Die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung erhöht die Effizienz der Orthotopen Lung Cancer Cell Engraftment

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur orthotopen Engraftment der Lungenkrebszellen in murinen Lungen deutlich zu verbessern, indem Vorklimatisierung die Atemwege mit Verletzungen. Dieser Ansatz kann auch angewendet werden, um die Stromale Interaktionen innerhalb der Lunge Mikroumgebung, metastasierendem Verbreitung, Lunge Krebs Komorbiditäten zu untersuchen und um effizienter Patient erzeugen Xenotransplantate abgeleitet.

Zusammenfassung

Lungenkrebs ist eine tödliche Behandlung refraktärer Krankheit, die biologisch heterogen ist. Um zu verstehen und effektiv die volle klinische Spektrum der thorakalen Tumoren zu behandeln, werden zusätzliche Tiermodellen, die vielfältigen menschlichen Lunge-Krebs-Subtypen und Stufen rekapitulieren können benötigt. Allograft oder Xenograft-Modelle sind vielfältig und erlauben die Quantifizierung der tumorigenic Kapazität in Vivo, mit malignen Zellen murinen oder menschlichen Ursprungs. Jedoch wurden zuvor beschriebene Methoden der Lunge Krebs Zelle Engraftment unphysiologischen Websites, z. B. die Flanke von Mäusen, aufgrund der Ineffizienz des orthotopen Transplantation von Zellen in der Lunge durchgeführt. In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur orthotopen Lunge Krebs Zelle Engraftment verbessern, indem die Atemwege von Mäusen mit Fibrose induzieren Agent Bleomycin Vorklimatisierung. Als ein Proof-of-Concept-Experiment haben wir diesen Ansatz um Tumorzellen von der Lunge Adenokarzinom Untertyp, gewonnen aus menschlichen Quellen oder Maus in verschiedene Stämme von Mäusen weiterhin angewandt. Wir zeigen, dass verletzte die Atemwege mit Bleomycin vor der Tumor Zelle Injektion das Engraftment von Tumorzellen von 0-17 erhöht % und 71-100 %. Diese Methode verbessert deutlich, Lungen-Tumor-Inzidenz und anschließende Auswuchs mit verschiedenen Modellen und Mausstämme. Darüber hinaus verbreiten eingepflanzt Lungenkrebszellen aus der Lunge in relevanten entfernten Organen. So bieten wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zur Schaffung und Aufrechterhaltung orthotopen Modellneuheiten an Lungenkrebs zu erkranken mit der Begrenzung der Mengen von Zellen oder ibbl und quantitativ bewerten die tumorigenic Kapazität der Lungenkrebszellen in physiologisch relevanten Einstellungen .

Einleitung

Lungenkrebs ist die führende Ursache von Krebs im Zusammenhang mit Todesfällen weltweit¹. Patienten mit Lungenkrebs erliegen schließlich von Metastasen in entfernten Organen, vor allem auf das zentrale Nervensystem, Leber, Nebennieren und Knochen^2,3,4. Thorakale Tumoren wurden traditionell als kleinzelligem Lungenkrebs (SCLC) oder nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) Krebs⁵eingestuft. NSCLC ist die am häufigsten malignen Erkrankungen diagnostiziert und können unterteilt werden in verschiedene histologische Subtypen, einschließlich Lungenkrebs Adenokarzinom (LUAD) und Lunge Plattenepithel-Karzinom (LUSC)⁶. Genomische Analyse des resezierten menschlichen primären Lungenkrebs hat ergeben, dass Tumoren innerhalb einer gegebenen Histotype auch unterschiedliche Molekulare Störungen, weiter einen Beitrag zu ihrer divergente klinische Progression und verwirrende Patienten Prognose zum Ausdruck bringen können. Die bemerkenswerte Heterogenität der Fälle von Lungenkrebs stellt eine große Herausforderung dar, der rationales Design, prä-klinischen Erprobung und Umsetzung von wirksamen Therapiestrategien. Infolgedessen gibt es eine Notwendigkeit, das Repertoire der gefügig experimentelle Lunge Krebs Modelle zur Untersuchung der verschiedenen zellulären Ursprung, molekularen Subtypen und Stadien der Erkrankung zu erweitern.

Verschiedene Ansätze mit Tiermodellen sind eingesetzt worden, um Lungenkrebs Krebs in Vivo, jede mit ihren eigenen vor- und Nachteile je nach den biologischen Frage(n) von Interesse zu studieren. Gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMMs) können bestimmte genetische Veränderungen in einem bestimmten Vorläuferzellen Zelltyp, was zu Tumoren, dass Fortschritte innerhalb einer immunkompetenten Wirt⁷ausrichten. Während extrem leistungsstark und klinisch relevante, kann die Latenz, Variabilität und/oder Lunge Tumor Morbidität verbunden mit GEMMs bestimmte quantitativen Messungen und die Aufdeckung von späten Stadium Metastasen in entfernten Organen⁸unerschwinglich sein. Ein ergänzenden Ansatz ist die Verwendung von Allograft-Modelle, wobei Lungenkrebszellen, entweder direkt von einem Maus-Tumor oder zunächst als etablierte Zelllinien in der Kultur abgeleitet in Phänomen Gastgeber wieder eingeführt werden. Analog, sind Lungenkrebs Krebs Xenotransplantate aus humanen Zelllinien oder Patienten abgeleiteten tumorproben gegründet. Menschliche Zelle Zeile Xenotransplantate oder Patienten abgeleiteten Xenotransplantate (PDXs) bestehen in der Regel bei immungeschwächten Mäusen und daher komplett immun-Überwachung⁹entgegen. Trotz dieses Nachteils bieten sie eine Allee zu propagieren, Begrenzung der Mengen an menschliche bioproben und Studium grundlegende in Vivo Eigenschaften von menschlichen Krebszellen, die komplexere genomische Aberrationen als GEMM Tumoren zu codieren.

Eine nützliche Eigenschaft von Allografts und Xenografts ist, dass sie zu traditionellen begrenzende Zelle Verdünnung Assays eingesetzt, um die Häufigkeit der Tumor Zellen (TICs) innerhalb einer malignen Zelle Bevölkerung¹⁰Einleitung zu quantifizieren. In diesen Experimenten eine definierte Anzahl von Zellen werden in die Flanke der Tiere subkutan injiziert und die Häufigkeit der TICs basierend auf Tumor nehmen Rate geschätzt werden kann. Subkutane Tumoren können jedoch mehr hypoxischen¹¹ und können nicht physiologischen Einschränkungen der Lunge Tumor Mikroumgebung modellieren. Intratrachealen Lieferung von epithelialen Stammzellen und Vorläuferzellen in der Lunge von Mäusen ist eine Methode, pulmonale Regeneration und Atemwege Stammzell-Biologie¹²zu studieren. Die Engraftment Rate von dieser Technik kann relativ gering, jedoch, wenn die Lunge physiologischen Formen der Verletzung, wie virale Infektion^13,14zunächst ausgesetzt sind. Unterstützung von Stromazellen Entzündungszellen und/oder die Unterbrechung der Basalmembran der Lunge kann Beibehaltung der transplantierten Zellen in relevanten Stammzell-Nischen in den distalen Atemwege¹⁵verbessern. Fibrose induzieren Agenten kann auch die Lungen Engraftment induzierten pluripotenten Zellen¹⁶ und mesenchymalen Stammzellen¹⁷verbessern Pre-Zustand. Ob ähnliche Formen der Atemwege Verletzungen die Engraftment Rate beeinflussen können, ist Tumor auslösende Kapazität und Auswuchs der Lungenkrebszellen noch nicht systematisch untersucht werden.

In dieser Studie beschreiben wir eine Methode zur Steigerung der Effizienz des orthotopen Lunge Krebs Zelle Engraftment durch Vorklimatisierung der Lunge von Mäusen mit Verletzungen. LUAD entsteht in den distalen Atemwegen eine bedeutende Teilmenge dieser Krebsarten entwickeln eine fibrotische Stroma¹⁸ , die oft mit schlechter Prognose¹⁹korreliert. Bleomycin, eine natürliche Nonribosomal Hybrid Peptid-Polyketid, wurde ausgiebig genutzt, Lungenfibrose in Mäusen²⁰induzieren. Atemwege Instillation von Bleomycin fördert zuerst epithelialen Fluktuation in den Alveolen und Rekrutierung von Entzündungszellen, einschließlich Makrophagen, Neutrophilen und Monozyten²¹. Dies wird gefolgt von Gewebe Umbau in der distalen Atemwegen, Basalmembran Reorganisation^22,23 und extrazelluläre Matrix (ECM) Ablagerung²⁴. Die Auswirkungen einer einzigen Bleomycin Einspritzung sind vergänglich, mit Fibrose nach 30 Tagen in den meisten Studien²⁵zu lösen. Mit Allograft und Xenograft Modellen, haben wir getestet, wenn die Atemwege von Mäusen mit Bleomycin Vorklimatisierung Take-Rate von LUAD Zellen in der Lunge erheblich steigern könnte.

Protokoll

Alle Experimente wurden gemäß Protokollen genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) an der Yale University durchgeführt.

1. richten Sie / Vorbereitung der Reagenzien.

1. Bleomycin
   Achtung: Basiert auf das Global Harmonisierte System (GHS) der Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien, wird Bleomycin als GHS08 gesundheitsschädlich eingestuft.
   1. Bleomycin in einer chemischen Kapuze vorbereiten. Aufschwemmen Sie 15 U in 5 mL sterilem Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Aliquoten 100-200 µL der Lösung in Glas vials und frieren sie bei-20 ° C für eine spätere Verwendung. Richtig beschriften der Röhrchen mit dem Datum der Wiederfreisetzung. Innerhalb von 6 Monaten ab diesem Datum verwenden.
      Hinweis: Jeder Maus-Stamm hat eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Bleomycin²⁶. Tests von verschiedenen Dosierungen von Bleomycin für jede Maus Belastung empfohlen. Die Maus-Stämmen und den entsprechenden Dosen von Bleomycin repräsentative Experimente sind in Tabelle 1aufgeführt.
2. Mäuse
   1. Kaufen Sie Mäuse für das Experiment benötigt zu und lassen Sie Mäuse 7 Tage vor der Injektion zu akklimatisieren. Führen Sie Infusionen in einem Biosafety-Haube. In einem nicht-BSL2 konform Raum BSL2 Raum über institutionelle Standardverfahren vor der Infusion von Bleomycin untergebrachten Tiere zu übertragen. Injizieren Sie Mäuse im Alter von 6-8 Wochen.
      Achtung: Spritzen Sie Mäuse nach institutionellen Richtlinien für gefährliche Arbeitsstoffe, Sicherheitsstufe 2 (BSL2) und IACUC Genehmigung.
      Hinweis: Mäuse gekauft für die repräsentative Experimente sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Nur männliche Mäuse sind benutzt worden.
3. Lunge-Krebs-Zell-Linien
   1. Die gewünschte Kultur Zelllinien in ihren jeweiligen Medien. Durchführen Sie vor Injektionen short tandem repeat DNA-profiling oder genetischen Tests, um sicherzustellen korrekte Zelle Zeile Identifikation. Erleichterung in Vivo und ex Vivo imaging, Zelllinien mit ein Ausdruck der Thymidin-Kinase, grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Luciferase Fusion Reporter²⁷Lentivirus anstecken und Fluoreszenz Reporter positive Zellen Sortieren Sortierung (FACS) vor Engraftment Zelle aktiviert. Linien für Mykoplasmen alle 6 Monate zu testen.
      1. Kultur H2030 menschlichen Krebs-Zell-Linie Empfehlung des Herstellers über Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS), Penicillin-Streptomycin und Amphotericin b.
      2. Kultur 368T1 murinen Zelllinie (abgeleitet von Kras-^G12D, p53^{- / -} Maus) mit Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 10 % FBS, Penicillin-Streptomycin und Amphotericin b.
      3. Kultur PC9 menschlichen Krebs-Zell-Linie 10 % RPMI mit FBS, Penicillin-Streptomycin und Amphotericin b.

(2) Bleomycin Behandlung

1. Möchten Sie Mäuse Intratracheally mit Bleomycin 14 Tage vor Tumor Zelle Engraftment injizieren.
2. Tauen Sie Bleomycin Lager auf Eis 2 h vor der Injektion.
3. Einmal aufgetaut, verdünnen Sie Bleomycin, die gewünschten Arbeiten-Konzentration (0,02 U/50 µL oder 0,005 U/50 µL) und lassen Sie ihn auf Eis.
   Hinweis: Konzentration von Bleomycin richtet sich nach der Maus Belastung für die Experimente (Tabelle 1). Titration von Bleomycin bei Mäusen sollte durchgeführt werden, um die optimale Dosis zu ermitteln.
4. Betäubung durch Verdünnung Ketamin und Xylazin, eine Endkonzentration von 10 mg/mL und 1 mg/mL, bzw. bereiten, mit Hilfe einer 1 mL Spritze und 27 G Nadel, jede Maus durch die Injektion von intraperitoneal Ketamin/Xylazin-Lösung bei 100/10 mg/kg zu betäuben bzw..
5. Die Atmung von Mäusen zu überwachen und eine Zehe Prise beschäftigen. Richtige Anesthetization zu bestätigen, wenn die Maus nicht reagiert, bis zu den Zehen Prise. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
6. Platz 1-Maus zu einem Zeitpunkt auf eine Intubation Plattform durch Erhängen ihre vorderen Zähne mit dem Rücken gegen die Plattform.
7. Beleuchten Sie die Brust mit einer Glasfaser-Beleuchtung um mit Visualisierung der Luftröhre zu helfen. Öffnen Sie den Mund der Maus und ziehen Sie die Zunge heraus sanft mit sterilen flachen Zange.
8. Verwenden Sie einen intravenöse Katheter ohne die Nadel um zu vermeiden, Atmung blockiert. Position des Katheters über das weiße Licht emittiert von der Öffnung der Luftröhre.
9. Schieben Sie den Katheter in die Luftröhre, bis die Spitze des Katheters die vorderen Zähne erreicht. Bestätigen Sie die richtige Platzierung des Katheters in der Luftröhre durch die Visualisierung des weiße Lichts durch die Öffnung des Katheters in den Mund.
10. Mit einer Pipette, verzichten Sie 50 µL Bleomycin oder Fahrzeug (PBS) direkt in den Katheter um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen eingeatmet wird. Führen Sie diesen Schritt unter sterilen Bedingungen.
11. Wenn der Katheter richtig eingesetzt ist, wird die Maus sofort den Inhalt des Katheters inhalieren. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volumen hinunter den Katheter reist. Dann entfernen Sie den Katheter aus der Luftröhre und entsorgen Sie 10 % Bleichmittel-Lösung.
    Hinweis: Die durchschnittliche Zeit pro Maus Schritte 2,7-2.11 ist ca. 5 min.
12. Wenn die Maus nicht Einatmen von Flüssigkeit ist, überwachen Sie Atmung und passen Sie die Position des Katheters. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie den Katheter sofort und lassen Sie die Maus wieder atmen normalerweise vor dem neu einlegen des Katheters.
13. Ort der injizierten Maus auf eine IACUC genehmigt Heizkissen in Rückenlage auf einer flachen Oberfläche für die Wiederherstellung. Die ganze Prozedur dauert 10 min. per Mausklick. Ein Tier, die Injektion an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt durchgemacht hat nicht zurück.
14. Legen Sie eine "Gefährliche Chemikalien in Use" Karte auf dem Käfig für 24 h.

3. Überwachung der Mäuse nach Intubation

1. Überwachen Sie die Mäuse für Atemnot sofort nach Intubation und dann alle 15 min bis Mäuse aus der Narkose aufwachen. Nicht unbeaufsichtigt Mäuse bis sie ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt haben.
2. Ketoprofen (5 mg/kg) intraperitoneal, um Schmerzen zu lindern, zu injizieren.
3. Untersuchen Sie die Mäuse 24 h Post Intubation und 3 Mal pro Woche auf Anzeichen von Morbidität.
4. Notieren Sie das Datum der Verfahren, Tierkennzeichnung, Art des Eingriffs, Art der Narkose und postoperative Überwachung Beobachtungen mit Zeiten.
5. Überwachen Sie die Mäuse für Gewichtsverlust, Atemnot, Verhaltens-Auffälligkeiten und einen Körper-Zustand-Score < 2 (Segmentierung der Wirbelsäule deutlich/dorsalen Beckenknochen sind spürbar) zweimal wöchentlich nach Injektion von Bleomycin.
6. Einschläfern Sie Mäuse unter Atemnot oder Mäuse, die 15 % der Körpermasse durch CO₂ oder Ketamin/Xylazin gefolgt von zervikale Dislokation erlitten haben. Bestätigen Sie Euthanasie durch Palpation für Atmungsaktivität Durchführung.

4. Engraftment Lunge Adenokarzinom-Zell-Linien.

Hinweis: Führen Sie Engraftment Zellen 14 Tage nach der Injektion von Bleomycin (Schritt 2.1).

1. Können Sie Zellen in 75 cm² Fläschchen ungestört für 3 Tage vor dem Tag der Injektion mit entsprechenden Medien wachsen wie in Schritt 1.3 angegeben.
   Hinweis: sie sollten 80 % Zusammenfluss am Tag der Injektion (entspricht 2-3 x 10⁶ in jedem Kolben je nach Zelllinie).
2. Waschen Sie die Zellen wachsen auf 75 cm² Fläschchen mit 5 mL PBS bei Raumtemperatur.
3. Aspirieren Sie PBS und fügen Sie 1,5 mL Trypsin zu den Zellen und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, bis die Zellen (in der Regel 2-5 min) lösen.
   Hinweis: Wir empfehlen alle 2 min für Zelle Loslösung aus dem Kunststoff durch einfache Visualisierung von der Unterseite des Kolbens oder unter einem Lichtmikroskop. Überschreiten Sie 5 min Inkubation mit Trypsin nicht.
4. Trypsin zu neutralisieren, indem man 4 mL Medium mit 10 % FBS (dieselben Medien als Schritt 4.1). Sammeln Sie die Zellen in eine 15 mL-Tube und Zentrifugieren sie 200 X g für 3 min bei Raumtemperatur.
5. Aspirieren Sie die Medien und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL PBS, Zellen zu waschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 200 X g für 3 min bei Raumtemperatur, pellet-Zellen. Wiederholen Sie dieses 1 mal.
6. Aspirieren der PBS und das Pellet in 1,5 mL PBS pro Flasche aufzuwirbeln.
7. Mischen Sie 50 µL der Zelle Mischung mit 50 µL Trypan blau und zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zelle Counter/Hemocytometer Kammer²⁸.
8. Bereiten Sie Zellsuspension durch Verdünnung der Zellen mit PBS-Puffer, 1 x 10⁵ Zellen (oder anderer Betrag angegeben) zu injizieren, in 50 µL pro Maus. Halten Sie die Zellen auf dem Eis vor der Injektion.
   Hinweis: Bereiten Sie mindestens zwei Mal mehr Zellen für die Injektion zu verhindern, dass der Zellsuspension.
9. Betäubung durch Verdünnung Ketamin und Xylazin, eine Endkonzentration von 10 mg/mL und 1 mg/mL, bzw. bereiten, mit Hilfe einer 1 mL Spritze und 27 G Nadel, jede Maus durch die Injektion von intraperitoneal Ketamin/Xylazin-Lösung bei 100/10 mg/kg zu betäuben bzw..
10. Die Atmung von Mäusen zu überwachen und eine Zehe Prise beschäftigen. Richtige Anesthetization zu bestätigen, wenn die Maus nicht reagiert, bis zu den Zehen Prise. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
11. Platz 1-Maus zu einem Zeitpunkt auf eine Intubation Plattform durch Erhängen ihre vorderen Zähne mit dem Rücken gegen die Plattform.
12. Beleuchten Sie die Brust mit einer Glasfaser-Beleuchtung um mit Visualisierung der Luftröhre zu helfen.
13. Aufschwemmen der Zellen sanft mit einer p200-Pipette, um sicherzustellen, dass sie keine Klumpen bilden. Öffnen Sie den Mund der Maus und ziehen Sie die Zunge heraus sanft mit sterilen flachen Zange.
14. Verwenden Sie einen intravenöse Katheter mit der Nadel entfernt, um die Atmung blockieren zu vermeiden. Position des Katheters über das weiße Licht emittiert von der Öffnung der Luftröhre.
15. Schieben Sie den Katheter in die Luftröhre, bis die Spitze des Katheters die vorderen Zähne erreicht. Bestätigen Sie die richtige Platzierung des Katheters in der Luftröhre durch die Visualisierung des weiße Lichts durch die Öffnung des Katheters in den Mund.
16. Mit einer Pipette, verzichten Sie 50 µL Zellen direkt in den Katheter um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen eingeatmet wird. Führen Sie diesen Schritt unter sterilen Bedingungen.
    Hinweis: Wenn der Katheter richtig eingesetzt ist, wird die Maus sofort den Inhalt des Katheters zu inhalieren.
17. Warten Sie einige Sekunden, bis das gesamte Volumen hinunter den Katheter reist und dann den Katheter aus der Luftröhre entfernen und entsorgen in 10 % Bleichmittel-Lösung.
18. Wenn die Maus nicht Einatmen von Flüssigkeit ist, überwachen Sie Atmung und passen Sie die Position des Katheters. Wenn die Maus aufhört zu atmen, entfernen Sie den Katheter sofort und lassen Sie die Maus wieder atmen normalerweise vor dem neu einlegen des Katheters.
    Hinweis: Die durchschnittliche Zeit pro Maus Schritte 4.11-4.18 ist ca. 5 min.
19. Ort der injizierten Maus auf eine IACUC genehmigt Heizkissen in Rückenlage auf einer flachen Oberfläche für die Wiederherstellung.
    Hinweis: Die ganze Prozedur dauert 10 min. per Mausklick. Ein Tier, die Injektion an die Gesellschaft anderer Tiere bis vollständig erholt durchgemacht hat nicht zurück.
20. Rasieren Sie die gesamte rippenbereich ventral und dorsal B6129SF1/J und anderen Mausstämme mit dunklen Haaren mit einen elektrischen Rasierer vor Bildgebung.
21. 2 – 3 min. nach Zelle Injektion Spritzen 100 µL Luciferin Retro-Orbital (15 mg/mL) mit einer Insulin-Nadel. Wechseln Sie das Auge für die Injektion alle bildgebenden Sitzung verwendet.
22. Legen Sie nach mindestens 2 min bis zu 5 Mäusen in einer tierischen Biolumineszenz Imager in der dorsalen liegen Position und erwerben Sie ventralen Bilder mit Lumineszenz Einstellungen²⁹zu.
23. Einstellungen Sie unter der Systemsteuerung die Auflösung und Empfindlichkeit zur Messung der Lumineszenz einer bestimmten Zelllinie. Für die meisten Anwendungen beginnen mit 3 min (oder "Auto", wenn gesättigt), binning = Mittel (4), F/Stop = 1, Field Of View = D, Thema Höhe = 1.50.
    Hinweis: Wenn die Injektion erfolgreich ist, wird im oberen Brustbereich, in einem Lungenflügel oder beider Lungenflügel Lumineszenz-Signal erkannt.
24. Flip Mäuse auf sternalen liegen zu positionieren und eine dorsale Bild wie oben beschrieben zu erwerben.
    Hinweis: Wenn Zelle Injektion nicht ordnungsgemäß ausgeführt wird, können Zellen am Eingang der Luftröhre oder im Nacken cluster.
25. Ketoprofen Injektion 5 mg/kg intraperitoneal, Schmerzen zu lindern.
26. Mäuse in ihren Käfig zurück und legen Sie eine Karte "BSL-2 Agent im Einsatz" auf dem Käfig.
27. Überwachen Sie Mäuse für Atemnot sofort nach Intubation und dann alle 15 min bis Mäuse aus der Narkose aufwachen. Nicht unbeaufsichtigt Mäuse bis sie ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt haben.
28. Untersuchen Sie die Mäuse 24 h Post Intubation und dreimal pro Woche auf Anzeichen von Morbidität.
29. Halten Sie die Aufzeichnung in das Logbuch des Datums der Verfahren, Tierkennzeichnung, Verfahren, Art der Narkose und postoperative Überwachung Beobachtungen und Zeiten.
30. Mäuse für Gewichtsverlust, Atemnot, Verhaltens-Auffälligkeiten und einen Körper-Zustand-Score zu überwachen < 2 (Segmentierung der Wirbelsäule deutlich/dorsalen Beckenknochen sind spürbar) zweimal wöchentlich nach Inokulation von Bleomycin.
    Hinweis: Mäuse mit Lungentumoren können Reizung der Atemwege, Gewichtsverlust, Kachexie und/oder Tod aufweisen.
31. Einschläfern Sie Mäuse unter Atemnot oder Mäuse, die 15 % der Körpermasse durch CO₂ oder Ketamin/Xylazin gefolgt von zervikale Dislokation, wenn Gewebe sammeln erlitten haben. Bestätigen Sie Euthanasie durch Palpation für Atmungsaktivität Durchführung.

5. Überwachung des Tumorwachstums durch Biolumineszenz-Bildgebung

1. Wiederholen Sie Bildgebung der Mäuse am 3. Tag nach dem Engraftment und wöchentliche danach.
2. Betäuben Sie Mäuse durch Injektion von Ketamin/Xylazin (wie 2,4-2,5 beschrieben) oder durch eingeatmete Isofluran (2 %). Atmung von Mäusen zu überwachen und beschäftigen ein Zeh kneifen, richtige Anesthetization zu bestätigen. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
3. Rasieren Sie die gesamte rippenbereich ventral und dorsal B6129SF1/J und anderen Mausstämme mit dunklen Haaren mit einen elektrischen Rasierer vor Bildgebung.
4. Sobald die Mäuse unter Narkose sind, Spritzen 100 µL Luciferin Retro-Orbital (15 mg/mL) mit einer Insulin-Nadel. Warten Sie 2 min. Stellvertreter das Auge für die Injektion alle bildgebenden Sitzung verwendet.
5. Mäuse in der Imager und erwerben Sie dorsalen und ventralen Bilder zu, wie 4,22-4.24 beschrieben.
6. Platzieren Sie Mäuse zurück in den Käfig nach Bildgebung, in Rückenlage auf einer flachen Oberfläche für die Wiederherstellung.
   Hinweis: Die ganze Prozedur dauert 5 min pro Gruppe von 5 Mäusen. Nicht unbeaufsichtigt Mäuse bis sie ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt haben.
7. Analysieren Sie die Bilder mithilfe der Imager/Biolumineszenz-Analyse-Software.
   1. Wählen Sie die entsprechenden Bilder und laden Sie sie als Gruppe in der Biolumineszenz-Analyse-Software.
   2. Klicken Sie ROI-Tool | Quadrat eine quadratischen Region of Interest (ROI) hinzufügen. Platzieren Sie den ROI über den oberen Brustbereich, deckt die gesamte Lunge Bild. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Maus Bild.
   3. Rechten Maustaste und wählen Sie kopieren alle ROI Funktion gilt die gleiche Rendite für alle Bilder in der Gruppe und positionieren Sie diese in den oberen Brustkorb der Mäuse, ventralen und dorsalen Ansichten.
   4. Wählen Sie in der oberen linken Ecke des Bildfensters die Photonen -Funktion. Klicken Sie auf Control Panel Messfunktion ROIs zu messen . Kopieren und Einfügen der Ausgabetabelle mit Gesamtfluss (Photonen/s) in eine Software der Wahl, um die Daten weiter zu analysieren.
   5. Der Tageswert der ROI von jedem Mausklick auf ihren ROI-Wert gemessen am Tag 0 zu normalisieren.

(6) Gewebe isoliert und Verarbeitung.

1. Betäuben Sie Mäuse durch Injektion von Ketamin/Xylazin (wie in den Schritten 2,4-2,5 oder durch eingeatmete Isofluran (2 %) beschrieben. Atmung von Mäusen zu überwachen und eine Zehe Prise beschäftigen. Richtige Anesthetization zu bestätigen, wenn die Maus nicht reagiert, bis zu den Zehen Prise. Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Augen, Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
2. Retro-Orbital 100 µL von Luciferin zu injizieren (15 mg/mL) mit einer Insulin-Nadel. Warten Sie 2 Minuten.
3. Bild-Mäusen nach Schritte 4,22-4,24 aus diesem Protokoll.
4. Injizieren Sie ein weiterer 100 µL Luciferin Retro-Orbital mit einer Insulin-Nadel vor Euthanasie in das andere Auge aus Schritt 6.2.
5. Die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Ketamin/Xylazin einschläfern (siehe Punkt 2.4 für Details) gefolgt von zervikale Dislokation, wenn Mäuse in Tiefe Betäubung gemäß den Leitlinien von IACUC sind. Bestätigen Sie Euthanasie durch Palpation für Atmungsaktivität Durchführung.
6. Über sterile Chirurgische Schere machen einen Hautschnitt unter dem Brustbein. Öffnen Sie die Muskelschicht entlang der Membran mit einer Pinzette und chirurgische Scheren und setzen Sie der Brusthöhle durch Durchtrennung des Brustkorbs entweder auf die Seitenflächen der internen thorakalen Arterien zu vermeiden aus.
7. Durchspülen der Maus, indem man einen kleinen Schnitt in den rechten Vorhof des Herzens und Spritzen 5 mL PBS durch den linken Ventrikel. Die Farbe des Lungengewebes wird von rot bis blass rosa-weiß gehen, wenn die Durchblutung richtig gemacht wird.
8. Verbrauchsteuern Sie die Lungen aus der Brusthöhle sorgfältig durch die Speiseröhre oder des Herzens mit der Pinzette greifen. Vorsichtig ziehen Sie das Gewebe und verwenden Sie chirurgische Scheren, schneiden Sie vorsichtig Bindegewebes Punktion des Lungengewebes zu vermeiden. Bewahren Sie die Luftröhre möglichst viel für die Inflation der Lunge Atemwege in einem späteren Schritt.
9. Waschen der Lungenkrebs durch Eintauchen und wirbelnden Gewebe 3 Mal in einem 6-well-Platte mit 3 mL PBS entfernen überschüssiges Blut gefüllt.
10. Legen Sie die Lunge auf den Deckel von einer 6-well-Platte, und setzen Sie den Deckel, enthält das Gewebe in der Biolumineszenz Imager und erwerben Sie eine leuchtende Bild³⁰.
    Hinweis: Wir empfehlen die folgenden Einstellungen in der Systemsteuerung"Übernahme" zu wählen "Field Of View = A" und "Thema Höhe = 0,75 cm" und dann "Automatische Belichtung" zu vermeiden, gesättigte Bilder.
11. Verbrauchsteuern und Bild andere Organe, wie in Schritt 6,9-6.10, wo Metastasen von Lumineszenz, wie Gehirn, Leber, Nebennieren, Knochen, Lymphknoten, Niere oder Milz³¹identifiziert worden.
12. Durchspülen der Lungenkrebs mit 1 mL 4 % Paraformaldehyd durch die Nadel in die Luftröhre von der Maus. Die Lunge pumpt wenn gut PERFUNDIERTEN.
    Achtung: 4 % Paraformaldehyd ist ein giftiges, einer gesundheitlichen Gefährdung, GHS07 und GHS08.
13. Übertragen Sie die Lunge in eine 15 mL konisch mit 5 mL 4 % Paraformaldehyd.
14. Lungen oder anderen Geweben durch das Gewebe mit 4 % Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C in einem schütteln Gerät bei 30-50 u/min Inkubation zu beheben.
15. Lunge (oder anderen Geweben) in Paraffin oder optimale Arbeitstemperatur abhängig von der Anwendung³²zusammengesetzte einbetten.
    Hinweis: Paraffin ist die bevorzugte Methode, die Lunge Struktur zu bewahren und für Masson Trichrome und Hämatoxylin-Eosin-Färbung.

Ergebnisse

Um die Effizienz der LUAD Krebs Zelle Engraftment in die Lunge von Mäusen zu erhöhen, haben wir eine Protokoll, die zuerst die Atemwege mit Bleomycin, gefolgt von orthotopen Tumor Zelle Injektion (Abbildung 1) Voraussetzungen entwickelt. Wir bestätigen, dass selbst wenn in immungeschwächten Athymic Mäuse verabreicht, Bleomycin transiente Fibrose 14.Tag ausweislich Verlust der Atemwege Architektur und erhöhte Kollagen Deposition (Abb...

Diskussion

Markante klinische parallelen wurden zwischen Lungenkrebs und andere chronische Erkrankungen der Lunge³⁶dokumentiert. Insbesondere Patienten mit idiopathischer Lungenfibrose (IPF) haben eine erhöhte Vorliebe für Lungenkrebs zu erkranken, und der Verein ist unabhängig vom Rauchen Geschichte^37,38. IPF zeichnet sich durch die fortschreitende Zerstörung der Lunge Architektur und eingeschränkter Atemfunktion durch Ablagerung von ECM

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	Sigma	B5507-15UN	CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G	Fisher	1484121	Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)	Butler Schein	56344	To anesthetize mice
Xylazine	Butler Schein	33198	To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg	Cayman Chemical	10006661	Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand	Braintree Scientific	RIS-100	Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat	Roboz	RS-5111	For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml	BD / Fisher	309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver	Conair	-	To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades	Roboz	RS-5840SC
15 mL conical tube	BD / Fisher	352097
1.5 mL centrifuge tubes	USA SCIENTIFIC INC	1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI	Fisher	701350
Filter pipette tips (200 μL)	USA SCIENTIFIC INC	1120-8710
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
DMEM high glucose	Life Technologies	11965-092
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum USDA	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	Sigma	A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	15250-061
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap	Fisher / Corning	353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	For in vivo bioluminescence imaging
Living image software	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System	Perkin Elmer Health Sciences Inc	118918	For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)	BD / Fisher	BD328418	For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml	BD / Fisher	14-823-434	For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle	BD / Fisher	305111	For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde	VWR	43368-9M	CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL	17014411
Mayer's Hematoxylin	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%	Fisher	67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit	IMEB Inc	K7228	For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides	Fisher	1255015
6 well plate	Corning	C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit	ATCC	30-1012K
OCT Embedding compound	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62550-12	For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat	Leica	CM3050 S	To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X700
ImageJ	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.	-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice	Charles River	NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	Jackson Laboratories	5557
B6129SF1/J mice	Jackson Laboratories	101043
NIH-H2030 cells	ATCC	CRL-5914
368T1	generously provided by Monte Winslow (Standford University)	-
PC9 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-
H2030 BrM3 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-