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요약

상해 항공을 미리 조절 하 여 murine 폐에 폐 암 세포의 orthotopic engraftment를 크게 향상 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 폐 microenvironment, 전이성 보급, 폐 암 공동 morbidities stromal 상호 작용 연구에 적용 될 수 있습니다 그리고 파생 xenografts 환자를 보다 효율적으로 생성 하.

초록

폐 암은 생물학적으로 이기종은 치명적인 치료 내 화 질병입니다. 이해 하 고 효과적으로 치료 흉부 악성의 전체 임상 스펙트럼, 다양 한 인간의 폐 암 하위 유형 및 단계 정리 수 추가적인 동물 모델 필요 합니다. 이식 또는 종이 식 모델 다재 다능 하 고 tumorigenic 용량에 vivo에서, murine 또는 인간 기원의 악성 세포를 사용 하 여의 정량화를 활성화. 그러나, 폐 암 세포 engraftment의 앞에서 설명한 방법 orthotopic 이식 세포는 폐로의 비 효율으로 인해 마우스의 측면 등 생리 적 비 사이트에서 수행 되었습니다. 이 연구에서 우리가 미리 섬유 증 유도 에이전트 bleomycin와 쥐의 기도 조절 하 여 orthotopic 폐 암 세포 engraftment를 강화 하는 방법을 설명 합니다. 개념 증명 실험으로 우리 쥐의 다양 한 긴장으로 마우스 또는 인간의 소스에서 얻은 폐 선 암 하위의 종양 세포를 engraft에이 접근을 적용. 우리는 0-17에서 종양 세포의 engraftment 증가 종양 세포 주입 전에 bleomycin과 항공 부상 입증 71-100% %. 상당히,이 방법은 폐 종양 발생과 이후의 파생물을 다른 모델 및 마우스 긴장을 사용 하 여 향상. 또한, engrafted 폐 암 세포 관련 먼 장기로는 폐에서 보급. 따라서, 설정 하 고 셀 또는 biospecimen의 양의 제한 폐암의 새로운 orthotopic 모델을 유지 하 고 양적 폐 암 세포 생리학 관련 설정에서의 tumorigenic 용량을 평가 하기 위해 사용할 수 있는 프로토콜 제공 .

서문

폐암은 주요 원인의 암 관련 사망 세계1. 폐암 환자 결국 굴복 하는 전이에서 먼 장기에, 특히 중앙 신경 조직, 간, 부 신 분 비, 및 뼈2,,34. 흉부 악성 작은 세포 폐 암 (SCLC) 또는 비 작은 세포 폐 암 (NSCLC)5전통적으로 분류 되어 있다. NSCLC 이며 가장 자주 암 진단 폐 선 암 (LUAD)와 폐 편평 상피 세포 암 (LUSC)6을 포함 하 여 다른 조직학 하위로 세분화 될 수 있습니다. 절제 인간의 기본 폐 암의 게놈 분석 주어진된 histotype 내 종양 또한 다양 한 분자 섭, 더 그들의 분기 임상 진행에 기여 하 고 환자의 예 후를 혼동을 표현할 수 있는 공개 했다. 폐 암의 놀라운이 합리적인 디자인, 전 임상 테스트 및 효과적인 치료 전략의 구현에 중요 한 도전을 나타냅니다. 따라서, 다양 한 세포 기원, 분자 하위,이 질병의 단계를 공부 하 고 온순한 실험 폐 암 모델의 레 퍼 토리를 확장 하는 필요가 있다.

동물 모델을 사용 하 여 다양 한 접근 폐 암에서 공부 vivo에서, 각각의 생물 학적 질문에 따라 그들의 자신의 장단점을 고용 했습니다. 유전자 조작된 마우스 모델 (GEMMs) 주어진된 조상 세포 유형, 종양 immunocompetent 호스트7그 진행 결과에 특정 유전 변경 대상 수 있습니다. 매우 강력 하 고 임상 관련, 대기 시간, 변화, 및 폐 종양 사망률 GEMMs와 관련 된 특정 양적 측정 및 먼 장기8에 늦게 단계 전이의 탐지 금지 될 수 있습니다. 상호 보완적인 접근 이식 모델, 폐 암 세포, 마우스 종양에서 직접 하거나 문화, 설립된 셀 라인으로 먼저 파생 된 syngeneic 호스트에 다시 도입 이다 그것에 의하여의 사용 이다. 비슷하게, 폐 암 xenografts 인간 세포 선 또는 환자 파생된 종양 샘플에서 설정 됩니다. 인간 세포 선 xenografts 또는 환자 파생된 xenografts (PDXs)는 일반적으로 immunocompromised 쥐에서 하 고 따라서 완전 한 면역 감시9배제. 이 결점에도 불구 하 고 그들은 인간 biospecimens 연구 기본적인 vivo에서 속성과 GEMM 종양 보다 더 복잡 한 게놈 착오에 대 한 인코딩 인간 암 세포의 양의 제한 전파 하는 수단을 제공 합니다.

이식 및 xenografts 하나의 유용한 속성은 전통적인 제한 셀 희석 분석 실험, 종양 세포 (TICs)을 시작 하는 악성 세포 인구10의 주파수 척도를 고용 의무가 다는 것. 이 실험에서 셀의 정의 수는 동물의 측면으로 피하 주입 하 고 TICs의 주파수를 종양 걸릴 속도에 따라 예상할 수 있는. 그러나 피하 종양은 더 hypoxic11 수 있으며 폐 종양 microenvironment의 주요 생리 적인 제약을 모델링 하지 않을 수 있습니다. 쥐의 폐에 상피 줄기 또는 조상 세포의 Intratracheal 배달 폐 중생과 기도 줄기 세포 생물학12공부 하는 방법입니다. 그러나,이 기술은에서 engraftment 속도 폐 손상, 바이러스 감염13,14등의 생리 적 형태를 먼저 받게 됩니다 않는 한 상대적으로 낮은 수 있습니다. 자극적인 stromal 세포에서 지원 및 폐 지하실 막의 장애 원심 항공15벽 감 관련 줄기 세포로 이식된 세포의 보존을 높일 수 있습니다. 에이전트를 유도 하는 섬유 증 폐 engraftment 유도 만능 세포16 및17중간 엽 줄기 세포 강화에 사전 조건 또한 수 있습니다. 비슷한 형태의 기도 부상 engraftment 속도 영향을 미칠 수 있습니다, 여부를 종양 시작 용량 및 폐 암 세포의 파생물은 아직 체계적으로 평가 한다.

이 연구에서 우리는 사전 조건 부상으로 쥐의 폐에 의해 orthotopic 폐 암 세포 engraftment의 효율성을 증가 하는 방법을 설명 합니다. LUAD는 수시로 빈약한 예 지19와 상관 관계가 거리 기질18 개발이 암의 중요 한 하위 집합으로 원심 항공에서 발생 한다. Bleomycin polyketide-자연 nonribosomal 하이브리드 펩 티 드은 쥐20에 폐 섬유 증을 유도 하기 위해 광범위 하 게 이용 되어. Bleomycin의 기도 점 먼저 상피 마찰을 포에 염증 세포, 대 식 세포, 호 중구, monocytes21등의 채용을 승진 시킨다. 이것은 원심 항공, 지하실 멤브레인 개편22,23 , 세포 외 기질 (ECM) 증 착24에 개장 하는 조직에 의해 선행 된다. 대부분 연구25에서 30 일 후 해결 하는 섬유 증과 단일 bleomycin 주입의 효과 일시적 이며, 이식 및이 종이 식 모델을 사용 하 여, 사전 조건 bleomycin와 쥐의 기도 폐에서 LUAD 셀의 포획 률 증가 크게 수 테스트.

프로토콜

모든 실험 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 예일 대학에 의해 승인에 따라 실행 되었다.

1. 설정 /는 시 약의 준비.

  1. Bleomycin
    주의: 기반에 세계 조화 시스템 (GHS) 분류와 화학 물질의 라벨, bleomycin GHS08 건강 위험으로 분류 됩니다.
    1. 화학 후드에서 bleomycin을 준비 합니다. 멸 균 인산 염의 5 mL로 15 U resuspend 버퍼링 식 염 수 (PBS).
    2. Aliquot 100-200 µ L 유리에 솔루션의 리 바이 알 및 나중에 사용-20 ° C에서 그들을 동결. 제대로 물의 resuspension의 날짜와 튜브 라벨. 이 날짜 로부터 6 개월 이내 사용 합니다.
      참고: 각 마우스 스트레인 bleomycin26에 다른 감도 있다. 각 마우스 스트레인에 대 한 bleomycin의 다른 복용량을 테스트 하는 것이 좋습니다. 마우스 긴장 및 bleomycin 대표 실험에 사용 된 해당 복용량은 표 1에 나열 됩니다.
  2. 마우스
    1. 쥐 실험에 필요한 구입 하 고 허용 마우스 주입 전에 적응 7 일. Biosafety 두건에서 혼합을 수행 합니다. 동물 bleomycin 주입 전에 표준 제도적 절차를 사용 하 여 BSL2 룸 비 BSL2 규격 룸에 전송 합니다. 나이의 6-8 주에 쥐를 주입.
      주의: 마우스 기관 가이드라인 유해 에이전트, biosafety 수준 2 (BSL2)과 IACUC 승인 주사.
      참고: 마우스 대표 실험에 대 한 구입 자료의 테이블에에서 나열 됩니다. 남자 마우스만 사용 되었습니다.
  3. 폐 암 세포 선
    1. 그들의 각각 미디어 문화 원하는 셀 라인입니다. 주사, 전에 짧은 탠덤 반복 DNA 프로 파일링 또는 적절 한 셀 라인 식별 되도록 유전자 검사를 수행 합니다. 및 촉진 하기 위하여 vivo에서 ex vivo imaging, lentivirus 티 미 딘 키 니 아 제, 녹색 형광 단백질 (GFP)와 luciferase 퓨전 기자27, 세포 감염 하 고 형광 기자 긍정적인 셀 정렬 engraftment 이전 (FACS)를 정렬 하는 세포를 활성화. 테스트 라인 mycoplasma에 대 한 6 개월 마다.
      1. H2030 인간 암 세포 선 소 태아 혈 청 (FBS), 10% 로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI)를 사용 하 여 제조업체에서 권장 하는 대로 문화 페니실린-스와 암포 b
      2. 문화 ( KraG12D, p53-/- 마우스에서 파생 된) 368T1 murine 셀 라인 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM)를 사용 하 여 10 %FBS, 페니실린-스와 암포 b
      3. 문화 PC9 인간 암 세포 라인 RPMI를 사용 하 여 10 %FBS, 페니실린-스와 암포 b

2. bleomycin 치료

  1. 주입 마우스 intratracheally bleomycin 14 일전 종양 세포 engraftment 계획.
  2. 얼음 2 h 주입 이전에 bleomycin 주식 녹여
  3. 일단 해 동, bleomycin 원하는 작업 농도 (0.02 U/50 µ L 또는 0.005 U/50 µ L)에 희석 하 고 얼음에 그것을 유지.
    참고: bleomycin의 농도 실험 (표 1)을 위해 사용 마우스 변형에 따라 달라 집니다. 적정 bleomycin 생쥐에서의 최적의 복용량을 결정 하기 위해 수행 되어야 한다.
  4. 각각 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 최종 농도를 희석 하 여 마 취 준비, 100/10 mg/kg에서 케 타 민/xylazine intraperitoneally 용액을 주입 하 여 각 마우스 anesthetize 1 mL 주사기와 27 G 니 들을 사용 하 여 각각.
  5. 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
  6. 플랫폼에 대 한 그것의 뒤와 앞 이빨을 교수형에 삽 관 법 플랫폼에 한 번에 1 마우스를 놓습니다.
  7. 기도의 시각화로 돕기 위하여 광섬유 조명 기를 사용 하 여 상단의 가슴을 밝히는. 마우스의 입을 열고 꺼내 혀 부드럽게 살 균 플랫 집게와.
  8. 바늘 없이 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 호흡을 차단 하지 마십시오. 하얀 빛을 통해 카 테 터의 위치는 기관지의 개통에서 방출.
  9. 카 테 터의 위쪽 앞 니에 도달할 때까지 기도에 카 테 터를 삽입 합니다. 입에는 카 테 터의 개방을 통해 빛나는 하얀 빛을 시각화 하 여 기도에 카 테 테 르의 적절 한 배치를 확인 합니다.
  10. 전체 볼륨 흡입 되도록 카 테 터에 직접 bleomycin 또는 차량 (PBS)의 50 µ L를 분배를 피 펫을 사용 하 여. 무 균 조건 하에서이 단계를 수행 합니다.
  11. 카 테 터 삽입 올바르게 경우 마우스 카 테 터의 내용을 흡입 즉시 것입니다. 전체 볼륨 테 아래로 이동 될 때까지 몇 초 동안 기다립니다. 다음 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 10% 표 백제 솔루션에서 처리.
    참고: 단계 2.7-2.11 마우스 당 평균 시간 약 5 분입니다.
  12. 경우 마우스는 액체를 흡입 하지은, 신중 하 게 호흡을 모니터링 하 고 카 테 테 르 위치를 조정. 마우스에 호흡 중지 하는 경우 즉시 카 테 터를 제거 하 고 다시 카 테 터를 삽입 하기 전에 일반적으로 호흡을 다시 시작 하려면 마우스를 허용.
  13. 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 IACUC 승인된 난방 패드에 주입 된 마우스를 놓습니다. 모든 절차는 마우스 당 10 분을 걸릴 것입니다. 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 주입 받은 동물을 반환 하지 않습니다.
  14. 24 h에 대 한 감 금 소에 "유해 화학 물질 사용" 카드를 놓습니다.

3. 모니터링 마우스 후 삽 관 법

  1. 마우스 마 취에서 깨어날 때까지 삽 관 법 및 다음 모든 15 분 직후 호흡 곤란에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지.
  2. 고통을 완화 시키기 위해 intraperitoneally (5 mg/kg) ketoprofen 주사.
  3. 쥐 24 시간 게시물 삽 관 법 그리고 병의 어떤 표시 든 지를 위한 일주일에 3 번 검사 합니다.
  4. 절차, 동물 식별, 절차의 유형, 유형의 시간, 마 취 및 수술 모니터링 관측의 날짜의 기록을 유지.
  5. 체중 감소, 호흡 곤란, 행동 이상, 및 몸 상태 점수에 대 한 마우스를 모니터 < 2 (척추 열 분명 지 골반 뼈의 세분화는 만져 서) 격주 bleomycin의 주입 다음.
  6. 호흡 곤란에서 마우스 또는 마우스는 CO2 또는 케 타 민/xylazine 뒤에 자 궁 경부 전위 몸 질량의 15% 감소를 경험 했다 안락사. 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.

4입니다. 폐 선 암 세포 선의 engraftment입니다.

참고: 셀의 engraftment bleomycin (2.1 단계)의 주사 후 14 일을 수행 합니다.

  1. 성장을 75 cm2 플라스 크에서 그대로 해당 미디어와 함께 주입의 하루 전에 3 일 동안 1.3 단계에서 설명한 대로 셀을 허용 합니다.
    참고: 그들은 주입의 하루에 80% 합칠 수 한다 (해당 2-3 10 배 하는6 셀 라인에 따라 각 플라스 크에).
  2. 실 온에서 PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크에 세포를 씻어.
  3. PBS를 발음 하 고 셀에 trypsin의 1.5 mL를 추가 하 고 셀 분리 (일반적으로 2-5 분) 때까지 37 ° C에서 세포를 품 어.
    참고: 아래 플라스 크 또는 가벼운 현미경의 간단한 시각화 플라스틱에서 셀 분리에 대 일 분 마다 검사 것이 좋습니다. 트립 신 가진 외피의 5 분을 초과 하지 마십시오.
  4. 10%를 포함 하는 미디어의 4 mL를 추가 하 여 트립 신 중화 FBS (동일한 미디어 4.1 단계로). 15 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 실 온에서 3 분 x g 200에서 원심.
  5. 미디어를 발음 하 고 세포를 씻어 PBS의 5 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 셀 작은 셀을 실 온에서 3 분 200 x g에서 원심 이 1 시간을 반복 합니다.
  6. PBS를 발음 하 고 플라스 크 당 1.5 ml PBS의 펠 릿을 resuspend.
  7. Trypan 블루의 50 µ L로 세포 혼합물의 50 µ L를 혼합 하 고 셀 카운터/Hemocytometer 챔버28를 사용 하 여 셀.
  8. 마우스 당 50 µ L에서 세포 현 탁 액 셀 1 x 105 셀 (또는 표시 다른 금액)을 주입 하는 PBS에 희석 하 여 준비 합니다. 주입 전에 얼음에 셀을 계속.
    참고: 적어도 두 번 셀 세포 현 탁 액의 밖으로 실행 되지 않도록 분사에 대 한 준비.
  9. 각각 마 취 제 및 xylazine 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 최종 농도를 희석 하 여 마 취 준비, 100/10 mg/kg에서 케 타 민/xylazine intraperitoneally 용액을 주입 하 여 각 마우스 anesthetize 1 mL 주사기와 27 G 니 들을 사용 하 여 각각.
  10. 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
  11. 플랫폼에 대 한 그것의 뒤와 앞 이빨을 교수형에 삽 관 법 플랫폼에 한 번에 1 마우스를 놓습니다.
  12. 기도의 시각화로 돕기 위하여 광섬유 조명 기를 사용 하 여 상단의 가슴을 밝히는.
  13. 부드럽게 p200 피 펫을 사용 하 여 그들은 덩어리를 형성 하지 않는다 다는 것을 확인 하는 셀 resuspend 마우스의 입을 열고 꺼내 혀 부드럽게 살 균 플랫 집게와.
  14. 정 맥 카 테 터를 사용 하 여 호흡을 차단 하지 않도록 제거 하는 바늘. 하얀 빛을 통해 카 테 터의 위치는 기관지의 개통에서 방출.
  15. 카 테 터의 위쪽 앞 니에 도달할 때까지 기도에 카 테 터를 삽입 합니다. 입에는 카 테 터의 개방을 통해 빛나는 하얀 빛을 시각화 하 여 기도에 카 테 테 르의 적절 한 배치를 확인 합니다.
  16. 전체 볼륨 흡입 되도록 카 테 터에 직접 셀의 50 µ L를 분배를 피 펫을 사용 하 여. 무 균 조건 하에서이 단계를 수행 합니다.
    참고:이 경우 카 테 터 삽입 올바르게 마우스는 즉시 카 테 터의 내용을 흡입.
  17. 전체 볼륨 카 테 터, 아래로 여행 때까지 몇 초 정도 기다린 다음 기도에서 카 테 터를 제거 하 고 10% 표 백제 솔루션에서 처리.
  18. 경우 마우스는 액체를 흡입 하지은, 신중 하 게 호흡을 모니터링 하 고 카 테 테 르 위치를 조정. 마우스에 호흡 중지 하는 경우 즉시 카 테 터를 제거 하 고 다시 카 테 터를 삽입 하기 전에 일반적으로 호흡을 다시 시작 하려면 마우스를 허용.
    참고: 4.11-4.18 단계의 마우스 당 평균 시간 약 5 분입니다.
  19. 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 IACUC 승인된 난방 패드에 주입 된 마우스를 놓습니다.
    참고: 모든 절차는 마우스 당 10 분을 소요 됩니다. 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 주입 받은 동물을 반환 하지 않습니다.
  20. Ventrally 전체 갈비뼈 두 영역을 면도 하 고 dorsally B6129SF1/J와 검은 머리와 다른 마우스 긴장의 이미징 이전 전기 면도기를 사용 하 여.
  21. 세포 주입 후 2-3 분 복고 orbitally 소의 100 µ L를 주사 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 대체 눈 주입 모든 이미징 세션에 대 한 사용.
  22. 적어도 2 분 후 최대 5 쥐 등 recumbency 위치에 동물 생물 발광 영상에서 놓고 발광 설정29를 사용 하 여 복 부 사진을 수집 합니다.
  23. 제어판에서 주어진된 셀 라인의 발광 측정 해상도 감도 설정을 조정 합니다. 대부분의 응용 프로그램에 대 일 분 (또는 "자동" 포화 하는 경우), binning 시작 매체 (4), F/정지 = = 1, 보기의 필드 = D, 주제 높이 1.50 =.
    참고: 성공적으로 주입 되 면 한 폐 또는 모두 폐에 위 가슴 지역에 발광 신호 감지 됩니다.
  24. Sternal recumbency 위치에 마우스를 플립 하 고 위와 같이 등 그림을 확보.
    참고: 셀 주입이 제대로 수행 되지 않습니다, 경우 목 또는 기도의 입구에서 셀 클러스터 수 있습니다.
  25. Ketoprofen 주사 5 mg/kg intraperitoneally 고통을 완화.
  26. 그들의 감 금 소에 다시 마우스를 이동 하 고 감 금 소에 "에이전트에서 사용 BSL-2" 카드를 놓습니다.
  27. 마우스 마 취에서 깨어날 때까지 삽 관 법, 및 다음 모든 15 분 직후 호흡 곤란에 대 한 마우스를 모니터링 합니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지.
  28. 마우스 24 시간 게시물 삽 관 법 그리고 병의 어떤 표시 든 지를 위한 일주일에 세 번 검사 합니다.
  29. 절차, 동물 식별, 절차의 유형, 종류의 마 취 및 수술 모니터링 관측 및 시간의 날짜의 일지에 기록을 유지.
  30. 체중 감소, 호흡 곤란, 행동 이상, 및 몸 상태 점수에 대 한 마우스를 모니터 < 2 (척추 열 분명 지 골반 뼈의 세분화는 만져 서) 격주 bleomycin의 접종 다음.
    참고: 폐 종양 쥐 호흡기 자극, 체중 감소, 악, 및 죽음 전시 수 있습니다.
  31. 호흡 곤란에서 마우스 또는 마우스는 CO2 또는 케 타 민/xylazine 조직 수집 하는 경우 자 궁 경부 전위 뒤 몸 질량의 15% 감소를 경험 했다 안락사. 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.

5. 생물 발광 영상에서 종양의 성장을의 모니터링

  1. 그 후 3 일 후 engraftment 주간에서 쥐의 이미지를 반복 합니다.
  2. Anesthetize 마우스 (2.4-2.5 단계에서 설명)로 마 취 제/xylazine를 주입 또는 흡입된 isoflurane (2%). 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 적절 한 anesthetization를 확인 하는 발가락 핀치를 고용. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
  3. Ventrally 전체 갈비뼈 두 영역을 면도 하 고 dorsally B6129SF1/J와 검은 머리와 다른 마우스 긴장의 이미징 이전 전기 면도기를 사용 하 여.
  4. 일단 쥐 마 취, 복고풍 orbitally 소의 100 µ L을 주입 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 2 분 대체 주입 모든 이미징 세션에 사용 하는 눈을 기다립니다.
  5. 영상에 마우스를 놓고 단계 4.22-4.24에에서 설명 된 대로 등 쪽과 복 부 이미지를 취득 합니다.
  6. 이미징, 복구에 대 한 평평한 표면에 그들의 뒤에 후 다시으로 마우스를 놓습니다.
    참고: 모든 절차 5 쥐의 그룹 당 5 분 소요 됩니다. 두지 마십시오 쥐 무인 그들은 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복가지고 때까지.
  7. 영상/생물 발광 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지를 분석 합니다.
    1. 적절 한 이미지를 선택 하 고 생물 발광 분석 소프트웨어에서 그룹으로 그들을 로드.
    2. 클릭 ROI 도구 | 스퀘어 (ROI)의 사각형 영역을 추가 하려면. 장소 전체 폐 이미지를 취재 위 가슴 지역에 투자 수익. 각 마우스 이미지에 대 한이 반복 합니다.
    3. 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 모든 수익을 복사 함수 그룹에 있는 모든 이미지에 같은 투자 수익을 적용 하 고 마우스, 복 부 및 등 쪽의 위 가슴에 그들의 위치를 선택 합니다.
    4. 이미지 창의 왼쪽된 상단에서 광자 함수를 선택 합니다. ROIs를 측정 하기 위해 측정 제어 패널 기능을 클릭 합니다. 복사 하 고 데이터를 분석 하는 선택의 소프트웨어에 총 속 (광자/s)를 포함 하는 출력 테이블을 붙여 넣습니다.
    5. 0에 측정 ROI 값 각 마우스의 매일 ROI 값 정상화.

6. 조직 절연 고 처리 합니다.

  1. (대로 2.4-2.5 또는 흡입된 isoflurane (2%)에 의해 단계에서 설명 케 타 민/xylazine를 주입 하 여 마우스 anesthetize 합니다. 생쥐의 호흡을 모니터링 하 고 발가락 핀치를 고용. 마우스 핀치 발가락에 응답 하지 않는 경우 적절 한 anesthetization를 확인 합니다. 수 의사 연 고 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
  2. 복고풍 orbitally 소의 100 µ L를 주사 (15 mg/mL)는 인슐린 바늘을 사용 하 여. 2 분을 기다립니다.
  3. 이 프로토콜에서 단계 4.22-4.24 다음 이미지 마우스.
  4. 6.2 단계에서 다른 눈에 복고풍 orbitally 안락사 전에 인슐린 바늘을 사용 하 여 소의 또 다른 100 µ L를 삽입할.
  5. 케 타 민/xylazine의 복 주입 하 여 쥐를 안락사 경우 마우스 IACUC에 의해 제공 된 지침에 따라 깊은 마 취는 자 궁 경관 탈 구 다음 (자세한 내용은 2.4 단계 참조). 호흡 활동에 대 한 촉진을 실시 하 여 안락사를 확인 합니다.
  6. 무 균 수술가 위 게 흉 골 아래 피부 절 개를 사용 하 여. 집게와 수술가 위를 사용 하 여 횡 경 막 따라 근육 층 열고 흉 강 내부 흉부 동맥을 피하고 측면 측면 중 하나에 흉 곽을 통해 절단 하 여 노출 합니다.
  7. 심장의 오른쪽 아 트리 움에 작은 절 개를 하 여 마우스를 perfuse 하 고 좌 심 실 통해 PBS의 5 mL 주입. 폐 조직의 색 혈액 관류 제대로 창백한 핑크-흰색 빨강에서 갈 것입니다.
  8. 집게와 식도 또는 마음을 잡아서 흉 강에서 폐를 신중 하 게 소비 세. 부드럽게 당겨 조직 하 고 수술가 위를 사용 하 여 신중 하 게 찔린 폐 조직의 피하 연결 조직을 잘라. 기도 유지 가능한 나중 단계에서 폐 기도의 인플레이션에 대 한.
  9. 잠수 하 여 폐를 세척 하 고 과잉 혈액을 제거 하는 PBS의 3 mL 가득 6 잘 플레이트에 조직 3 번 소용돌이.
  10. 6 잘 플레이트의 뚜껑에 폐 고 발광 영상에서 조직을 포함 하는 뚜껑 장소 놓고 발광 이미지30을 취득.
    참고: 좋습니다 "수집 제어판"에서 다음과 같은 설정을 선택 "보기의 필드 = A" 및 "주제 높이 = 0.75 m" 다음 "자동 노출" 선명한 이미지를 받지 않으려면.
  11. 소비 세 단계 6.9-6.10, 발광, 뇌, 간, 부 신, 뼈, 림프절, 신장 또는 비장의31등으로 확인 된 전이에서 다 다른 장기를 심상 하 고.
  12. 마우스의 기관지에 바늘을 삽입 하 여 4 %paraformaldehyde 1 mL와 함께 폐를 perfuse. 폐 면 잘 perfused 부 풀 려 것입니다.
    주의: 4 %paraformaldehyde 이다 독성, 건강 위험 GHS07 및 GHS08.
  13. 4 %paraformaldehyde 5 mL와 함께 15 mL 원뿔로 폐를 전송 합니다.
  14. 30-50 rpm에서 떨고 장치에 4 ° C에서 하룻밤 4 %paraformaldehyde 조직 배양 하 여 폐 나 다른 조직 수정.
  15. 파라핀 또는 복합 응용 프로그램32에 따라 최적의 절삭 온도에 폐 (또는 다른 조직)를 포함 합니다.
    참고: 파라핀은 폐 구조 유지를 선호 하는 방법 및 Masson Trichrome 및 Hematoxylin에 오신 얼룩이.

결과

LUAD 암 세포 engraftment 쥐의 폐에의 효율성 증가, 우리는 먼저 사전 조건 항공 bleomycin orthotopic 종양 세포 주입 (그림 1) 다음을 사용 하 여 프로토콜 개발. 우리는 immunocompromised athymic 마우스에 투여 하는 경우에 bleomycin 과도 섬유 증에 의해 유도 된 하루 14 기도 건축과 증가 교원 질 공 술 서 (그림 2)의 손실에 의해 입증으로 확인 했...

토론

눈에 띄는 임상 유사물 폐암 및 폐36의 다른 만성 질환 사이 문서화 되었습니다. 특히, 환자 특 발성 폐 섬유 증 (IPF) 개발 폐암에 대 한 증가 취향이 있고이 협회는 독립적인 역사37,38흡연의. IPF 폐 건축과 ECM39의 증 착을 통해 장애인된 호흡 기능의 진보적인 파괴에 의해 특징입니다. 또한, 외과 절제술 다음 초기 단계 N...

공개

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 국립 암 연구소 (R01CA166376 및 D.X. 구 엔에 R01CA191489)와 국방부 (W81XWH-16-1-0227 D.X. 구 엔 하)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BleomycinSigmaB5507-15UNCAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24GFisher1484121Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344To anesthetize mice
XylazineButler Schein33198To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mgCayman Chemical10006661Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic OintmentBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powderPerkin Elmer Health Sciences Inc122799For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation standBraintree ScientificRIS-100Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MTo illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serratRobozRS-5111For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5mlBD / Fisher309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable ShaverConair-To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut bladesRobozRS-5840SC
15 mL conical tubeBD / Fisher352097
1.5 mL centrifuge tubesUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPIFisher701350
Filter pipette tips (200 μL)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Phosphate Buffered SalineLife Technologies14190-144
0.25% Trypsin-EDTALife Technologies25200-056
DMEM high glucoseLife Technologies11965-092
RPMI Medium 1640Life Technologies11875-093
Fetal bovine serum USDALife Technologies10437-028
Penicillin-StreptomycinLife Technologies15140-122
Amphotericin BSigmaA2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%Life Technologies15250-061
Countess Automated Cell CounterLife TechnologiesAMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue capFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262For in vivo bioluminescence imaging
Living image softwarePerkin Elmer Health Sciences Inc128113For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia SystemPerkin Elmer Health Sciences Inc118918For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1mlBD / Fisher14-823-434For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needleBD / Fisher305111For intraperitoneal injections
4% ParaformaldehydeVWR43368-9MCAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL17014411
Mayer's HematoxylinELECTRON MICROSCOPY SCIENCES517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%Fisher67-63-0
Masson Trichrome Stain KitIMEB IncK7228For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slidesFisher1255015
6 well plateCorningC3516
Universal Mycoplasma Detection KitATCC30-1012K
OCT Embedding compoundELECTRON MICROSCOPY SCIENCES62550-12For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research CryostatLeicaCM3050 STo section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X700
ImageJUS National Institutes of HealthIJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) miceCharles RiverNIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) miceJackson Laboratories5557
B6129SF1/J miceJackson Laboratories101043
NIH-H2030 cellsATCCCRL-5914
368T1generously provided by Monte Winslow (Standford University)-
PC9 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-
H2030 BrM3 cellsNguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62-

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