JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем метод значительно повысить ортотопическая приживления клеток рака легкого в мышиных легкие путем предварительного кондиционирования airways с травмой. Этот подход может также применяться к исследованию стромальные взаимодействий внутри легких микроокружения, метастатические распространения, сопутствующие заболевания раком легких, и более эффективно создавать пациента производной ксенотрасплантатов.

Аннотация

Рак легких является смертельной лечения огнеупорных болезнь, которая является биологически гетерогенной. Чтобы понять и эффективно лечить полный Клинический спектр грудной клетки злокачественных опухолей, необходимы дополнительные Животные модели, которые можно резюмировать подтипы рака различных человеческих легких и этапов. Аллотрансплантатом или гранулы ксенотрансплантата модели универсальны и дать количественную оценку онкогенной потенциала в естественных условиях, используя злокачественных клеток мышиных или человеческого происхождения. Однако ранее описанных методов приживления клеток рака легких выполнены в не физиологические сайтов, таких как фланг мышей, из-за неэффективности ортотопическая трансплантации клеток в легкие. В этом исследовании мы описываем метод для повышения ортотопическая легких рак клеток приживления путем предварительного кондиционирования airways мышей с фиброзом блеомицин заставить агент. Как доказательство концепции эксперимент мы применяли такой подход привить опухолевых клеток подтипа аденокарциномы легкого, полученные из антропогенных источников, или мыши в различных штаммов мышей. Мы демонстрируем, что ранив airways с блеомицин до инъекции клеток опухоли увеличивает приживления опухолевых клеток от 0-17% до 71-100%. Существенно этот метод расширения распространенности опухоли легких и последующие нарост, с использованием различных моделей и мыши штаммов. Кроме того раковые клетки прижившимися легких распространять из легких в соответствующих отдаленные органы. Таким образом мы предоставляем протокол, который может использоваться для создания и поддержания новых моделей ортотопическая рака легких с ограничением количества клеток или биопрепаратов и количественно оценить онкогенной способность клеток рака легкого в физиологически соответствующие параметры .

Введение

Рак легких является ведущей причиной рака связанных смертей во всем мире1. У пациентов с раком легких в конечном итоге уступить от метастазов в отдаленные органы, в частности для центральной нервной системы, печени, надпочечники и кости2,3,4. Грудной клетки злокачественных опухолей традиционно были классифицированы как мелкоклеточный рак легких (МРЛ) или легких немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)5. НМРЛ — наиболее часто диагноз злокачественных новообразований и можно подразделить различных гистологических подтипов, включая аденокарциноме легкого (LUAD) и легких плоскоклеточный рак (LUSC)6. Геномный анализ резецированный человека первичного рака легких показал, что опухоли в пределах данного histotype можно также выразить различных молекулярных возмущений, далее вклад их различные клинические прогрессии и смешанным пациента прогноз. Замечательные гетерогенность рака легких представляет собой значительный вызов рациональный дизайн, Доклинические испытания, и осуществления эффективных терапевтических стратегий. Следовательно существует необходимость расширить репертуар шансов справиться с возникающими экспериментальной легких Рак моделей для изучения различных клеточных происхождение, молекулярные подтипы и стадиях этого заболевания.

Различные подходы с использованием животных моделей были использованы для изучения легких Рак в естественных условиях, каждый имеет свои собственные преимущества и недостатки в зависимости от биологических вопрос(ы) интерес. Генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) можно ориентировать конкретные генетические изменения в данной прародитель типа клеток, что приводит к опухоли, прогресс в рамках иммунокомпетентных принимающей7. Хотя чрезвычайно мощный, клинически значимых задержка, изменчивость и/или легких заболеваемости опухоли, связанные с GEMMs может быть непомерно высокой для определенных количественных измерений и обнаружения поздней стадии метастазирования в отдаленные органы8. Дополнительный подход является использование аллотрансплантата моделей, whereby клеток рака легкого, получены либо непосредственно от мыши опухоли или производные сначала как установленные клеточных линий в культуре, повторно введены в сингенных хостов. Аналогично от линий клеток человека или больного производных опухоли образцы устанавливаются ксенотрасплантатов рака легких. Ксенотрасплантатов линии клеток человека или больного производных ксенотрасплантатов (PDXs) обычно поддерживаются в мышах с ослабленным иммунитетом и поэтому препятствует полной иммунной наблюдения9. Несмотря на этот недостаток они обеспечивают возможность распространить ограничения количества человеческого biospecimens и исследование фундаментальных в vivo свойств человеческих раковых клеток, которые кодируют для более сложных геномной аберраций чем ГЭММ опухоли.

Одно полезное свойство аллотрансплантация тканей и ксенотрасплантатов является, что они поддаются традиционные ограничения анализов разрежения клеток, используемых для количественной оценки частоты опухоли, инициирование клетки (тики) в пределах злокачественных клеток населения10. В этих экспериментах определенное количество клеток подкожно вводят в бочку животных и частота тики могут быть оценены основе опухоли взять курс. Подкожной опухоли однако может быть более гипоксических11 и не может модель основных физиологических ограничения микроокружения опухоли легких. Доставка трахею эпителиальных стволовых и прогениторных клеток в легкие мышей является метод для изучения легких регенерации и биологии стволовых клеток дыхательных путей12. Однако приживления ставка от этой техники может быть относительно низким, если легкие сначала подвергается физиологических форм травмы, такие, как вирусная инфекция13,14. Поддержка от воспалительных стромальных клеток и/или нарушение базальной мембраны легких может улучшить удержание пересаженные клетки в соответствующих стволовых клеток ниши в дистальной airways15. Фиброз, вызывая агентов можно также предварительно состояние легких активизировать приживления индуцированных плюрипотентных клеток16 и17мезенхимальных стволовых клеток. Ли аналогичные формы повреждения дыхательных путей может повлиять на уровень приживления, инициирующей потенциала опухоли и нарост клеток рака легкого еще предстоит систематически оценивать.

В этом исследовании мы опишем способ повышения эффективности приживления ячейки рака легкого ортотопическая, путем предварительного кондиционирования легких мышей с травмой. LUAD возникает в дистальных дыхательных путях с значительное подмножество этих видов рака, развитие фиброзных стромы18 , которая часто коррелирует с плохим прогнозом19. Блеомицин, пептид гибрид естественный Нерибосомные-поликетидного, широко использовались побудить легочного фиброза в мышей20. Сократимость миокарда инстилляции блеомицин сначала способствует эпителиальных убыли в альвеолы и набор воспалительных клеток, в том числе21макрофагов, нейтрофилов и моноцитов. Это сопровождается тканей ремоделирования в дистальных дыхательных путей, базальной мембраны реорганизации22,23 и внеклеточного матрикса (ECM) осаждения24. Последствия введения единого блеомицин являются временными, с фиброзом урегулирования после 30 дней в большинстве исследований25. С помощью модели аллотрансплантата и гранулы ксенотрансплантата, мы проверили, если предварительного кондиционирования airways мышей с блеомицин может значительно увеличить скорость взять LUAD клетки в легких.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденным на институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Йельском университете.

1. Установка / Подготовка реагентов.

  1. Блеомицин
    Предупреждение: Основываясь на глобально согласованной системы (СГС) классификации и маркировки химических веществ, блеомицин классифицируется как GHS08 опасность для здоровья.
    1. Подготовьте блеомицин в химические вытяжки. Ресуспензируйте 15 U в 5 мл стерильной фосфатный буфер (PBS).
    2. Аликвота 100-200 мкл раствора в стеклянных ампул и заморозить их при-20 ° C для использования в будущем. Правильно этикетке трубки с датой ресуспендирования. Использовать в течение 6 месяцев с этой даты.
      Примечание: Каждый штамм мышь имеет различную чувствительность к блеомицин26. Тестирование различных доз блеомицин для каждого штамма мыши рекомендуется. Штаммы мыши и соответствующие дозы блеомицина, используемая в экспериментах по представительной, перечислены в таблице 1.
  2. Мыши
    1. Приобрести необходимые для эксперимента мышей и позволяют мышей 7 дней, чтобы акклиматизироваться перед инъекцией. Выполняют инфузии в капюшоне биобезопасности. Передача животных, размещены в комнате совместимый не BSL2 в BSL2 комнату с использованием стандартных институциональных процедур до блеомицин инфузии. Придать мышей в возрасте 6-8 недель.
      Предупреждение: Inject мышей после институциональных руководящих принципов для опасных агентов, 2-го уровня биобезопасности (BSL2) и IACUC утверждения.
      Примечание: Мышей, приобрели для представителя экспериментов, перечислены в Таблице материалов. Были использованы только самцов мышей.
  3. Линии клетки рака легких
    1. Линии клетки в культуре желаемого в их соответствующих средствах массовой информации. До инъекции выполните короткий тандеме повторить профилирование ДНК или генетическое тестирование для обеспечения надлежащего ячейки строки идентификации. Для облегчения in vivo и ex vivo изображений, заразить клеточных линий с человека, выражая Тимидинкиназа, Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) и Люцифераза фьюжн репортер27и сортировать флуоресценции клеток репортер активации клеток, сортируя (FACS) до приживления. Проверка линий для микоплазмы каждые 6 месяцев.
      1. Культура H2030 человеческих раковых клеток линии, рекомендованный изготовителем, с помощью Розуэлл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) с 10% плода Bovine сыворотки (ФБС), пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.
      2. Культура 368T1 мышиных клеточной линии (производный от красG12D; p53- / - мыши) с использованием средних Дульбекко изменение орла (DMEM) с 10% FBS, пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.
      3. Культура PC9 человеческих раковых клеток линии с помощью RPMI с 10% FBS, пенициллин стрептомицином и амфотерицином B.

2. блеомицин лечение

  1. Планирует вливать intratracheally мышей с блеомицин 14 дней до приживления опухолевых клеток.
  2. Оттепель блеомицин фондовой на льду 2 h до инъекции.
  3. После размораживания, разбавить блеомицин к желаемой рабочей концентрации (0.02 мкл U/50 или 0,005 мкл U/50) и держать его на льду.
    Примечание: Концентрация блеомицин зависит от штамма мыши используется для экспериментов (Таблица 1). Титрование блеомицин мышей должны выполняться определить оптимальную дозу.
  4. Подготовить анестезии путем разбавления кетамина и ксилазина до конечной концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, с помощью иглы 1 мл шприц и 27 G, анестезировать каждой мыши, внедряя решения внутрибрюшинно кетамин/ксилазина на 100/10 мг/кг соответственно.
  5. Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  6. 1 место мыши одновременно на платформе интубации, повесив его передних зубов с его обратно на платформу.
  7. Осветить верхней части груди с помощью волоконно оптический осветитель, чтобы помочь с визуализацией трахеи. Откройте рот мыши и вытащить язык аккуратно пинцетом стерильную плоский.
  8. Используйте внутривенного катетера без иглы, чтобы избежать блокирования дыхание. Положение катетера через белый свет излучаемый открытия трахеи.
  9. Вставьте катетер в трахею, до тех пор, пока в верхней части катетер достигает передних зубов. Подтверждение правильного размещения катетера в трахею, визуализировать белый свет сияет путем открытия катетер в рот.
  10. С помощью пипетки, обойтись 50 мкл блеомицин или транспортного средства (PBS) непосредственно в катетер, чтобы обеспечить, что весь объем вдыхается. Выполните этот шаг в стерильных условиях.
  11. Если правильно вставляется катетер, мышь немедленно вдыхать содержимое катетера. Подождите несколько секунд, до тех пор, пока весь объем перемещается вниз катетер. Затем удалите катетер из трахеи и распоряжаться в раствор 10% отбеливателя.
    Примечание: Среднее время на мыши шагов 2.7-2.11-около 5 мин.
  12. Если мышь не является вдыхание жидкость, тщательно контролировать дыхание и отрегулировать положение катетера. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите катетер и позволить мыши возобновить дыхание обычно перед повторно вводить катетер.
  13. Место вводят мыши на IACUC утверждения грелку на их обратно на плоской поверхности для восстановления. Вся процедура займет 10 мин на мышь. Не вернуть животное, которое претерпел инъекций в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел.
  14. Место «Опасных химических веществ в использование» карты на клетке за 24 ч.

3. Мониторинг мышей после интубации

  1. Контролировать мышей для дыхательной сразу же после интубации и затем каждые 15 мин, до тех пор, пока мышей, Звонок от анестезии. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  2. Придать кетопрофена (5 мг/кг), внутрибрюшинно, чтобы облегчить боль.
  3. Изучите интубации пост 24 h мышей и 3 раза в неделю для каких-либо признаков заболеваемости.
  4. Записывайте дату процедуры идентификации животных, типа процедуры, тип анестезии и послеоперационного мониторинга наблюдений с раз.
  5. Контролировать мышей для потери веса, респираторный дистресс, поведенческие аномалии и оценка состояния тела < 2 (сегментации позвоночник очевидным/спинной костей таза ощутима) два раза в неделю после введения блеомицин.
  6. Усыпить мышей респираторного дистресса или мышей, которые испытали потерю 15% массы тела CO2 или кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.

4. приживления линий клеток аденокарциномы легкого.

Примечание: Выполнение приживления клеток через 14 дней после инъекции Блеомицин (шаг 2.1).

  1. Позволяют клеткам расти в 75 см2 фляги спокойно за 3 дня до дня инъекции с соответствующими средствами массовой информации как указано в шаге 1.3.
    Примечание: Они должны быть 80% притока в день инъекции (который соответствует 2-3 x 10-6 в каждом колбу в зависимости от линии клетки).
  2. Вымойте клетки, растущих на 75 см2 флакон с 5 мл PBS при комнатной температуре.
  3. Аспирационная PBS и добавить 1,5 мл трипсина в клетки и инкубации клеток при 37 ° C, пока клетки (обычно 2-5 мин).
    Примечание: Мы рекомендуем проверять каждые 2 мин, для клеток отряд из пластика, простой визуализации нижней части колбы или под микроскопом света. Не превышать 5 минут инкубации с трипсином.
  4. Нейтрализовать трипсина, добавив 4 мл средства массовой информации, содержащие 10% FBS (же СМИ как шаг 4.1). Собирать клетки в 15 мл трубку и центрифуги на 200 g x 3 мин при комнатной температуре.
  5. Аспирационная СМИ и Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл PBS для мытья клетки. Центрифуга клетки на 200 g x 3 мин при комнатной температуре в Пелле клетки. Повторите это 1 раз.
  6. Аспирационная PBS и Ресуспензируйте гранулы в 1,5 мл PBS на колбу.
  7. Смешайте 50 мкл клеток смеси с 50 мкл Трипановый синий и подсчитать количество ячеек с использованием клеток счетчик/Горяева палата28.
  8. Готовят суспензию клеток путем разбавления клетки в PBS придать 1 х 105 клеток (или другой указанной суммы) в 50 мкл на мышь. Держите клетки на льду до инъекции.
    Примечание: Подготовьте по крайней мере в два раза больше клеток для инъекций избежать исчерпания суспензию клеток.
  9. Подготовить анестезии путем разбавления кетамина и ксилазина до конечной концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно, с помощью иглы 1 мл шприц и 27 G, анестезировать каждой мыши, внедряя решения внутрибрюшинно кетамин/ксилазина на 100/10 мг/кг соответственно.
  10. Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  11. 1 место мыши одновременно на платформе интубации, повесив его передних зубов с его обратно на платформу.
  12. Осветить верхней части груди с помощью волоконно оптический осветитель, чтобы помочь с визуализацией трахеи.
  13. Ресуспензируйте клетки, аккуратно с помощью пипетки Р200 чтобы убедиться, что они не образуют сгустки. Откройте рот мыши и вытащить язык аккуратно пинцетом стерильную плоский.
  14. Применение внутривенного катетера с иглой удалены, чтобы избежать блокирования дыхание. Положение катетера через белый свет излучаемый открытия трахеи.
  15. Вставьте катетер в трахею, до тех пор, пока в верхней части катетер достигает передних зубов. Подтверждение правильного размещения катетера в трахею, визуализировать белый свет сияет путем открытия катетер в рот.
  16. С помощью пипетки, обойтись 50 мкл клеток прямо в катетер, чтобы обеспечить, что весь объем вдыхается. Выполните этот шаг в стерильных условиях.
    Примечание: Если правильно вставляется катетер, мышь будет немедленно вдыхать содержимое катетера.
  17. Подождите несколько секунд, до тех пор, пока весь объем перемещается вниз катетер и затем удалить катетер из трахеи и распоряжаться в раствор 10% отбеливателя.
  18. Если мышь не является вдыхание жидкость, тщательно контролировать дыхание и отрегулировать положение катетера. Если мышь перестает дышать, немедленно удалите катетер и позволить мыши возобновить дыхание обычно перед повторно вводить катетер.
    Примечание: Среднее время на мыши шагов 4.11-4.18-около 5 мин.
  19. Место вводят мыши на IACUC утверждения грелку на их обратно на плоской поверхности для восстановления.
    Примечание: Вся процедура займет 10 мин на мышь. Не вернуть животное, которое претерпел инъекций в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел.
  20. Бритье всей реберной области обоих вентрально и дорзально B6129SF1/J и другие штаммы мыши с темными волосами с помощью электробритвы до изображений.
  21. 2-3 мин после инъекции клеток, придать 100 мкл люциферин ретро орбитально (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Альтернативные глаз используется для инъекций каждого изображения сеанса.
  22. После по крайней мере 2 минуты до 5 мышей в формирователь изображений животных биолюминесценции в спинной recumbency позиции и приобрести вентральной изображение с помощью настройки свечения29.
  23. В панели управления настройки разрешение и чувствительность для измерения люминесценции линии заданной ячейки. Для большинства приложений, начните с 3 мин (или «Auto» если насыщения), биннинг = средний (4), F/Stop = 1, поле зрения = D, тема высота = 1.50.
    Примечание: Если инъекции является успешной, люминесценция сигнала в области верхней части грудной клетки в легких одного или обоих легких.
  24. Флип мышей на грудной recumbency позиции и приобрести спинной картина как указано выше.
    Примечание: Если инъекции клеток не выполняется должным образом, клетки могут кластера на входе трахеи или в шее.
  25. Придать кетопрофена 5 мг/кг внутрибрюшинно для облегчения боли.
  26. Переместить мышь обратно к их клетке и поместите карточку «BSL-2 агент в использование» на клетке.
  27. Контролировать мышей для дыхательной сразу после интубации и затем каждые 15 мин, до тех пор, пока мышей, Звонок от анестезии. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  28. Изучите интубации пост 24 h мышей и три раза в неделю для каких-либо признаков заболеваемости.
  29. Сохранить запись в журнале о дате процедуры, идентификация животных, тип процедуры, тип анестезии и послеоперационного мониторинга наблюдения и раз.
  30. Контролировать мышей для потери веса, респираторный дистресс, поведенческие аномалии и оценка состояния тела < 2 (сегментации позвоночник очевидным/спинной костей таза ощутима) два раза в неделю после прививки блеомицин.
    Примечание: Мышей с опухоли легких могут проявлять раздражение дыхательных путей, потеря веса, кахексия или смерти.
  31. Усыпить мышей респираторного дистресса или мышей, которые испытали потерю 15% массы тела CO2 или кетамина/Ксилазина следуют шейки матки дислокации, если сбор тканей. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.

5. мониторинг роста опухоли по биолюминесценции изображений

  1. Повторите изображений мышей на 3 день после приживления и неделю после.
  2. Анестезировать мышей путем инъекций кетамин/Ксилазина (как описано в шагах 2.4-2.5) или ингаляционные изофлюрановая (2%). Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку ног для подтверждения надлежащего анестезии. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Бритье всей реберной области обоих вентрально и дорзально B6129SF1/J и другие штаммы мыши с темными волосами с помощью электробритвы до изображений.
  4. После того как мыши под наркозом, придать 100 мкл люциферин ретро орбитально (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Подождите 2 мин заместитель глаз используется для инъекций каждый изображений сессии.
  5. Мышей в томограф и приобрести дорсальной и вентральной изображения, как описано в шагах 4.22-4.24.
  6. Место мыши обратно в клетку после съемки, на их обратно на плоской поверхности для восстановления.
    Примечание: Вся процедура займет 5 минут в группе 5 мышей. Не оставляйте мышей без присмотра, пока они достаточно сознание для поддержания грудной recumbency.
  7. Анализ изображений с помощью программного обеспечения для анализа тепловизор/биолюминесценции.
    1. Выберите соответствующие изображения и загружать их в программное обеспечение для анализа биолюминесценции в качестве группы.
    2. Нажмите кнопку инструмент ROI | площади для добавления площади региона интерес (ROI). Место ROI над верхней части груди, охватывающих весь легких изображения. Повторите это для каждого изображения мыши.
    3. Щелкните правой кнопкой мыши и выберите Копировать все ROI функцию, чтобы применить ко всем изображениям в группе же ROI и расположите их в верхней части грудной клетки мышей, брюшной и спинной просмотров.
    4. В верхнем левом углу окна изображения выберите функцию фотонов . Щелкните функцию панели управления мерой измерить ROI. Скопируйте и вставьте программного обеспечения выбора для анализа данных дальнейшего вывода таблицы, содержащей общего потока (фотоны/s).
    5. Нормализации повседневной значение ROI каждой мыши, чтобы его значение ROI, измеренная на день 0.

6. ткани изоляции и обработки.

  1. Анестезировать мышей путем инъекций кетамин/Ксилазина (как описано в шагах 2,4-2,5 или вдыхании изофлюрановая (2%). Контролировать дыхание мышей и использовать щепотку мыс. Подтвердите надлежащее анестезии, когда мышь не реагирует на носок пинча. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  2. Ретро орбитально придать 100 мкл Люциферин (15 мг/мл) с использованием инсулина игл. Подождите 2 мин.
  3. Изображение мыши следующие шаги 4.22-4.24 из настоящего Протокола.
  4. Внедрить в другой глаз от шага 6.2 еще 100 мкл люциферин ретро орбитально с использованием инсулина игл до эвтаназии.
  5. Усыпить мышей внутрибрюшинной инъекцией кетамина/Ксилазина (см. шаг 2.4 для подробной информации) следуют шейки матки дислокации, если мышь под глубокой анестезии в соответствии с указаниями IACUC. Подтвердите эвтаназии, проводя пальпация для дыхательную активность.
  6. Используя стерильные хирургические ножницы сделать разрез кожи ниже грудины. Откройте слой мышц вдоль диафрагмы с помощью щипцов и Ножницы хирургические и разоблачить грудной полости, проходящем через грудную клетку на одной из боковых сторон, избегая внутренние грудные артерии.
  7. Perfuse мышь, делая небольшой надрез в правое предсердие сердца и залить 5 мл PBS через левого желудочка. Цвет ткани легких будет идти от красного до бледно розовый белый если перфузии крови делается правильно.
  8. Акцизный легких из грудной полости тщательно, захватывая пищевода или сердце с щипцами. Осторожно потяните ткань и использовать Ножницы хирургические тщательно вырезать соединительные ткани, избегая прокол легочной ткани. Сохраните как можно больше для инфляции легких дыхательных путей на более позднем этапе трахеи.
  9. Вымойте легких, погрузив и закрученной ткани 3 раза в 6 пластины хорошо заполнены с 3 мл PBS удалить избыток крови.
  10. Место легких на крышке 6 хорошо плиты и место крышку содержащих ткани в биолюминесцентных томографа и приобрести светящиеся изображения30.
    Примечание: Мы рекомендуем, выбрав следующие параметры панели «приобретение управления» «поле зрения = A» и «предмет высота = 0,75 см» и затем «Auto экспозиции» чтобы избежать насыщенных образов.
  11. Акцизный и изображения других органов, как это сделано в шаге 6,9-6.10, где метастазы были определены люминесценции, таких как мозг, печень, надпочечников, кости, лимфатические узлы, почек и селезенки31.
  12. Perfuse легких с 1 мл 4% параформальдегида, вставляя иглу в трахею мыши. Легкие будут раздувать если хорошо перфузии.
    Предупреждение: параформальдегида 4% это токсичные, здоровье опасности GHS07 и GHS08.
  13. Передача легких в 15 мл конические с 5 мл 4% параформальдегида.
  14. Исправить легких или других тканей, инкубации ткани с параформальдегида 4% на ночь при 4 ° C в встряхивания устройства на 30-50 об/мин.
  15. Внедрить в парафин или оптимального резки температуры смеси в зависимости от приложения32легких (или других тканей).
    Примечание: Парафин является предпочтительным методом для сохранения структуры легких и Masson Trichrome и гематоксилином-эозином.

Результаты

Для повышения эффективности LUAD раковых клеток приживления в легкие мышей, мы разработали протокол, который сначала предварительные условия авиалинии, блеомицин, следуют ортотопическая опухолевых клеток впрыска (рис. 1). Мы подтвердили, что даже при при...

Обсуждение

Поразительные параллели клинических документально между раком легких и других хронических заболеваний легких36. В частности увеличение пристрастие для развития рака легких у пациентов с идиопатического легочного фиброза (МГЛ), и эта ассоциация независимо от курения исто?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось за счет субсидий из Национального института рака (R01CA166376 и R01CA191489 для D.X. Nguyen) и Министерство обороны (W81XWH-16-1-0227 для D.X. Nguyen).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNCAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344To anesthetize mice
XylazineButler Schein33198To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powderPerkin Elmer Health Sciences Inc122799For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation standBraintree ScientificRIS-100Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MTo illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serratRobozRS-5111For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable ShaverConair-To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut bladesRobozRS-5840SC
15 mL conical tubeBD / Fisher352097
1.5 mL centrifuge tubesUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPIFisher701350
Filter pipette tips (200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM high glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Fetal bovine serum USDALife Technologies10437-028
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue capFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262For in vivo bioluminescence imaging
Living image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia SystemPerkin Elmer Health Sciences Inc118918For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1mlBD / Fisher14-823-434For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needleBD / Fisher305111For intraperitoneal injections
4% ParaformaldehydeVWR43368-9MCAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer's HematoxylinELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slidesFisher1255015
6 well plateCorningC3516
Universal Mycoplasma Detection KitATCC30-1012K
OCT Embedding compoundELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 STo section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) miceCharles RiverNIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) miceJackson Laboratories5557
B6129SF1/J miceJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellsATCCCRL-5914
368T1generously provided by Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-

Ссылки

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены