Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

Abstract

סרטן הריאות הוא מחלה עקשן טיפול קטלני זה הטרוגנית מבחינה ביולוגית. כדי להבין ולטפל ביעילות את הספקטרום קליניים מלאים של ממאירות בית החזה, בדגמי בעלי חיים נוספים ניתן לסכם סוגי סרטן מגוונות אמבריולוגיה ו בשלבים הדרושים. מודלים להשתלת או xenograft הם מגוונים ולאפשר כימות של קיבולת tumorigenic ויוו, באמצעות תאים ממאירים ממקור אנושי או מאתר. עם זאת, שיטות שתואר לעיל engraftment התא סרטן ריאות שנעשו באתרים שאינם-פיזיולוגיים, כגון האגף של עכברים, עקב חוסר היעילות של השתלת orthotopic של התאים אל הריאות. במחקר זה, אנו מתארים שיטה כדי לשפר orthotopic ריאות סרטן תא engraftment על-ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם bleomycin הסוכן inducing פיברוזיס. בתור ניסוי הוכחה הרעיון, אנחנו מוחלים בגישה זו כדי engraft בתאי הגידול של המשנה ריאות אדנוקרצינומה, המתקבל העכבר או מקורות אנושיים, לתוך זנים שונים של עכברים. נדגים כי ופצעו את דרכי הנשימה עם bleomycin לפני הזרקת תאי הגידול מגביר את engraftment של תאים סרטניים מ 0-17% ל- 71-100%. באופן משמעותי, שיטה זו משופרת שכיחות סרטן ריאות, תוצר עוקבות באמצעות מודלים שונים וללחצים העכבר. בנוסף, תאי סרטן ריאות engrafted להפיץ מהריאות אל איברים רחוקים הרלוונטיים. לכן, אנו מספקים פרוטוקול יכול לשמש להקים ולתחזק דגמים חדשים orthotopic של סרטן ריאות עם הגבלת כמויות של תאים או biospecimen, להעריך באופן כמותי את יכולת tumorigenic של סרטן ריאות תאים בהגדרות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית .

Introduction

סרטן הריאות הוא המוביל סיבת סרטן הקשורים מקרי מוות ברחבי העולם1. חולים עם סרטן ריאות נכנעים בסופו של דבר מן גרורות לאיברים מרוחקים, ובמיוחד אל מערכת העצבים המרכזית, כבד, בלוטות יותרת הכליה, עצמות-2,-3,-4. ממאירות בית החזה מסווגים באופן מסורתי כמו תאים קטנים סרטן הריאות (SCLC) או תאים לא קטנים הריאה סרטן (NSCLC)5. NSCLC הוא הכי קרובות אובחן גידול ממאיר, נחלקים תת היסטולוגית שונים, כולל ריאות אדנוקרצינומה (LUAD) וריאות קרצינומה של תאים קשקשיים (LUSC)6. אנליזה גנומית של סרטן הריאות העיקרית האנושי resected גילה כי גידולים בתוך histotype נתון יכול גם להביע מגוונות לפליטת מולקולרית, עוד יותר לתרום שלהם התקדמות קליניים מתבדרת, בלבול פרוגנוזה החולה. הטרוגניות יוצא דופן של סרטן הריאות מייצג אתגר משמעותי תכנון רציונלי, בדיקות קדם-קליניות, ויישום אסטרטגיות טיפוליות אפקטיביות. כתוצאה מכך, יש צורך להרחיב את הרפרטואר של מודלים סרטן ריאות ניסיוני צייתן ללמוד את מגוון מקורות הסלולר יחוברו מולקולרית, בשלבים של מחלה זו.

גישות שונות באמצעות מודלים בעלי חיים יש כבר מועסקים לימודים ריאות סרטן ויוו, כל אחת עם יתרונות וחסרונות משלהם בהתאם ות הביולוגי של עניין. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMMs) ניתן לייעד שינויים גנטיים מסוימים בסוג התא קדמון נתון, וכתוצאה מכך גידולים לזה ההתקדמות בתוך המחשב המארח immunocompetent7. בעוד רבת עוצמה, הרלוונטית קלינית, השהיה, השתנות, ו/או ריאות הגידול התחלואה המשויך GEMMs יכול להיות אוסרני מדידות כמותיים מסוימים, זיהוי מאוחר הבמה גרורות לאיברים מרוחקים8. בגישה המשלימה הוא השימוש של מודלים להשתלת, לפיה תאים סרטן הריאה, השיג גם ישירות מגידול העכבר או נגזר קודם כקווים תא הוקמה בתרבות, הן יוצג מחדש לתוך המארחים syngeneic. באנלוגיה, xenografts סרטן ריאות נוצרים שורות תאים אנושיים או דגימות הגידול נגזר החולה. Xenografts שורת תאים אנושיים או החולה נגזר xenografts (PDXs) נשמרים בדרך כלל בעכברים immunocompromised, לכן למנוע החיסון-מעקב מלאה9. למרות חיסרון זה, הם מספקים שדרה להפיץ הגבלת סכומי אנושי biospecimens והלימוד היסוד ויוו מאפיינים של תאים סרטניים אנושיים, אשר קידוד עבור סטיות גנומית מורכבים יותר מאשר גידולים GEMM.

מאפיין שימושי אחד של allografts, xenografts היא שהם נוטה מסורתי מבחני דילול תא המגביל, המועסקים לכמת את התדירות של הגידול ייזום תאים (טיקים) בתוך אוכלוסיית תאים ממאירים10. בניסויים אלה, מספר מוגדר של תאים מוזרקים subcutaneously לתוך האגף של בעלי חיים, התדירות של טיקים יכול להיות מוערך בהתבסס על הגידול לקחת שיעור. גידולים תת עורית לעומת זאת יכול להיות יותר חמצן11 , אולי לא המודל המפתח פיזיולוגי האילוצים של microenvironment הגידול הריאה. Intratracheal מסירה של גזע אפיתל או ובתאים לריאות של עכברים הוא שיטה ללמוד התחדשות ריאתי ו דרכי הנשימה תאי גזע בביולוגיה12. עם זאת, שער engraftment בין טכניקה זו יכול להיות נמוך יחסית, אלא אם כן הריאות לראשונה נחשפים לצורות פיזיולוגיים של פציעה, כמו זיהום נגיפי13,14. תמיכה של סטרומה תאים דלקתיים ו/או שיבוש קרום המרתף ריאות עשוי לשפר את השמירה של התאים המושתלים גומחות הרלוונטיים תאי איירווייז דיסטלי15. פיברוזיס גרימת סוכנים יכול להתנות גם מראש את הריאות כדי לשפר את engraftment של תאים pluripotent המושרה16 וגזע mesenchymal17. אם צורות דומות של דרכי הנשימה פציעה יכולה להשפיע על קצב engraftment, קיבולת ייזום הגידול, תוצר של סרטן ריאות תאים טרם להידרש באופן שיטתי.

במחקר זה, אנו מתארים שיטה כדי להגביר את היעילות של orthotopic ריאות סרטן תא engraftment, על-ידי מיזוג מראש הריאות של עכברים עם פציעה. LUAD מתעוררת את דרכי הנשימה דיסטלי עם קבוצת משנה משמעותית של סוגי סרטן אלה בפיתוח של משתית שהותירה18 זה לא מופיע לעיתים קרובות עם פרוגנוזה גרועה19. Bleomycin, פפטיד היברידית nonribosomal הטבעי-polyketide, יש כבר מנוצל בהרחבה לזירוז פיברוזיס ריאתי עכברים20. דרכי הנשימה החדרה של bleomycin מקדם קודם אפיתל התשה alveoli, גיוס של תאים דלקתיים, כולל מקרופאגים, נויטרופילים ומונוציטים21. זה ואחריו רקמות איירווייז הדיסטלי, קרום המרתף רה-ארגון22,23 , התצהיר מטריצה חוץ-תאית (ECM)24. ההשפעות של זריקה בודדת bleomycin. הם חולפים, עם פיברוזיס לפתרון לאחר 30 יום הלימודים ברוב25 באמצעות מודלים להשתלת והן xenograft, בדקנו אם מראש מיזוג את דרכי הנשימה של עכברים עם bleomycin יכולה להגדיל באופן משמעותי לקחת שיעור לתאים LUAD.

Protocol

כל הניסויים בוצעו על פי פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת ייל.

1. קבע / הכנת נוגדנים.

  1. Bleomycin
    התראה: מבוסס על כללי ההרמונית מערכת (GHS) של סיווג, תוויות של כימיקלים, bleomycin מסווג כ סיכון בריאותי GHS08.
    1. להכין bleomycin בשכונה כימי. Resuspend 15 U לתוך מ ל תמיסת סטרילית פוספט buffered (PBS).
    2. Aliquot µL 100-200 של הפתרון לזכוכית שבקבוקי ומקפיאים ב-20 ° C לשימוש עתידי. תווית כראוי את הצינורות עם התאריך של resuspension. השתמש בתוך 6 חודשים מתאריך זה.
      הערה: כל המתח העכבר יש רגישות שונה bleomycin26. בדיקת מינונים שונים של bleomycin לזן כל עכבר מומלץ. זנים העכבר, במינונים המתאימים של bleomycin שימוש בניסויים נציג מפורטים בטבלה 1.
  2. עכברים
    1. לרכוש עכברים לצורך הניסוי ולאפשר עכברים 7 ימים להסתגלות לפני ההזרקה. ביצוע חליטות ברדס אבטחה. העברת בעלי חיים שוכנו בחדר BSL2 שאינו תואם לחדר BSL2 באמצעות הליכים סטנדרטיים מוסדיים לפני bleomycin אינפוזיה. להזריק עכברים רוב בגיל 6-8 שבועות.
      התראה: להזריק עכברים בעקבות המוסדיים הנחיות לסוכני מסוכנים, אבטחה ברמה 2 (BSL2) ואישור IACUC.
      הערה: עכברים רכשה את הניסויים נציג מפורטים בטבלה של חומרים. היו בשימוש רק זכר עכברים.
  3. שורות תאים של סרטן ריאות
    1. תרבות הרצוי שורות תאים בתקשורת שלהם בהתאמה. לפני זריקות, לבצע קצרה חוזרים tandem בניית פרופילים גנטיים או בדיקה גנטית כדי להבטיח זיהוי קו התא הנכון. כדי להקל על ויוו ו- ex-vivo הדמיה, להדביק שורות תאים עם lentivirus המבטאת את תימידין קינאז, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ואת לוציפראז פיוז'ן כתב27ומיין תאים חיוביים כתב על-ידי קרינה פלואורסצנטית הפעלת התא מיון (FACS) לפני engraftment. בדוק קוי mycoplasma כל 6 חודשים.
      1. תרבות H2030 שורה של תאים סרטניים אנושיים המומלצים ע י היצרן באמצעות מכון ממוריאל פארק רוזוול בינוני (RPMI) עם 10% סרום שור עוברית (FBS), פניצילין-סטרפטומיצין, ו- b שהוא גוסס
      2. תרבות שורת התאים מאתר 368T1 (נגזר עכבר קראסG12D; p53- / - ) באמצעות בינוני ששינה הנשר של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, ו- b שהוא גוסס
      3. תרבות PC9 סרטן האדם תא קו באמצעות RPMI עם 10% FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, ו- b שהוא גוסס

2. bleomycin טיפול

  1. תוכנית להחדיר intratracheally עכברים bleomycin 14 יום לפני הגידול תא engraftment.
  2. הפשרת bleomycin מניות על הקרח 2 h לפני ההזרקה.
  3. ברגע הקרת, לדלל bleomycin לריכוז העבודה הרצויה (0.02 נקודות U/50 µL או 0.005 U/50 µL), ולשמור אותו בקרח.
    הערה: ריכוז bleomycin תלוי המתח העכבר משמש את הניסויים (טבלה 1). טיטור של bleomycin בעכברים צריכה להתבצע כדי לקבוע את המינון האופטימלי.
  4. הכנת הרדמה על ידי דילול קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים על ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה, באמצעות מחט מזרק ו- 27 G 1 מ"ל, עזים ומתנגד לכל העכבר באמצעות הזרקת intraperitoneally קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון 100/10 מ"ג/ק"ג בהתאמה.
  5. לנטר את הנשימות של עכברים ולהעסיק קמצוץ הבוהן. לאשר ההרדמה המתאים כאשר העכבר מגיב שאורך צביטה. הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
  6. הנח את העכבר 1 בכל פעם על פלטפורמת צנרור בתלייה את השיניים הקדמיות שלה עם הגב נגד הפלטפורמה.
  7. יאיר העליון של החזה משתמש של המאייר סיבים אופטיים כדי לעזור עם ויזואליזציה של קנה הנשימה. פתח את הפה של העכבר, להוציא את הלשון בעדינות עם מלקחיים שטוח סטרילי.
  8. השימוש של קטטר תוך ורידי ללא המחט כדי למנוע חסימת נשימה. מיקום הצנתר על האור הלבן הנפלטים הפתיחה של קנה הנשימה.
  9. הכנס את הצנתר לתוך קנה הנשימה עד העליון של הקטטר מגיע את השיניים הקדמיות. לאשר השמה נכונה של הקטטר לקנה דמיין אור לבן זורח דרך הפתח של הקטטר בפה.
  10. באמצעות פיפטה של, לוותר על µL 50 bleomycin או רכב (PBS) ישירות לתוך הצנתר כדי להבטיח כי בכל אמצעי האחסון הוא בשאיפה. לבצע שלב זה בתנאים סטריליים.
  11. אם הצנתר הוכנס כהלכה, העכבר תיקח לריאות באופן מיידי את התוכן של הקטטר. המתן מספר שניות עד האחסון כולו נע למטה הקטטר. לאחר מכן להסיר את הצנתר קנה הנשימה, להיפטר בפתרון 10% מלבין.
    הערה: הזמן הממוצע לכל העכבר של צעדים 2.7-2.11 היא בסביבות 5 דקות.
  12. אם העכבר הוא לא שואף את הנוזל, בזהירות לפקח על הנשימה, להתאים את מיקום הצנתר. אם העכבר מפסיק לנשום, להסיר את הצנתר באופן מיידי ולאפשר את העכבר לחדש את הנשימה בדרך כלל לפני מחדש החדרת הקטטר.
  13. במקום מוזרק העכבר על רכיב pad חימום שאושרו IACUC על גבם על משטח שטוח להתאוששות. כל התהליך יקח 10 דקות לכל העכבר. אל תשיבו חיה עבר הזרקה אל החברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין.
  14. במקום כרטיס "מסוכנים כימי תוך שימוש" על הכלוב במשך 24 שעות ביממה.

3. פיקוח על עכברים שהיא מגיעה

  1. לפקח על העכברים עבור מצוקה נשימתית מיד לאחר צנרור ולאחר מכן כל 15 דקות עד עכברים להתעורר מן ההרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם יש חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  2. מזריקים ketoprofen (5 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally כדי להקל על הכאב.
  3. בחן את צנרור פוסט של עכברים 24 שעות במשך 3 פעמים בשבוע עבור סימני תחלואה.
  4. שמור תיעוד של התאריך של הליך זיהוי בעלי חיים, סוג של שגרה, סוג של תצפיות ניטור הרדמה, ואחרי הניתוח עם פעמים.
  5. לפקח על העכברים עבור אובדן משקל, מצוקה נשימתית, הפרעות התנהגותיות ציון מצב הגוף < 2 (פילוח של עמוד השדרה הגבי/ניכר ועצמות הם מוחשי) דו-שבועי בעקבות הזרקת bleomycin.
  6. המתת חסד עכברים תחת מצוקה נשימתית או עכברים חוו 15% אובדן מסת הגוף על ידי CO2 או קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים ואחריו נקע בצוואר הרחם. לאשר המתת חסד על-ידי עריכת מישוש לפעילות הנשימה.

4. engraftment של שורות תאים אדנוקרצינומה של הריאה.

הערה: לבצע engraftment של תאים 14 ימים לאחר ההזרקה של bleomycin (שלב 2.1).

  1. מאפשרים לתאים לגדול ב- 75 ס מ2 מבחנות ללא הפרעה במשך 3 ימים שלפני יום זריקה עם המדיה המתאימים כאמור בשלב 1.3.
    הערה: הם צריכים להיות 80% confluent-היום של הזרקה (אשר תואמת 2-3 x 106 כל הבקבוק בהתאם לקו סלולרי).
  2. לשטוף את התאים גוברת על 75 ס מ2 מבחנות עם 5 מ של PBS בטמפרטורת החדר.
  3. האחות PBS ו להוסיף 1.5 מ של טריפסין בתאי דגירה התאים ב 37 ° C עד התאים ניתוק (בדרך כלל 2-5 דקות).
    הערה: מומלץ לבדוק כל 2 דקות עבור ניתוק התא הפלסטיק על ידי הדמיה פשוטה של החלק תחתון של הבקבוק או תחת מיקרוסקופ אור. לא יעלה על 5 דקות של דגירה עם טריפסין.
  4. לנטרל טריפסין על-ידי הוספת 4 מ של המדיה המכילה 10% FBS (באותה מדיה כשלב 4.1). לאסוף את התאים לתוך צינור 15 מ"ל, centrifuge זה ב g x 200 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. האחות התקשורת, resuspend בגדר תא ב 5 מ של PBS כדי לשטוף את התאים. Centrifuge התאים ב g x 200 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר כדי הצניפה תאים. חזור על הפעם 1.
  6. האחות של PBS, resuspend בגדר ב mL 1.5 ל- PBS לאדם את הבקבוק.
  7. מערבבים 50 µL של התא תערובת עם 50 µL של trypan blue ולספור את התאים באמצעות הקאמרית של התא מונה/Hemocytometer28.
  8. הכן תא השעיה על ידי דילול תאי PBS להזריק עונה 1 פרק 105 תאים (או סכום אחר המצוין) ב- µL 50 לכל העכבר. שמור את התאים על הקרח לפני ההזרקה.
    הערה: להכין לפחות שתי פעמים יותר תאים להזרקה להימנע ואוזל של התא השעיה.
  9. הכנת הרדמה על ידי דילול קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים על ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה, באמצעות מחט מזרק ו- 27 G 1 מ"ל, עזים ומתנגד לכל העכבר באמצעות הזרקת intraperitoneally קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים פתרון 100/10 מ"ג/ק"ג בהתאמה.
  10. לנטר את הנשימות של עכברים ולהעסיק קמצוץ הבוהן. לאשר ההרדמה המתאים כאשר העכבר מגיב שאורך צביטה. הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
  11. הנח את העכבר 1 בכל פעם על פלטפורמת צנרור בתלייה את השיניים הקדמיות שלה עם הגב נגד הפלטפורמה.
  12. יאיר העליון של החזה משתמש של המאייר סיבים אופטיים כדי לעזור עם ויזואליזציה של קנה הנשימה.
  13. Resuspend התאים בעדינות בעזרת פיפטה p200 כדי לוודא שהם לא עושים בצורת גושים. פתח את הפה של העכבר, להוציא את הלשון בעדינות עם מלקחיים שטוח סטרילי.
  14. שימוש קטטר תוך ורידי עם המחט הסיר כדי למנוע חסימת נשימה. מיקום הצנתר על האור הלבן הנפלטים הפתיחה של קנה הנשימה.
  15. הכנס את הצנתר לתוך קנה הנשימה עד העליון של הקטטר מגיע את השיניים הקדמיות. לאשר השמה נכונה של הקטטר לקנה דמיין אור לבן זורח דרך הפתח של הקטטר בפה.
  16. באמצעות פיפטה של, לוותר על 50 µL של תאים ישירות לתוך הצנתר כדי להבטיח כי בכל אמצעי האחסון הוא בשאיפה. לבצע שלב זה בתנאים סטריליים.
    הערה: אם הצנתר הוכנס כהלכה, העכבר מיד לשאוף את התוכן של הקטטר.
  17. המתן מספר שניות עד האחסון כולו נע למטה הקטטר, להסיר את הצנתר קנה הנשימה ואת להיפטר בפתרון 10% מלבין.
  18. אם העכבר הוא לא שואף את הנוזל, בזהירות לפקח על הנשימה, להתאים את מיקום הצנתר. אם העכבר מפסיק לנשום, להסיר את הצנתר באופן מיידי ולאפשר את העכבר לחדש את הנשימה בדרך כלל לפני מחדש החדרת הקטטר.
    הערה: הזמן הממוצע לכל העכבר של צעדים 4.11-4.18 היא בסביבות 5 דקות.
  19. במקום מוזרק העכבר על רכיב pad חימום שאושרו IACUC על גבם על משטח שטוח להתאוששות.
    הערה: כל התהליך יקח 10 דקות לכל העכבר. אל תשיבו חיה עבר הזרקה אל החברה של בעלי חיים אחרים עד החלים לחלוטין.
  20. לגלח את האזור כולו הצלעות בשני ventrally, dorsally של B6129SF1/J וזנים אחרים בעכבר עם שיער כהה באמצעות מכונת גילוח חשמלית לפני הדמיה.
  21. 2-3 דקות לאחר ההזרקה תא, להזריק 100 µL של luciferin רטרו-orbitally (15 מ"ג/מ"ל) באמצעות מחט של אינסולין. לסירוגין את העין משמש הזרקה בכל הפעלת הדמיה.
  22. אחרי לפחות 2 דקות, מקום עכברים עד 5 imager ביולומינסנציה בעלי חיים במצב recumbency הגבי של רוכשים תמונה הגחון באמצעות הפריה חוץ גופית הגדרות29.
  23. תחת לוח הבקרה להתאים את הגדרות הרזולוציה ורגישות למדוד הפריה חוץ גופית של קו תא נתון. עבור מרבית היישומים, להתחיל עם 3 דקות (או "אוטומטי" אם רווי), binning = בינוני (4), F/להפסיק = 1, שדה ראייה = D, נושא גובה = 1.50.
    הערה: אם הזריקה הוא מוצלח, הפריה חוץ גופית אות מזוהה באזור החזה העליון, ריאה אחת או שתי הריאות.
  24. להפוך עכברים על העמדה recumbency בחזה ובצלעות ולרכוש תמונה הגבי כמפורט לעיל.
    הערה: אם הזרקת תאים לא מתבצע כהלכה, תאים עשויים אשכול בכניסה של קנה הנשימה או בצוואר.
  25. מזריקים ketoprofen 5 מ"ג/ק"ג intraperitoneally כדי להקל על הכאב.
  26. לחזור עכברים הכלוב שלהם, להציב קלף "הסוכן BSL-2 תוך שימוש" הכלוב.
  27. לפקח על עכברים עבור מצוקה נשימתית מיד לאחר צנרור ולאחר מכן כל 15 דקות עד עכברים להתעורר מן ההרדמה. אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם יש חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  28. בחן את צנרור פוסט של עכברים 24 שעות שלוש פעמים בשבוע עבור סימני תחלואה.
  29. שמור רשומה ביומן תאריך של הליך, זיהוי בעלי חיים, סוג של הליך, סוג של תצפיות ניטור הרדמה ואחרי הניתוח פעמים.
  30. לפקח על עכברים עבור אובדן משקל, מצוקה נשימתית, הפרעות התנהגותיות ציון מצב הגוף < 2 (פילוח של עמוד השדרה הגבי/ניכר ועצמות הם מוחשי) דו-שבועי בעקבות חיסון של bleomycin.
    הערה: עכברים עם גידולים ריאות עשוי להפגין גירוי בדרכי הנשימה, ירידה במשקל, cachexia, ו/או מוות.
  31. המתת חסד עכברים תחת מצוקה נשימתית או עכברים חוו 15% אובדן מסת הגוף על ידי CO2 או קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים ואחריו נקע בצוואר הרחם אם אוסף רקמות. לאשר המתת חסד על-ידי עריכת מישוש לפעילות הנשימה.

5. פיקוח על הגידול על ידי הדמיה ביולומינסנציה

  1. חזור על הדמיה של העכברים engraftment שלאחר יום 3, שבועיים לאחר מכן.
  2. עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (כמתואר בצעדים 2.4-2.5) או על-ידי בשאיפה איזופלוריין (2%). לפקח על הנשימה של עכברים ולהעסיק קמצוץ הבוהן כדי לאשר ההרדמה המתאים. הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
  3. לגלח את האזור כולו הצלעות בשני ventrally, dorsally של B6129SF1/J וזנים אחרים בעכבר עם שיער כהה באמצעות מכונת גילוח חשמלית לפני הדמיה.
  4. לאחר העכברים תחת הרדמה, להזריק 100 µL של luciferin רטרו-orbitally (15 מ"ג/מ"ל) באמצעות מחט של אינסולין. המתן 2 דק חלופי העין משמש הזרקה בכל הפעלת הדמיה.
  5. הכנס עכברים םלצה ולרכוש הגבי ותמונות הגחון כמתואר בצעדים 4.22-4.24.
  6. הנח עכברים בחזרה לתוך הכלוב לאחר דימות, על גבם על משטח שטוח להתאוששות.
    הערה: כל התהליך ייקח 5 דקות לכל קבוצה של 5 עכברים. אין להשאיר עכברים ללא השגחה עד שהם יש חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
  7. לנתח את התמונות באמצעות תוכנת ניתוח imager/ביולומינסנציה.
    1. לבחור את התמונות המתאימות ולטעון אותם כקבוצה בתוכנת ניתוח ביולומינסנציה.
    2. לחץ על רועי כלי | כיכר כדי להוסיף אזור כיכר עניין (ROI). מקם את רועי מעל לאזור החזה העליון, המכסים את תמונת הריאה כולה. חזור על הפעולה עבור כל תמונה העכבר.
    3. לחץ לחיצה ימנית ובחר העתק רועי כל פונקציה כדי להחיל את רועי אותו על כל התמונות בקבוצה ומקם אותם בחזה העליון של העכברים, הגחון ותצוגת הגבי.
    4. הפינה השמאלית העליונה של החלון, בחר בפונקציה פוטונים . לחץ על הפונקציה לוח הבקרה למדוד למדוד את ROIs. להעתיק ולהדביק את טבלת הפלט המכיל השטף הכולל (פוטונים/s) לתוך תוכנה של בחירה כדי לנתח את הנתונים בהמשך.
    5. לנרמל את הערך רועי היומי של כל עכבר לערכו ROI נמדד ביום 0.

6. רקמות בידוד ועיבוד.

  1. עזים ומתנגד עכברים באמצעות הזרקת קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (כמתואר בצעדים 2.4-2.5 או על-ידי בשאיפה איזופלוריין (2%). לפקח על הנשימה של עכברים ולהעסיק קמצוץ הבוהן. לאשר ההרדמה המתאים כאשר העכבר מגיב שאורך צביטה. הוטרינר משחה למרוח את העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
  2. מזריקים µL 100 של luciferin רטרו-orbitally (15 מ"ג/מ"ל) באמצעות מחט של אינסולין. לחכות 2 דקות.
  3. עכברים התמונה בעקבות צעדים 4.22-4.24 מתוך פרוטוקול זה.
  4. מזריקים לתוך העין השנייה מ שלב 6.2 עוד 100 µL של luciferin רטרו-orbitally באמצעות מחט של אינסולין לפני המתת חסד.
  5. המתת חסד העכברים בזריקה בקרום הבטן של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים (ראה שלב 2.4 לפרטים) ואחריו נקע בצוואר הרחם אם עכברים נמצאות תחת הרדמה עמוקה על פי ההנחיות שסופקו על-ידי IACUC. לאשר המתת חסד על-ידי עריכת מישוש לפעילות הנשימה.
  6. באמצעות מספריים כירורגיים סטרילי לעשות חתך בעור מתחת לעצם החזה. פתח את שכבת שרירים לאורך לסרעפת באמצעות מלקחיים ומספריים כירורגי, לחשוף את חלל בית החזה על ידי חיתוך בתוך קשת הצלעות על אחת משתי הצדדים לרוחב הימנעות העורקים החזי פנימי.
  7. Perfuse את העכבר על-ידי ביצוע חתך קטן אטריום ימין של הלב, להזריק 5 מ של PBS דרך החדר השמאלי. הצבע של רקמת הריאה יגיע אדום עד ורוד בהיר-לבן אם הדם זלוף נעשית כראוי.
  8. לסלק את הריאות מן בחלל בית-החזה בקפידה על ידי גרירה של הוושט או הלב עם מלקחיים. בעדינות משוך את הרקמה, השימוש מספריים כירורגיים לחתוך בזהירות רקמות חבור הימנעות ניקוב של רקמת הריאה. לשמר את קנה הנשימה ככל האפשר עבור האינפלציה של דרכי הנשימה ריאות בשלב מאוחר יותר.
  9. לשטוף את הריאה על ידי השוקע, מתערבל הרקמה 3 פעמים בצלחת טוב 6 מתמלאת 3 מ"ל של PBS להסיר את עודף דם.
  10. למקם את הריאה על גבי המכסה של צלחת טוב 6, למקם את המכסה המכיל את רקמות םלצה זוהרים, לרכוש תמונות זורח30.
    הערה: מומלץ בחירת ההגדרות הבאות "רכישת בלוח הבקרה" "שדה ראייה = A" ו- "נושא גובה = 0.75 ס מ" ואז "אוטומטי חשיפה" כדי להימנע מהצגת תמונות רוויות.
  11. בלו, תמונה באיברים אחרים, כפי שנעשה צעד 6.9-6.10, איפה גרורות זוהו על ידי הפריה חוץ גופית, המוח, הכבד, יותרת הכליה, העצם, בלוטות הלימפה, בכליות או הטחול31.
  12. Perfuse הריאה עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde על ידי החדרת המחט לתוך קנה הנשימה של העכבר. הריאות לנפח אם perfused היטב.
    התראה: 4% paraformaldehyde הוא רעיל, בריאות הזארד GHS07 ו- GHS08.
  13. להעביר את הריאות 15 מ"ל חרוט עם 5 מ של 4% paraformaldehyde.
  14. לתקן את הריאות או רקמות אחרות על-ידי המקננת הרקמה עם 4% paraformaldehyde בין לילה ב 4 ° C במכשיר חזק ב- 30-50 סל ד.
  15. הטבעת הריאות (או רקמות אחרות) פרפין או טמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב בהתאם יישום32.
    הערה: פרפין היא השיטה המועדפת כדי לשמר את מבנה הריאות ועל מאסון Trichrome מכתים Hematoxylin-אאוזין.

תוצאות

כדי להגביר את היעילות של LUAD סרטן engraftment תא לריאות של עכברים, פיתחנו פרוטוקול קודם תנאים מראש את דרכי הנשימה באמצעות bleomycin ואחריו הזרקת תאי הגידול orthotopic (איור 1). אנחנו אישר כי גם כאשר מנוהל לתוך immunocompromised athymic עכברים, bleomycin המושרה פיברוזיס ארעי ביום 14 כפי שמעי...

Discussion

מקבילות קליניים מרשימים תועדו בין סרטן ריאות ומחלות כרוניות אחרות של הריאה36. בפרט, חולים עם idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) יש לגבי מוגבר לפתח סרטן ריאות, עמותה זו היא עצמאית של עישון היסטוריה37,38. IPF מאופיין על ידי הרס מתקדם ריאות אדריכלות תפקוד לקוי במ...

Disclosures

המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מענקים מן המכון הלאומי לסרטן (R01CA166376 ו- R01CA191489 כדי D.X. נגוין) משרד ההגנה (W81XWH-16-1-0227 כדי D.X. נגוין).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNCAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344To anesthetize mice
XylazineButler Schein33198To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powderPerkin Elmer Health Sciences Inc122799For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation standBraintree ScientificRIS-100Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MTo illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serratRobozRS-5111For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable ShaverConair-To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut bladesRobozRS-5840SC
15 mL conical tubeBD / Fisher352097
1.5 mL centrifuge tubesUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPIFisher701350
Filter pipette tips (200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM high glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Fetal bovine serum USDALife Technologies10437-028
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue capFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262For in vivo bioluminescence imaging
Living image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia SystemPerkin Elmer Health Sciences Inc118918For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1mlBD / Fisher14-823-434For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needleBD / Fisher305111For intraperitoneal injections
4% ParaformaldehydeVWR43368-9MCAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer's HematoxylinELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slidesFisher1255015
6 well plateCorningC3516
Universal Mycoplasma Detection KitATCC30-1012K
OCT Embedding compoundELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 STo section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) miceCharles RiverNIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) miceJackson Laboratories5557
B6129SF1/J miceJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellsATCCCRL-5914
368T1generously provided by Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
  2. Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
  3. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  4. Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
  5. Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
  6. Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
  7. Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
  8. Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
  9. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
  10. Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
  11. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
  12. Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
  13. Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
  14. Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
  15. Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
  16. Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
  17. Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
  18. Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
  19. Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
  20. Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
  21. Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
  22. Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
  23. Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
  24. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
  25. Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
  26. Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
  27. Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
  28. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
  29. Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
  30. Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
  31. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
  32. Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
  33. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
  34. Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
  35. Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
  36. Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
  37. Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
  38. Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
  39. Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
  40. Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
  41. Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
  42. Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
  43. Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
  44. Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
  45. Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
  46. Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
  47. Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136orthotopicintratrachealbleomycinengraftment

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved