز العصبي المركزي، والكبد، والغدد الكظرية، وعظام2،،من34. الأورام الخبيثة والصدر قد صنفت تقليديا كسرطان الرئة الخلية الصغيرة (مؤتمر القيادة المسيحية الجنوبية) أو (NSCLC) سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة5. NSCLC هو الأكثر تواترا تشخيص الأورام الخبيثة ويمكن تقسيمها إلى أنواع فرعية نسيجية مختلفة، بما في ذلك الرئة غدية (لواد) والرئة الخلايا الحرشفية (لوس)6. وقد كشف تحليل الجينوم من سرطانات الرئة الابتدائي البشرية مستأصل أن الأورام داخل هيستوتيبي معين يمكن أيضا أن أعرب عن اضطرابات جزيئية متنوعة، كذلك المساهمة في تقدمهم سريرية متباينة والخلط في تشخيص المريض. إلى التباين الملحوظ من سرطانات الرئة تمثل تحديا كبيرا للتصميم العقلاني والتجارب قبل الإكلينيكية، وتنفيذ استراتيجيات علاجية فعالة. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى توسيع مرجع نماذج سرطان الرئة التجريبية أصعب دراسة أصول الخلوية المتنوعة، والأنواع الفرعية الجزيئية، ومراحل لهذا المرض.

وقد استخدمت نهوج مختلفة باستخدام نماذج حيوانية لدراسة الرئة السرطان في فيفو، مع كل مزايا وعيوب اعتماداً السؤال (ق) البيولوجية لمصلحة. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) يمكن أن تستهدف التعديلات الوراثية المحددة في نوع خلية السلف المعطاة، أسفر عن أورام أن التقدم داخل الأشخاص مضيف7. بينما قوية للغاية وذات الصلة سريرياً، الاعتلال الورم الكمون وتقلبه، و/أو الرئة المرتبطة جيممس يمكن أن تكون باهظة لبعض القياسات الكمية والكشف عن ورم خبيث المرحلة المتأخرة في الأجهزة البعيدة8. نهج تكميلي هو استخدام نماذج allograft، يتحمل فيها خلايا سرطان الرئة، الحصول عليها أما مباشرة من ورم ماوس أو مشتقة أولاً كخطوط الخلايا المحددة في الثقافة، وإعادة إدخالها إلى المضيفين سينجينيك. المثل، تقام تكثيفها سرطان الرئة من خطوط الخلايا البشرية أو عينات المرضى الورم المشتقة. تكثيفها خط الخلية البشرية أو تكثيفها المشتقة المريض (بدكسس) يتم الاحتفاظ بصفة عامة في الفئران المناعة وذلك يحول دون مراقبة المناعة كاملة9. وعلى الرغم من هذا العيب، فهي توفر سبيلاً للترويج للحد من كميات من البشرية بيوسبيسيمينس والدراسة الأساسية في فيفو خصائص الخلايا السرطانية البشرية، التي ترميز للانحرافات الجينية أكثر تعقيداً من الأورام جيم.

خاصية مفيدة واحدة من اللوجرافتس وتكثيفها أنها قابلة للتقليدية تحد خلية تمييع فحوصات، المستخدمة لقياس تكرار الورم استهلال الخلايا (التشنجات اللاإرادية) داخل خلية خبيثة سكان10. في هذه التجارب، وعدد محدد من الخلايا يتم حقن تحت الجلد في الجناح الحيوانات وتكرار التشنجات اللاإرادية يمكن تقديرها استناداً إلى معدل أخذ الورم. الأورام تحت الجلد ولكن يمكن أن يكون أكثر التاكسج11 وقد لا نموذج القيود الفسيولوجية الرئيسية للرئة وورم المكروية. إعطاء إيصال الظهارية الجذعية أو خلايا السلف في رئات الفئران أسلوب لدراسة تجديد الرئوية و بيولوجيا الخلايا الجذعية مجرى الهواء12. ومع ذلك، يمكن أن تكون معدل انجرافتمينت من هذا الأسلوب منخفضة نسبيا، إلا الرئتين أولاً تتعرض لأشكال الفسيولوجية للإصابة، مثل العدوى الفيروسية13،14. الدعم من الخلايا اللحمية التحريضية و/أو الإخلال بغشاء الرئة الطابق السفلي قد يحسن الإبقاء على الخلايا المزروعة إلى منافذ الخلايا الجذعية ذات الصلة في الخطوط البعيدة15. قبل التليف الذي يحفز وكلاء يمكن أيضا حالة الرئتين إلى تعزيز engraftment المستحثة pluripotent الخلايا16 و17من الخلايا الجذعية الوسيطة. ما إذا كان يمكن أن تؤثر على أشكال مماثلة من إصابة مجرى الهواء بمعدل انجرافتمينت، قدرة بدء الورم، ويعتبر امتداداً لخلايا سرطان الرئة لم أن تقيم بصورة منتظمة.

في هذه الدراسة، يصف لنا وسيلة لزيادة كفاءة engraftment خلية سرطان الرئة أورثوتوبيك، بتكييف قبل رئات الفئران مع الإصابة. لواد ينشأ في الخطوط الجوية البعيدة مع مجموعة فرعية كبيرة من هذه السرطانات النامية ستروما تليفية18 التي غالباً ما ترتبط بسوء التشخيص19. بليوميسين، ببتيد هجين نونريبوسومال طبيعية--بوليكيتيدي، وقد استخدمت على نطاق واسع للحث على التليف الرئوي في الفئران20. أولاً يعزز تقطير مجرى الهواء من بليوميسين الاستنزاف الظهارية في الحويصلات الهوائية وتجنيد الخلايا التحريضية، بما في ذلك الضامة والعدلات وحيدات21. ويعقب هذا الأنسجة يعيد البناء في الخطوط البعيدة والغشاء إعادة تنظيم22،23 و ترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM)24. آثار حقنه واحدة بليوميسين عابرة، مع التليف حل بعد 30 يوما في معظم الدراسات25. استخدام نماذج allograft وإكسينوجرافت، ونحن اختبار إذا قبل التكييف الهوائية للفئران مع بليوميسين يمكن زيادة كبيرة في معدل أخذ الخلايا لواد في الرئتين.

Protocol

جميع التجارب التي أجريت وفقا للبروتوكولات المعتمدة "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) في جامعة ييل.

1-إعداد/إعداد المواد الكاشفة.

  1. بليوميسين
    تنبيه: بناء على عالمياً مواءمة النظام (GHS) لتصنيف ووسم المواد الكيميائية، بليوميسين تصنف خطرا على صحة GHS08.
    1. إعداد بليوميسين في غطاء كيميائية. ريسوسبيند 15 ش إلى 5 مل من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS).
    2. الكوة 100-200 ميليلتر من الحل في الزجاج زجاجة وتجميدها في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تسمية الأنابيب مع تاريخ تعليق بشكل صحيح. استخدام في غضون 6 أشهر من هذا التاريخ.
      ملاحظة: كل سلالة الماوس لديه حساسية مختلفة إلى بليوميسين26. من المستحسن اختبار جرعات مختلفة من بليوميسين لكل سلالة الماوس. يتم سرد سلالات الماوس وجرعات المقابلة بليوميسين المستخدمة في التجارب الممثلة في الجدول 1.
  2. الفئران
    1. شراء الفئران اللازمة للتجربة وتسمح الفئران 7 أيام إلى تأقلم قبل الحقن. إجراء دفعات في غطاء السلامة الأحيائية. نقل الحيوانات في غرفة BSL2 غير متوافقة مع إلى غرفة BSL2 باستخدام إجراءات مؤسسية موحدة قبل ضخ بليوميسين. حقن الفئران في 6-8 أسابيع عمر.
      تنبيه: حقن الفئران بعد المبادئ التوجيهية المؤسسية للعوامل الخطرة، السلامة البيولوجية المستوى 2 (BSL2)، والموافقة على إياكوك.
      ملاحظة: يتم سرد الفئران التي تم شراؤها للتجارب الممثلة في الجدول للمواد. وقد استخدمت الفئران الذكور فقط.
  3. خطوط خلايا سرطان الرئة
    1. الثقافة المرجوة خطوط الخلايا في وسائل الإعلام الخاصة بكل منها. قبل الحقن، إجراء التنميط الحمض النووي تكرار tandem قصيرة أو الاختبارات الجينية التأكد من تحديد خط الخلية الصحيحة. لتسهيل في فيفو و السابقين فيفو التصوير، تصيب خطوط الخلايا مع لينتيفيروس الإعراب عن thymidine كيناز والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) و مراسل الانصهار لوسيفراس27، وفرز الخلايا إيجابية المراسل بالأسفار تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) قبل انجرافتمينت. اختبار خطوط مفطورة كل 6 أشهر.
      1. الثقافة خط خلية سرطان البشرية حسبما أوصت به الشركة المصنعة استخدام روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسط (ربمي) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، H2030 البنسلين والستربتوميسين، والامفوتريسين b
      2. الثقافة خط الخلية مورين 368T1 (مشتقة من ماوس كراسG12D؛ p53--/-- ) باستخدام المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) مع 10% FBS، البنسلين والستربتوميسين، والامفوتريسين b
      3. الثقافة خط خلية سرطان البشرية PC9 استخدام ربمي مع 10% FBS، البنسلين والستربتوميسين، والامفوتريسين b

2-بليوميسين المعاملة

  1. خطة حقن الفئران إينتراتراتشيلي مع بليوميسين 14 يوما قبل ورم الخلايا انجرافتمينت.
  2. تحسن الأسهم بليوميسين على الجليد ح 2 قبل الحقن.
  3. بمجرد إذابة، تمييع بليوميسين إلى تركيز العمل المطلوب (0.02 U/50 ميليلتر أو 0.005 U/50 ميليلتر)، وتبقى على الجليد.
    ملاحظة: تركيز بليوميسين يعتمد على سلالة الماوس المستخدمة للتجارب (الجدول 1). ينبغي إجراء المعايرة بليوميسين في الفئران لتحديد الجرعة المثلى.
  4. إعداد التخدير بتمييع الكيتامين وإكسيلازيني بتركيز نهائي 10 ملغ/مل و 1 ملغ/مل، على التوالي، باستخدام إبرة المحقن و 27 ز 1 مل، تخدير كل الماوس عن طريق حقن محلول إينترابيريتونيلي الكيتامين/xylazine عند 100/10 مغ/كغ على التوالي.
  5. مراقبة التنفس للفئران وتوظيف قرصه أخمص القدمين. تأكيد أنيسثيتيزاتيون السليم عند الماوس لا يستجيب إلى أخمص القدمين قرصه. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  6. ضع الماوس 1 في كل مرة على منصة تنبيب شنقاً في الأسنان الأمامية مع ظهرها ضد النظام الأساسي.
  7. إلقاء الضوء على أعلى الصدر باستخدام إضاءة الألياف البصرية للمساعدة مع التصور من القصبة الهوائية. فتح فم الماوس وسحب اللسان بلطف مع الملقط شقة العقيمة.
  8. استخدام قسطرة الوريدية دون الإبرة لتجنب عرقلة التنفس. موقف القسطرة عبر الضوء الأبيض المنبعث من فتح القصبة الهوائية.
  9. أدخل القسطرة في القصبة الهوائية حتى تصل إلى الجزء العلوي من القسطرة الأسنان الأمامية. تأكيد الموضع المناسب للقسطرة في القصبة الهوائية بتصور على ضوء أبيض ساطع من خلال فتح القسطرة في الفم.
  10. استخدام ماصة، الاستغناء عن 50 ميليلتر بليوميسين أو مركبة (PBS) مباشرة في القسطرة التأكد من أنه يتم استنشاقه وحدة التخزين بأكملها. تنفيذ هذه الخطوة تحت ظروف معقمة.
  11. إذا كانت القسطرة يتم إدراجها بشكل صحيح، سيتم فورا يستنشق الماوس محتويات القسطرة. انتظر بضع ثوان حتى يسافر وحدة التخزين بأكملها أسفل القسطرة. ثم إزالة القسطرة من القصبة الهوائية والتصرف في حل التبييض 10%.
    ملاحظة: متوسط الوقت كل ماوس خطوات 2.7-2.11 حوالي 5 دقائق.
  12. إذا كان الماوس هو عدم استنشاق السائل، بعناية مراقبة التنفس وضبط موضع القسطرة. إذا كان الماوس توقف التنفس، إزالة القسطرة فورا والسماح للماوس لاستئناف التنفس عادة قبل إعادة إدخال القسطرة.
  13. ضع الماوس حقن على منصة تدفئة معتمدة إياكوك على ظهورهم على سطح مستو للانتعاش. الإجراء بأكمله سوف يستغرق 10 دقيقة للماوس. لا يعود حيوان الذي خضع للحقن لشركة الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما.
  14. ضع بطاقة "الخطرة استخدام المواد الكيميائية في" في القفص ح 24.

3-رصد الفئران بعد تنبيب

  1. مراقبة الفئران للضائقة التنفسية فورا بعد التنبيب وثم كل 15 دقيقة حتى الفئران الاستيقاظ من التخدير. لا تترك الفئران غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  2. حقن كيتوبروفين (5 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي لتخفيف حدة الألم.
  3. دراسة تنبيب وظيفة ح 24 الفئران و 3 مرات في أسبوع لأي علامات على الإصابة بالأمراض.
  4. الاحتفاظ بسجل لتاريخ الإجراء، تحديد الحيوان، نوع الإجراء، نوع من الملاحظات رصد مخدر، وبعد العمليات الجراحية مع الأوقات.
  5. رصد الفئران لفقدان الوزن والضائقة التنفسية والتشوهات السلوكية ودرجة شرط جسم < 2 (تجزئة عظام الحوض واضح/الظهرية العمود الفقري ملموسة) مرتين أسبوعيا بعد حقن بليوميسين.
  6. Euthanize الفئران تحت الضائقة التنفسية أو الفئران التي عانت من فقدان 15% من كتلة الجسم CO2 أو الكيتامين/xylazine متبوعاً بخلع عنق الرحم. تأكيد القتل الرحيم بإجراء الجس لنشاط الجهاز التنفسي.

4-انجرافتمينت خطوط الخلايا غدية الرئة.

ملاحظة: إجراء engraftment الخلايا 14 يوما بعد حقن بليوميسين (الخطوة 2، 1).

  1. السماح للخلايا تنمو في 75 سم2 قوارير دون عائق لمدة 3 أيام قبل اليوم الحقن مع وسائل الإعلام المقابلة كما ذكر في الخطوة 1، 3.
    ملاحظة: ينبغي أن يكونوا روافد 80% في يوم الحقن (الذي يقابل إلى 2-3 × 106 في كل قارورة اعتماداً على خط الخلية).
  2. تغسل الخلايا المتزايد على 75 سم2 قوارير مع 5 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 1.5 مل التربسين للخلايا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى فصل الخلايا (عادة 2-5 دقائق).
    ملاحظة: نوصي بفحص كل 2 دقيقة للخلية المفرزة من البلاستيك بالتصور البسيط للأسفل في قارورة أو تحت مجهر خفيفة. لا تتعدى 5 دقائق للحضانة مع التربسين.
  4. تحييد التربسين بإضافة 4 مل وسائط التي تحتوي على 10% FBS (نفس وسائل الإعلام كخطوة 4.1). جمع الخلايا في أنبوب 15 مل والطرد المركزي أنه في 200 غ س لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  5. نضح وسائط الإعلام وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني لغسل الخلايا. الطرد المركزي الخلايا في 200 غ س لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بيليه الخلايا. كرر هذا الوقت 1.
  6. نضح في برنامج تلفزيوني وريسوسبيند بيليه في 1.5 مل من برنامج تلفزيوني في قارورة.
  7. مزيج 50 ميليلتر من خليط الخلية مع 50 ميليلتر تريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام دائرة خلية عداد/هيموسيتوميتير28.
  8. إعداد تعليق خلية بتمييع الخلايا في برنامج تلفزيوني لحقن الخلايا5 1 × 10 (أو المبالغ الأخرى المشار إليها) في 50 ميليلتر للماوس. تبقى الخلايا على الجليد قبل الحقن.
    ملاحظة: إعداد خلايا على الأقل أكثر مرتين للحقن لتجنب نفاد تعليق خلية.
  9. إعداد التخدير بتمييع الكيتامين وإكسيلازيني بتركيز نهائي 10 ملغ/مل و 1 ملغ/مل، على التوالي، باستخدام إبرة المحقن و 27 ز 1 مل، تخدير كل الماوس عن طريق حقن محلول إينترابيريتونيلي الكيتامين/xylazine عند 100/10 مغ/كغ على التوالي.
  10. مراقبة التنفس للفئران وتوظيف قرصه أخمص القدمين. تأكيد أنيسثيتيزيشن السليم عند الماوس لا يستجيب إلى أخمص القدمين قرصه. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  11. ضع الماوس 1 في كل مرة على منصة تنبيب شنقاً في الأسنان الأمامية مع ظهرها ضد النظام الأساسي.
  12. إلقاء الضوء على أعلى الصدر باستخدام إضاءة الألياف البصرية للمساعدة مع التصور من القصبة الهوائية.
  13. ريسوسبيند برفق باستخدام ماصة p200 للتأكد من أنها لا تشكل كتل الخلايا. فتح فم الماوس وسحب اللسان بلطف مع الملقط شقة العقيمة.
  14. استخدام إزالة قسطرة الوريدية مع الإبرة لتجنب عرقلة التنفس. موقف القسطرة عبر الضوء الأبيض المنبعث من فتح القصبة الهوائية.
  15. أدخل القسطرة في القصبة الهوائية حتى تصل إلى الجزء العلوي من القسطرة الأسنان الأمامية. تأكيد الموضع المناسب للقسطرة في القصبة الهوائية بتصور على ضوء أبيض ساطع من خلال فتح القسطرة في الفم.
  16. استخدام ماصة، الاستغناء عن 50 ميليلتر من الخلايا مباشرة في القسطرة التأكد من أنه يتم استنشاقه وحدة التخزين بأكملها. تنفيذ هذه الخطوة تحت ظروف معقمة.
    ملاحظة: الماوس إذا القسطرة يتم إدراجها بشكل صحيح، سوف يستنشق محتويات القسطرة فورا.
  17. انتظر بضع ثوان حتى يسافر وحدة التخزين بأكملها أسفل القسطرة، ومن ثم إزالة القسطرة من القصبة الهوائية والتصرف في حل التبييض 10%.
  18. إذا كان الماوس هو عدم استنشاق السائل، بعناية مراقبة التنفس وضبط موضع القسطرة. إذا كان الماوس توقف التنفس، إزالة القسطرة فورا والسماح للماوس لاستئناف التنفس عادة قبل إعادة إدخال القسطرة.
    ملاحظة: متوسط الوقت كل ماوس خطوات 4.11-4.18 حوالي 5 دقائق.
  19. ضع الماوس حقن على منصة تدفئة معتمدة إياكوك على ظهورهم على سطح مستو للانتعاش.
    ملاحظة: الإجراء بأكمله سوف يستغرق 10 دقيقة للماوس. لا يعود حيوان الذي خضع للحقن لشركة الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما.
  20. حلاقة منطقة الضلع كامل كلا بطنيا ودورسالي B6129SF1/ي وغيرها سلالات الماوس مع الشعر الداكن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية قبل التصوير.
  21. 2-3 دقيقة بعد حقن الخلايا، حقن 100 ميليلتر من لوسيفرين الرجعية-أوربيتالي (15 ملغ/مل) تستخدم إبرة الأنسولين. البديل العين المستخدمة لحقن كل دورة التصوير.
  22. بعد 2 دقيقة على الأقل، ضع الماوس تصل إلى 5 في تصوير الإضاءة الحيوية حيوانية في موقف ريكومبينسي الظهرية واكتساب صورة البطني باستخدام إعدادات التﻷلؤ29.
  23. إطار لوحة التحكم ضبط إعدادات القرار والحساسية لقياس التﻷلؤ خط خلية معينة. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ابدأ مع 3 دقيقة (أو "تلقائي" إذا المشبعة)، binning = المتوسطة (4)، و/إيقاف = 1، مجال الرؤية = د، "موضوع الارتفاع" = 1.50.
    ملاحظة: إذا كان الحقن بنجاح، يتم اكتشاف إشارة التﻷلؤ في منطقة أعلى الصدر، في رئة واحدة أو كلا الرئتين.
  24. الوجه الفئران على موقف ريكومبينسي القصية، وتحصل على صورة الظهرية كما ذكر أعلاه.
    ملاحظة: إذا كان لا يتم حقن الخلايا بشكل صحيح، قد كتلة الخلايا عند مدخل القصبة الهوائية أو في الرقبة.
  25. حقن كيتوبروفين 5 ملغ/كغ إينترابيريتونيلي لتخفيف حدة الألم.
  26. نقل الفئران مرة أخرى إلى القفص بهم ووضع بطاقة "BSL-2 عامل في استخدام" في القفص.
  27. مراقبة الفئران للضائقة التنفسية فورا بعد التنبيب، وثم كل 15 دقيقة حتى الفئران الاستيقاظ من التخدير. لا تترك الفئران غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  28. دراسة تنبيب وظيفة ح 24 الفئران وثلاث مرات في أسبوع لأي علامات على الإصابة بالأمراض.
  29. الاحتفاظ بسجل في سجل تاريخ الإجراء، تحديد الحيوان، ونوع الإجراء، اكتب ملاحظات الرصد مخدر وبعد العمليات الجراحية ومرات.
  30. رصد الفئران لفقدان الوزن والضائقة التنفسية والتشوهات السلوكية ودرجة شرط جسم < 2 (تجزئة عظام الحوض واضح/الظهرية العمود الفقري ملموسة) مرتين أسبوعيا عقب تلقيح بليوميسين.
    ملاحظة: قد يحمل الفئران بأورام الرئة تهيج الجهاز التنفسي وفقدان الوزن ودنف، أو الموت.
  31. Euthanize الفئران تحت الضائقة التنفسية أو الفئران التي عانت من فقدان 15% من كتلة الجسم بأول أكسيد الكربون2 أو بواسطة الكيتامين/xylazine يليه سرطان عنق الرحم التفكك إذا جمع الأنسجة. تأكيد القتل الرحيم بإجراء الجس لنشاط الجهاز التنفسي.

5-رصد نمو الورم بتصوير الإضاءة الحيوية

  1. تكرار تصوير الفئران في انجرافتمينت بعد يوم 3 وأسبوعية بعد ذلك.
  2. تخدير الفئران بالحقن الكيتامين/إكسيلازيني (كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.5) أو بواسطة isoflurane المستنشقة (2 في المائة). مراقبة التنفس للفئران وتوظيف قرصه تو لتأكيد أنيسثيتيزيشن السليم. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  3. حلاقة منطقة الضلع كامل كلا بطنيا ودورسالي B6129SF1/ي وغيرها سلالات الماوس مع الشعر الداكن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية قبل التصوير.
  4. مرة على الفئران تحت التخدير، حقن 100 ميليلتر من لوسيفرين الرجعية-أوربيتالي (15 ملغ/مل) تستخدم إبرة الأنسولين. انتظر 2 دقيقة المناوب العين المستخدمة لحقن كل دورة التصوير.
  5. وضع الفئران في التصوير واقتناء الصور الظهرية والبطني كما هو موضح في الخطوات 4.22-4.24.
  6. ضع الفئران مرة أخرى إلى القفص بعد تصوير، على ظهورهم على سطح مستو للانتعاش.
    ملاحظة: سوف تتخذ الإجراء بأكمله 5 دقيقة لكل مجموعة من الفئران 5. لا تترك الفئران غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية.
  7. تحليل الصور باستخدام برمجيات تحليل تصوير/الإضاءة الحيوية.
    1. واختيار الصور المناسبة وتحميلها كمجموعة في برنامج تحليل الإضاءة الحيوية.
    2. انقر فوق دوروا أداة | ساحة إضافة منطقة مربعة للفائدة (العائد على الاستثمار). ضع دوروا على منطقة أعلى الصدر، وتغطي الصورة كامل الرئة. كرر هذه العملية لكل صورة الماوس.
    3. انقر بالزر الأيمن وحدد دالة نسخ جميع عائدات الاستثمار لتطبيق نفس العائد على الاستثمار لكل الصور في المجموعة ووضعها في أعلى الصدر من الفئران، آراء البطني والظهري على حد سواء.
    4. في الزاوية العلوية اليسرى من إطار الصورة، حدد الدالة الفوتونات . انقر فوق دالة لوحة التحكم قياس لقياس رويس. نسخ ولصق جدول الإخراج الذي يحتوي على مجموع الجريان (الفوتونات/s) في برنامج المفضل لتحليل البيانات كذلك.
    5. تطبيع قيمة العائد على الاستثمار اليومية كل الماوس إلى قيمته دوروا يقاس في اليوم 0.

6-الأنسجة العزلة والتجهيز.

  1. تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين/إكسيلازيني (كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.5 أو عن طريق استنشاق isoflurane (2 في المائة). مراقبة التنفس للفئران وتوظيف قرصه أخمص القدمين. تأكيد أنيسثيتيزيشن السليم عند الماوس لا يستجيب إلى أخمص القدمين قرصه. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
  2. حقن 100 ميليلتر من لوسيفرين الرجعية-أوربيتالي (15 ملغ/مل) تستخدم إبرة الأنسولين. انتظر 2 دقيقة.
  3. صورة الفئران بعد الخطوات 4.22-4.24 من هذا البروتوكول.
  4. حقن في العين الأخرى من الخطوة 6، 2 ميليلتر 100 آخر من لوسيفرين الرجعية-أوربيتالي استخدام إبرة الأنسولين قبل القتل الرحيم.
  5. Euthanize الفئران بالحقن داخل من الكيتامين/إكسيلازيني (راجع الخطوة 2، 4 لمزيد من التفاصيل) تليها التفكك عنق الرحم إذا كانت الفئران تحت التخدير العميق وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها إياكوك. تأكيد القتل الرحيم بإجراء الجس لنشاط الجهاز التنفسي.
  6. استخدام مقص جراحي معقم جعل شق جلد أسفل القص. فتح طبقة العضلات على طول الحاجز باستخدام الملقط، والمقص الجراحي وفضح تجويف الصدر بالقطع عن طريق القفص الصدري على أي من الجانبين الأفقي تجنب الشرايين الصدرية الداخلية.
  7. نتخلل الماوس عن طريق إجراء شق صغير في الاذين الأيمن من القلب وضخ 5 مل من برنامج تلفزيوني عن طريق البطين الأيسر. سوف تذهب لون أنسجة الرئة من اللون الأحمر إلى الأبيض الوردي شاحب إذا نضح الدم يتم بشكل صحيح.
  8. المكوس الرئتين من تجويف الصدر بعناية قبل الاستيلاء على المريء أو القلب بالملقط. بلطف سحب الأنسجة واستخدام المقص الجراحي لقطع الأنسجة يربط تجنب ثقب أنسجة الرئة بعناية. الحفاظ على القصبة الهوائية قدر الإمكان للتضخم في الشعب الهوائية في الرئة في خطوة لاحقة.
  9. تغسل الرئة بغمر ويحوم الأنسجة 3 مرات في صفيحة جيدا 6 مليئة 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الدم الزائد.
  10. وضع الرئة على غطاء لوحة 6 جيدا، ووضع الغطاء الذي يحتوي على الأنسجة في تصوير طرحه والحصول على صورة الإنارة30.
    ملاحظة: من المستحسن اختيار الإعدادات التالية من "لوحة تحكم حيازة" "مجال الرؤية = A" و "موضوع الارتفاع = 0.75 سم" وثم "السيارات التعرض" لتجنب الحصول على صور مشبعة.
  11. الرسوم والصور الأجهزة الأخرى، كما فعلت في الخطوة 6.9-6.10، حيث حددت ورم خبيث التﻷلؤ، مثل الدماغ، الكبد، الغدة الكظرية، العظام، الغدد الليمفاوية، والكلى أو الطحال31.
  12. نتخلل الرئة مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% عن طريق إدراج الإبرة في القصبة الهوائية للماوس. وسوف تضخم الرئتين إذا بيرفوسيد جيدا.
    تنبيه: بارافورمالدهيد 4% سمية وصحة المخاطر GHS07 و GHS08.
  13. نقل الرئتين إلى 15 مل مخروطية مع 5 مل بارافورمالدهيد 4%.
  14. إصلاح الرئتين أو الأنسجة الأخرى التي تفرخ الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4% بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في جهاز هز 30-50 لفة في الدقيقة.
  15. تضمين الرئتين (أو الأنسجة الأخرى) في البارافين أو درجة الحرارة المثلى قطع مجمع تبعاً للتطبيق32.
    ملاحظة: البارافين هو الأسلوب المفضل للحفاظ على هيكل الرئة و Trichrome ماسون وتلوين الهيماتوكسيلين ويوزين.

النتائج

لزيادة كفاءة لواد سرطان الخلية انجرافتمينت إلى الرئتين من الفئران، قمنا بتطوير بروتوكول أولاً قبل الأحوال الجوية باستخدام بليوميسين متبوعاً بحقن خلية الورم أورثوتوبيك (الشكل 1). وأكد لنا أنه حتى عندما تدار في الفئران athymic المناعة، بليوميسين الناجمة عن ا?...

Discussion

وقد وثقت يوازي السريرية ملفتة للنظر بين سرطان الرئة وغيره من الأمراض المزمنة ل الرئة36. على وجه الخصوص، المرضى الذين يعانون من تليف رئوي مجهول السبب (الحكومي) زيادة ميل لتطوير سرطان الرئة، وهذه الرابطة مستقلة عن التدخين التاريخ37،38. مقترحات تتسم...

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (R01CA166376 و R01CA191489 إلى نغوين مركزي) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0227 إلى نغوين مركزي).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNCAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344To anesthetize mice
XylazineButler Schein33198To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powderPerkin Elmer Health Sciences Inc122799For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation standBraintree ScientificRIS-100Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MTo illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serratRobozRS-5111For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable ShaverConair-To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut bladesRobozRS-5840SC
15 mL conical tubeBD / Fisher352097
1.5 mL centrifuge tubesUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPIFisher701350
Filter pipette tips (200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM high glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Fetal bovine serum USDALife Technologies10437-028
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue capFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262For in vivo bioluminescence imaging
Living image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia SystemPerkin Elmer Health Sciences Inc118918For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1mlBD / Fisher14-823-434For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needleBD / Fisher305111For intraperitoneal injections
4% ParaformaldehydeVWR43368-9MCAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer's HematoxylinELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slidesFisher1255015
6 well plateCorningC3516
Universal Mycoplasma Detection KitATCC30-1012K
OCT Embedding compoundELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 STo section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) miceCharles RiverNIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) miceJackson Laboratories5557
B6129SF1/J miceJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellsATCCCRL-5914
368T1generously provided by Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved