Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule

Riepilogo

Descriviamo un metodo per migliorare in modo significativo orthotopic engraftment delle cellule di cancro del polmone nei polmoni murini di pre-condizionamento delle vie aeree con la ferita. Questo approccio può essere applicato anche per studiare le interazioni stroma all'interno del microambiente polmonare, la disseminazione metastatica, la co-morbidità, cancro del polmone, e per generare in modo più efficiente paziente derivato xenotrapianti.

Abstract

Cancro del polmone è una malattia refrattaria di trattamento mortale che è biologicamente eterogenea. Per capire e trattare efficacemente lo spettro clinico completo delle malignità toracica, sono necessari ulteriori modelli animali che possono ricapitolare fasi e sottotipi di cancro del polmone umano diversi. Modelli dell'allotrapianto o dello xenotrapianto sono versatili e permettono la quantificazione della capacità tumorigeniche in vivo, utilizzando cellule maligne di origine umana o murina. Tuttavia, metodi precedentemente descritti del engraftment di cellula del cancro del polmone sono stati effettuati in siti non-fisiologica, come il fianco dei topi, a causa della inefficienza di trapianto orthotopic delle cellule nei polmoni. In questo studio, descriviamo un metodo per migliorare engraftment orthotopic del polmone cancro delle cellule di pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con la bleomicina agente d'induzione di fibrosi. Come un esperimento di proof-of-concept, abbiamo applicato questo approccio per attecchire le cellule del tumore del sottotipo dell'adenocarcinoma del polmone, ottenuti da mouse o fonti umane, in vari ceppi di topi. Dimostriamo che ferendo le vie respiratorie con bleomicina prima dell'iniezione di cellule di tumore aumenta l'attecchimento delle cellule del tumore da 0-17% a 71-100%. Questo metodo ha migliorato significativamente, l'incidenza del tumore del polmone e la conseguenza successiva utilizzando diversi modelli e diversi ceppi di topi. Inoltre, le cellule tumorali del polmone engrafted diffondono dai polmoni in pertinenti organi distanti. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo che può essere utilizzato per stabilire e mantenere nuovi modelli ortotopici del cancro polmonare con limitare le quantità di cellule o di biospecimen e di valutare quantitativamente la capacità tumorigenica delle cellule di cancro del polmone in impostazioni fisiologicamente rilevanti .

Introduzione

Il cancro del polmone è la principale causa di cancro correlati morti in tutto il mondo¹. Pazienti con cancro polmonare soccombono alla fine dalla metastasi agli organi distanti, in particolare per il sistema nervoso centrale, fegato, ghiandole surrenali e ossa^2,3,4. Le malignità toraciche sono stati tradizionalmente classificate come carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) o non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC)⁵. NSCLC è il più frequentemente diagnosticato malignità e può essere suddiviso in diversi sottotipi istologici, compreso l'adenocarcinoma del polmone (LUAD) e del polmone a cellule squamose (LUSC)⁶. Analisi genomica dei tumori polmonari primari umani resecato ha rivelato che i tumori all'interno di un determinato istotipo anche possono esprimere diverse perturbazioni molecolari, ulteriormente contribuire alla loro divergenti progressione clinica e prognosi paziente di confondimento. La notevole eterogeneità dei tumori polmonari rappresenta una sfida significativa per la progettazione razionale, sperimentazione pre-clinica e implementazione di strategie terapeutiche efficaci. Di conseguenza, c'è una necessità di ampliare il repertorio di trattabili sperimentale del polmone cancro modelli per lo studio della diversa origine cellulare, sottotipi molecolari e fasi di questa malattia.

Vari approcci utilizzando modelli animali sono stati impiegati per lo studio del polmone cancro in vivo, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi a seconda delle domande biologiche di interesse. Modelli murini geneticamente (GEMM) possono indirizzare specifiche alterazioni genetiche in un tipo di cellula progenitore determinato, con conseguente tumori che il progresso all'interno di un ospite immunocompetente⁷. Mentre estremamente potente e clinicamente rilevanti, la morbosità di tumore latenza, variabilità e/o polmonare connessa con GEMM può essere proibitiva per determinate misure quantitative e l'individuazione di metastasi ritardata di fase in organi distanti⁸. Un approccio complementare è l'utilizzo di modelli di allotrapianto, per cui le cellule tumorali del polmone, ottenuti direttamente da un tumore di topo o derivato in primo luogo come linee cellulari stabilizzate nella cultura, sono re-introdotte in syngeneic padroni di casa. Analogamente, gli xenotrapianti di cancro del polmone sono stabiliti da linee cellulari umane o campioni tumorali derivate paziente. Gli xenotrapianti di linea cellulare umana o pazienti derivati xenotrapianti (PDXs) vengono di solito mantenuti in topi immunocompromessi e pertanto precludono completa sorveglianza immunitaria⁹. Nonostante questo inconveniente, che forniscono un viale per propagare limitare importi umano biospecimens e studio fondamentale in vivo delle proprietà cellule tumorali umane, che codificano per più complesse aberrazioni che i tumori GEMM.

Una proprietà utile di allotrapianti e gli xenotrapianti è che essi sono suscettibili di tradizionale e limitante i saggi di diluizione di cellulare, impiegati per quantificare la frequenza del tumore che inizia le cellule (TICs) all'interno di una popolazione di cellule maligne¹⁰. In questi esperimenti, un numero definito di cellule vengono iniettato per via sottocutanea al fianco degli animali e la frequenza dei TIC possa essere stimata in base tasso di prendere del tumore. I tumori sottocutanei, tuttavia, possono essere più hypoxic¹¹ e potrebbero non modellare i vincoli chiave fisiologici del microambiente del tumore del polmone. Consegna intratracheale di staminali epiteliali o cellule progenitrici nei polmoni dei topi è un metodo per studiare la rigenerazione polmonare e delle vie respiratorie della cellula formativa biologia¹². Tuttavia, il tasso di attecchimento da questa tecnica può essere relativamente basso, a meno che i polmoni sono sottoposti prima a forme fisiologiche di ferita, quali infezione virale^13,14. Supporto da cellule stromali infiammatorie e/o la rottura della membrana dello scantinato del polmone può migliorare la conservazione delle cellule trapiantate in nicchie di cellule staminali pertinenti nella vie aeree distali¹⁵. Fibrosi che inducono gli agenti può anche pre-condizione i polmoni di attecchimento di cellule pluripotenti indotte¹⁶ e cellule staminali mesenchimali¹⁷. Se altre forme simili di ferita della via aerea possono influenzare il tasso di attecchimento, capacità d'inizio del tumore e la conseguenza delle cellule di cancro del polmone ha ancora essere valutati sistematicamente.

In questo studio, descriviamo un metodo per aumentare l'efficienza di engraftment di orthotopic del polmone cancro delle cellule, di pre-condizionamento i polmoni dei topi con la ferita. LUAD si pone nelle vie aeree distali con un sottoinsieme significativo di questi cancri sviluppando un stroma fibrotico¹⁸ che spesso correla con la prognosi difficile¹⁹. Bleomicina, un peptide di ibrido naturale nonribosomal-polyketide, è stata ampiamente utilizzata per indurre fibrosi polmonare in topi²⁰. Instillazione della via aerea di bleomicina promuove in primo luogo epiteliale logoramento in alveoli e il reclutamento di cellule infiammatorie, tra cui i macrofagi, neutrofili e monociti²¹. Questa è seguita da tessuto che ritocca le vie aeree distali, la membrana dello scantinato riorganizzazione^22,23 e la deposizione di matrice extracellulare (ECM)²⁴. Gli effetti di un'iniezione singola bleomicina sono transitori, con fibrosi risoluzione dopo 30 giorni nella maggior parte dei studi²⁵. Utilizzando modelli dell'allotrapianto sia dello xenotrapianto, abbiamo testato se pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina potrebbe aumentare notevolmente il tasso di prendere delle cellule LUAD nei polmoni.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati secondo protocolli approvati dalla istituzionale Animal Care and uso Committee (IACUC) all'Università di Yale.

1. impostare / preparazione dei reagenti.

1. Bleomicina
   Attenzione: Basandosi sul sistema mondiale armonizzato (GHS) di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche, bleomicina è classificata come un pericolo per la salute GHS08.
   1. Preparare la bleomicina in una cappa chimica. Risospendere 15 U in 5 mL di soluzione salina sterile tamponata al fosfato (PBS).
   2. Aliquotare 100-200 µ l della soluzione in vetro fiale e congelarli a-20 ° C per un uso futuro. Etichettare correttamente i tubi con la data di risospensione. Utilizzare entro 6 mesi da questa data.
      Nota: Ogni ceppo del mouse ha una diversa sensibilità a bleomicina²⁶. Si raccomandano test differenti dosi di bleomicina per ogni sforzo del mouse. I ceppi di topi e dosi corrispondenti di bleomicina usati negli esperimenti rappresentativi sono elencate nella tabella 1.
2. Topi
   1. Acquistare il necessario per l'esperimento di topi e topi di attendere 7 giorni acclimatare prima iniezione. Eseguire infusioni in una cappa di biosicurezza. Trasferire gli animali ospitati in una camera di BSL2 non conforme ad una camera di BSL2 utilizzando le procedure standard istituzionali prima dell'infusione di bleomicina. Iniezione di topi in 6-8 settimane di età.
      Attenzione: Iniettare topi che seguono le linee guida istituzionali per agenti pericolosi, livello di biosicurezza 2 (BSL2) e IACUC approvazione.
      Nota: Topi acquistati per gli esperimenti rappresentativi sono elencati nella Tabella materiali. Sono stati utilizzati solo i topi maschi.
3. Linee cellulari di cancro polmonare
   1. Linee cellulari di cultura voluta nei loro rispettivi mezzi. Prima iniezioni, eseguire breve profilo del DNA ripetizione in tandem o dei test genetici per garantire l'identificazione della linea adeguata delle cellule. Per facilitare in vivo ed ex vivo imaging, infettare linee cellulari con un lentivirus esprimendo la timidina chinasi, la proteina fluorescente verde (GFP) e la luciferasi fusione reporter²⁷e ordinare le cellule positive reporter di fluorescenza attivato ordinano (FACS) prima dell'attecchimento delle cellule. Linee per micoplasma prova ogni 6 mesi.
      1. Cultura della linea cellulare umana del H2030 come consigliato dal produttore l'uso medio di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina-streptomicina e anfotericina b.
      2. Cultura 368T1 linea cellulare murina (derivato da un mouse Kras^G12D; p53^{- / -} ) utilizzo medio dell'Aquila per volta di Dulbecco (DMEM) con 10% FBS, penicillina-streptomicina e anfotericina b.
      3. Cultura PC9 linea cellulare di cancro umano utilizzando RPMI con 10% FBS, penicillina-streptomicina e anfotericina b.

2. trattamento della bleomicina

1. Prevede di iniettare vari topi con bleomicina 14 giorni prima del engraftment delle cellule del tumore.
2. Scongelare il magazzino di bleomicina sul ghiaccio 2 h prima dell'iniezione.
3. Una volta scongelato, diluire bleomicina fino alla concentrazione di lavoro desiderata (0,02 µ l U/50 o 0.005 U/50 µ l) e tenerlo sul ghiaccio.
   Nota: Concentrazione di bleomicina dipende il ceppo del mouse utilizzato per gli esperimenti (tabella 1). Titolazione di bleomicina in topi deve essere eseguita per determinare la dose ottimale.
4. Preparare l'anestesia diluendo ketamina e xilazina ad una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente, utilizzando un ago di siringa e 27 G di 1 mL, anestetizzare ogni mouse iniettando soluzione intraperitonealmente chetamina/xilazina a 100/10 mg/kg rispettivamente.
5. Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
6. Posto 1 il mouse alla volta su una piattaforma di intubazione per impiccagione suoi denti anteriori con le spalle contro la piattaforma.
7. Illuminare la parte superiore del torace utilizzando un illuminatore a fibre ottiche per aiutare con visualizzazione della trachea. Aprire la bocca del mouse ed estrarre delicatamente la linguetta con pinze sterili piatte.
8. Utilizzare un catetere endovenoso senza l'ago per evitare di bloccare la respirazione. Posizione il catetere sopra la luce bianca emessa dall'apertura della trachea.
9. Inserire il catetere nella trachea fino a cima del catetere raggiunge i denti anteriori. Verificare l'esatto posizionamento del catetere nella trachea visualizzando la luce bianca brillante attraverso l'apertura del catetere in bocca.
10. Usando una pipetta, dispensare 50 µ l di bleomicina o veicolo (PBS) direttamente nel catetere per garantire che l'intero volume viene inalato. Eseguire questo passaggio in condizioni di sterilità.
11. Se il catetere è stato inserito correttamente, il mouse sarà immediatamente inalare il contenuto del catetere. Attendere qualche secondo fino a quando l'intero volume viaggia giù il catetere. Quindi estrarre il catetere dalla trachea e smaltire in soluzione di candeggina al 10%.
    Nota: Il tempo medio per topo di passaggi 2.7-2.11 è circa 5 min.
12. Se il mouse non è l'inalazione del liquido, monitorare la respirazione attentamente e regolare la posizione del catetere. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente il catetere e lasciare il mouse per riprendere la respirazione normalmente prima di reinserire il catetere.
13. Posizionare il mouse iniettato su un rilievo di riscaldamento approvato IACUC sulla schiena su una superficie piana per il recupero. L'intera procedura porterà 10 min per topo. Non restituiscono un animale che ha subito l'iniezione per la compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato.
14. Posto una carta "Chimici pericolosi in uso" sulla gabbia per 24 h.

3. monitoraggio topi post-intubazione

1. Monitorare i topi per distress respiratorio subito dopo intubazione e poi ogni 15 minuti fino a quando i topi si sveglia dall'anestesia. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
2. Iniettare il ketoprofene (5 mg/kg) per via intraperitoneale per alleviare il dolore.
3. Esaminare l'intubazione di post di topi 24 h e 3 volte a settimana per eventuali segni di morbosità.
4. Tenere traccia della data della procedura, identificazione degli animali, tipo di procedura, tipo di anestetiche e post-operatorie monitoraggio osservazioni con volte.
5. Monitorare i topi per perdita di peso, difficoltà respiratoria, le anomalie del comportamento e un punteggio della condizione corporea < 2 (segmentazione della colonna vertebrale dorsale/evidente ossa pelviche sono palpabili) bi-settimanale a seguito di iniezione di bleomicina.
6. Eutanasia di topi sotto l'afflizione respiratoria o topi che hanno sperimentato la perdita del 15% della massa corporea di CO₂ o di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.

4. engraftment delle linee cellulari di Adenocarcinoma polmonare.

Nota: Eseguire engraftment delle cellule 14 giorni dopo l'iniezione di bleomicina (punto 2.1).

1. Consentire alle cellule di crescere in beute² 75cm indisturbati per 3 giorni prima del giorno dell'iniezione con media corrispondente come indicato al punto 1.3.
   Nota: Dovrebbero essere 80% confluenti al giorno dell'iniezione (che corrisponde a 2-3 x 10⁶ in ciascuna beuta, a seconda della linea cellulare).
2. Lavare le cellule che crescono su 75 cm² boccette con 5 mL di PBS a temperatura ambiente.
3. Aspirare la PBS e aggiungere 1,5 mL di tripsina alle celle e incubare le cellule a 37 ° C fino a staccano le cellule (in genere 2-5 min).
   Nota: Si consiglia di consultare ogni 2 min per distacco cellulare dalla plastica di semplice visualizzazione della parte inferiore del pallone o sotto un microscopio chiaro. Non superare i 5 minuti di incubazione con tripsina.
4. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di supporto contenente 10% FBS (stesso supporto come passo 4.1). Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare esso a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente.
5. Aspirare i media e risospendere il pellet cellulare in 5 mL di PBS per lavare le cellule. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 min a temperatura ambiente per agglomerare le cellule. Ripetere questa 1 volta.
6. Aspirare il PBS e risospendere il pellet in 1,5 mL di PBS per fiaschetta.
7. Mescolare 50 µ l di miscela delle cellule con 50 µ l di blu di trypan e contare le celle utilizzando un Cell Counter/emocitometro camera²⁸.
8. Preparare la sospensione cellulare diluendo le cellule in PBS per iniettare 1 x 10⁵ celle (o altro importo indicato) in 50 µ l per topo. Mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione.
   Nota: Preparare almeno due volte più cellule per iniezione per evitare l'esaurimento di sospensione cellulare.
9. Preparare l'anestesia diluendo ketamina e xilazina ad una concentrazione finale di 10 mg/mL e 1 mg/mL, rispettivamente, utilizzando un ago di siringa e 27 G di 1 mL, anestetizzare ogni mouse iniettando soluzione intraperitonealmente chetamina/xilazina a 100/10 mg/kg rispettivamente.
10. Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
11. Posto 1 il mouse alla volta su una piattaforma di intubazione per impiccagione suoi denti anteriori con le spalle contro la piattaforma.
12. Illuminare la parte superiore del torace utilizzando un illuminatore a fibre ottiche per aiutare con visualizzazione della trachea.
13. Risospendere le cellule delicatamente utilizzando una pipetta p200 per assicurarsi che non formano grumi. Aprire la bocca del mouse ed estrarre delicatamente la linguetta con pinze sterili piatte.
14. Utilizzare un catetere endovenoso con l'ago rimosso per evitare di ostacolare la respirazione. Posizione il catetere sopra la luce bianca emessa dall'apertura della trachea.
15. Inserire il catetere nella trachea fino a cima del catetere raggiunge i denti anteriori. Verificare l'esatto posizionamento del catetere nella trachea visualizzando la luce bianca brillante attraverso l'apertura del catetere in bocca.
16. Usando una pipetta, dispensare 50 µ l di cellule direttamente nel catetere per garantire che l'intero volume viene inalato. Eseguire questo passaggio in condizioni di sterilità.
    Nota: Se il catetere è stato inserito correttamente, il mouse immediatamente inalare il contenuto del catetere.
17. Attendere qualche secondo fino a quando l'intero volume viaggia giù il catetere, quindi rimuovere il catetere dalla trachea e smaltire in soluzione di candeggina al 10%.
18. Se il mouse non è l'inalazione del liquido, monitorare la respirazione attentamente e regolare la posizione del catetere. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente il catetere e lasciare il mouse per riprendere la respirazione normalmente prima di reinserire il catetere.
    Nota: Il tempo medio per topo di passaggi 4,11-4.18 è circa 5 min.
19. Posizionare il mouse iniettato su un rilievo di riscaldamento approvato IACUC sulla schiena su una superficie piana per il recupero.
    Nota: L'intera procedura richiederà 10 min per topo. Non restituiscono un animale che ha subito l'iniezione per la compagnia di altri animali fino a quando completamente recuperato.
20. Radere la zona intera nervatura entrambi ventralmente e dorsalmente utilizzando un rasoio elettrico prima di formazione immagine di B6129SF1/J e altri ceppi di topi con i capelli scuri.
21. 2-3 minuti dopo l'iniezione delle cellule, iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Si alternano l'occhio utilizzato per l'iniezione ogni sessione di imaging.
22. Dopo almeno 2 min, inserire fino a 5 topi in un imager di bioluminescenza animale in posizione di decubito dorsale e acquisire un'immagine ventrale con luminescenza impostazioni²⁹.
23. Sotto il pannello di controllo è possibile regolare le impostazioni di risoluzione e sensibilità per misurare la luminescenza di una linea cellulare dato. Per la maggior parte delle applicazioni, avviare con 3 min (o "Auto" se saturi), binning = medio (4), F/Stop = 1, campo di vista = D, soggetto altezza = 1.50.
    Nota: Se l'iniezione viene eseguita correttamente, viene rilevato segnale di luminescenza nella zona superiore del torace, in un polmone o di entrambi i polmoni.
24. Topi di vibrazione sulla posizione di decubito sternale e acquisire un'immagine dorsale come sopra.
    Nota: Se l'iniezione di cellule non viene eseguita correttamente, le cellule possono cluster all'ingresso della trachea o del collo.
25. Iniettare ketoprofene 5 mg/kg per via intraperitoneale per alleviare il dolore.
26. Riportare i topi alla loro gabbia e mettere una carta "BSL-2 agente in uso" sulla gabbia.
27. Monitorare topi per distress respiratorio immediatamente dopo l'intubazione e poi ogni 15 minuti fino a quando i topi si sveglia dall'anestesia. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
28. Esaminare l'intubazione di post di topi 24 h e tre volte a settimana per eventuali segni di morbosità.
29. Mantenere record nel giornale di bordo della data della procedura, identificazione degli animali, tipo di procedura, tipo di anestetiche e post-operatorie monitoraggio osservazioni e volte.
30. Monitorare i topi per perdita di peso, difficoltà respiratoria, le anomalie del comportamento e un punteggio della condizione corporea < 2 (segmentazione della colonna vertebrale dorsale/evidente ossa pelviche sono palpabili) bi-settimanale a seguito di inoculazione di bleomicina.
    Nota: I topi con i tumori del polmone possono esibire irritazione delle vie respiratorie, perdita di peso, cachessia e morte.
31. Eutanasia di topi sotto l'afflizione respiratoria o topi che hanno sperimentato la perdita del 15% della massa corporea di CO₂ o di chetamina/xilazina seguita da dislocazione cervicale se raccolta tessuti. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.

5. monitoraggio della crescita del tumore di bioluminescenza Imaging

1. Formazione immagine di ripetizione dei topi a post-attecchimento giorno 3 e settimanale da allora in poi.
2. Anestetizzare topi iniettando chetamina/xilazina (come descritto nei passaggi 2.4-2.5) o da inalazione isoflurane (2%). Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta per confermare la corretta amputate. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
3. Radere la zona intera nervatura entrambi ventralmente e dorsalmente utilizzando un rasoio elettrico prima di formazione immagine di B6129SF1/J e altri ceppi di topi con i capelli scuri.
4. Una volta che i topi sono sotto anestesia, iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Aspettare 2 minuti Alternate l'occhio utilizzato per l'iniezione ogni sessione di imaging.
5. Posizionare i topi nel riproduttore d'immagini e acquisire immagini dorsale e ventrale, come descritto nei passaggi 4,22-4,24.
6. Topi posto nuovamente dentro la gabbia dopo formazione immagine, sulla loro parte posteriore su una superficie piana per il recupero.
   Nota: L'intera procedura richiederà 5 min per ogni gruppo di 5 topi. Non lasciare incustodito topi fino a quando essi hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
7. Analizzare le immagini utilizzando il software di analisi di imager/bioluminescenza.
   1. Selezionare le immagini appropriate e caricarli come un gruppo del software di analisi di bioluminescenza.
   2. Fare clic su strumento ROI | Piazza per aggiungere un'area quadrata di interesse (ROI). Posto il ROI sulla zona superiore del torace, che ricopre l'immagine di intero polmone. Ripetere questa operazione per ogni immagine del mouse.
   3. Fare clic destro e selezionare copia tutte le ROI funzione per applicare il ROI stesso a tutte le immagini del gruppo e la loro posizione nella parte superiore del torace dei topi, viste sia ventrale e dorsale.
   4. In alto a sinistra della finestra immagine, selezionare la funzione di fotoni . Fare clic sulla funzione di pannello di controllo misura per misurare il ROIs. Copiare e incollare la tabella di output contenente il flusso totale (fotoni/s) in un software di scelta per analizzare ulteriormente i dati.
   5. Normalizzare il valore giornaliero di ROI di ogni topo al suo valore ROI misurato il giorno 0.

6. i tessuti isolamento e trattamento.

1. Anestetizzare topi iniettando chetamina/xilazina (come descritto nei passaggi 2.4-2.5 o da inalazione isoflurane (2%). Monitorare la respirazione dei topi e impiegano un pizzico di punta. Confermare il corretto amputate quando il mouse non risponde alla punta pizzico. Applicare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
2. Iniettare 100 µ l di luciferina retrò-orbitally (15 mg/mL) utilizzando un ago da insulina. Attendere 2 min.
3. Topi di immagine seguendo passaggi 4,22-4,24 dal presente protocollo.
4. Iniettare l'altro occhio dal punto 6.2 un altro 100 µ l di luciferina retrò-orbitally utilizzando un ago da insulina prima dell'eutanasia.
5. Eutanasia i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina (Vedi punto 2.4 per dettagli) seguita da dislocazione cervicale se i topi sono sotto anestesia profonda conformemente agli orientamenti forniti da IACUC. Confermare l'eutanasia conducendo palpazione per l'attività respiratoria.
6. Usando le forbici chirurgiche sterili fare un'incisione della pelle sotto lo sterno. Aprire lo strato del muscolo lungo il diaframma utilizzando pinze e forbici chirurgiche ed esporre la cavità toracica da taglio attraverso la gabbia toracica su entrambi i lati evitando le arterie toraciche interne.
7. Irrorare il mouse facendo una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e iniettare 5 mL di PBS attraverso il ventricolo sinistro. Il colore del tessuto polmonare andrà dal rosso al bianco-rosa pallido se l'aspersione di sangue è fatto correttamente.
8. Asportare i polmoni dalla cavità toracica attentamente afferrando l'esofago o il cuore con il forcipe. Delicatamente tirare il tessuto e forbici per tagliare accuratamente connettivo evitando puntura del tessuto polmonare. Preservare la trachea per quanto possibile per l'inflazione delle vie aeree del polmone in un passaggio successivo.
9. Lavare il polmone immergendo e vorticoso il tessuto 3 volte in un piatto ben 6 riempito con 3 mL di PBS per rimuovere il sangue in eccesso.
10. Posizionare il polmone sul coperchio di una piastra ben 6 e mettere il coperchio che contiene il tessuto nell'imager bioluminescente e acquisire un'immagine luminescente³⁰.
    Nota: Si consiglia di selezionare le seguenti impostazioni dal "pannello di controllo di acquisizione" "campo di vista = A" e "soggetto altezza = 0,75 cm" e quindi "esposizione automatica" per evitare di ottenere immagini sature.
11. Accise e immagine altri organi, come fatto nel passaggio 6.9-6.10, dove le metastasi sono state individuate dalla luminescenza, come fegato, cervello, rene o milza³¹, surrenale, osso, i linfonodi.
12. Irrorare il polmone con 1 mL di paraformaldeide al 4% inserendo l'ago nella trachea del mouse. I polmoni si gonfiano se ben perfuso.
    Attenzione: paraformaldeide al 4% è un tossico, un salute GHS07 e GHS08 di pericolo.
13. Trasferire i polmoni in un conico da 15 mL con 5 mL di paraformaldeide al 4%.
14. Difficoltà i polmoni o altri tessuti incubando il tessuto con paraformaldeide al 4% durante la notte a 4 ° C in un dispositivo di agitazione a 30-50 giri/min.
15. Incorporare i polmoni (o altri tessuti) in paraffina o temperatura di taglio ottimale composto a seconda l' applicazione³².
    Nota: Paraffina è il metodo preferito di conservare la struttura del polmone e per Masson Trichrome ed ematossilina-eosina.

Risultati

Per aumentare l'efficienza di engraftment di cellula del cancro LUAD nei polmoni dei topi, abbiamo sviluppato un protocollo che in primo luogo pre-condizioni delle vie respiratorie con bleomicina seguita da iniezione di orthotopic del tumore delle cellule (Figura 1). Abbiamo confermato che anche quando amministrato in topi immunocompromessi athymic, bleomicina transitoria fibrosi indotta da giorno 14 come evidenziato dalla perdita dell'architettura delle vie ...

Discussione

Analogie sorprendenti cliniche sono state documentate tra cancro ai polmoni e altre malattie croniche del polmone³⁶. In particolare, i pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) hanno una maggiore predilezione per sviluppare il cancro del polmone, e questa associazione è indipendente da fumo storia^37,38. IPF è caratterizzata dalla distruzione progressiva dell'architettura del polmone e la funzione respiratoria alterata attraverso de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleomycin	Sigma	B5507-15UN	CAUTION Health hazard GHS08
Exel Catheter 24G	Fisher	1484121	Remove needle. For intratracheal injection
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)	Butler Schein	56344	To anesthetize mice
Xylazine	Butler Schein	33198	To anesthetize mice
Ketoprofen, 5,000 mg	Cayman Chemical	10006661	Analgesic
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment	BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC	8897	To prevent eye dryness while under anesthesia
D-Luciferin powder	Perkin Elmer Health Sciences Inc	122799	For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light
Rodent Intubation stand	Braintree Scientific	RIS-100	Recommended stand for intratracheal injection
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150	DOLAN-JENNER INDUSTRIES	MI-150 / EEG2823M	To illuminate and visualize trachea
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat	Roboz	RS-5111	For intratracheal injection
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml	BD / Fisher	309646
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver	Conair	-	To shave mice
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades	Roboz	RS-5840SC
15 mL conical tube	BD / Fisher	352097
1.5 mL centrifuge tubes	USA SCIENTIFIC INC	1615-5500
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI	Fisher	701350
Filter pipette tips (200 μL)	USA SCIENTIFIC INC	1120-8710
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	14190-144
0.25% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056
DMEM high glucose	Life Technologies	11965-092
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum USDA	Life Technologies	10437-028
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Amphotericin B	Sigma	A2942-20ML
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	15250-061
Countess Automated Cell Counter	Life Technologies	AMQAX1000
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap	Fisher / Corning	353135
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence	Perkin Elmer Health Sciences Inc	124262	For in vivo bioluminescence imaging
Living image software	Perkin Elmer Health Sciences Inc	128113	For in vivo bioluminescence analysis
XGI-8 Gas Anesthesia System	Perkin Elmer Health Sciences Inc	118918	For Isoflurane anesthesia
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in)	BD / Fisher	BD328418	For retro-orbital luciferin injection
Syringe 1ml	BD / Fisher	14-823-434	For intraperitoneal injections
26 G x 1/2 in. needle	BD / Fisher	305111	For intraperitoneal injections
4% Paraformaldehyde	VWR	43368-9M	CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+	METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL	17014411
Mayer's Hematoxylin	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	517-28-2
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57%	Fisher	67-63-0
Masson Trichrome Stain Kit	IMEB Inc	K7228	For masson trichrome stain to visualize collagen
Superfrost plus glass slides	Fisher	1255015
6 well plate	Corning	C3516
Universal Mycoplasma Detection Kit	ATCC	30-1012K
OCT Embedding compound	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	62550-12	For embedding tissue for frozen sections
Leica CM3050 S Research Cryostat	Leica	CM3050 S	To section tissue for staining analysis
Keyence All-in One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X700
ImageJ	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.	-
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice	Charles River	NIH-553
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice	Jackson Laboratories	5557
B6129SF1/J mice	Jackson Laboratories	101043
NIH-H2030 cells	ATCC	CRL-5914
368T1	generously provided by Monte Winslow (Standford University)	-
PC9 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-
H2030 BrM3 cells	Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62	-