Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نفذت هذه الدراسة تسلسل الجينوم الكامل لتحليل الطفرات في الجينات منح المقاومة للعقاقير المضادة للفطور في المبيضات صناعي. كانت متتابعة يعزل صناعي جيم- مقاومة اتشينوكاندينس، الآزولات و 5-فلوسيتوسيني، لتوضيح المنهجية. التشكيلات الجانبية للقابلية يعزل يرتبط بوجود أو عدم وجود أنماط محددة من الطفرة في الجينات.

Abstract

ويمكن اكتساب صناعي المبيضات سرعة الطفرات التي تؤدي إلى مقاومة المخدرات، لا سيما الآزولات واتشينوكاندينس. تحديد الطفرات الوراثية أمر أساسي، كما كشف المقاومة في المختبر يمكن غالباً ما يرتبط بفشل السريرية. قمنا بفحص جدوى استخدام تسلسل الجينوم كله (WGS) لتحليل المجين على نطاق المنظومة لمقاومة العقاقير المضادة للفطور في جيم-صناعي. والهدف كان المساعدون توريكوجنيزي والحواجز في الأفرقة العاملة لتنفيذ وقياس فعاليته. وتلخص هذه الورقة في نقاط التفتيش الرئيسية في مجال مراقبة الجودة والمكونات الأساسية للأفرقة العاملة لمنهجية التحقيق البصمات الجينية المرتبطة بتخفيض التعرض للعوامل المضادة للفطور. وتقدر أيضا دقة تحليل البيانات ودورة حول الوقت للاختبار.

قابلية المظهرية من 12 السريرية، وواحد من سلالة ATCC من صناعي جيم- مصممة عن طريق اختبار قابلية المضادة للفطور. عزل هذه شملت ثلاثة أزواج من المرضى الثلاثة، التي وضعت ارتفاع تركيزات العقاقير المثبطة الدنيا. في اثنين من أزواج، عزل الثاني لكل زوج وضع مقاومة اتشينوكاندينس. عزل ثاني زوج الثالثة وضعت المقاومة إلى 5-فلوسيتوسيني. المتبقية المؤلفة من عرضه ومقاومة الازول يعزل. وتأكدت النوكليوتيدات واحدة مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات المرتبطة بالمقاومة اتشينوكاندين والازول فلوسيتوسيني 5 في يعزل مقاومة من خلال الأفرقة العاملة لاستخدام تسلسل الجيل القادم.  بطانات عدم مرادفة في مقاومة الفطريات وتم تحديد الجينات مثل FKS1، FKS2، CgPDR1، CgCDR1 ، و FCY2 . وعموما، في متوسط 98% القراءات WGS من يعزل صناعي جيم- المعينة للجينوم مرجع مع تغطية حوالي 75-fold عمق القراءة. المدة الزمنية والتكلفة كانت مماثلة سانغر التسلسل.

وفي الختام، WGS صناعي جيم- كان ممكناً في الكشف عن الطفرات الجينية سريرياً هامة تشارك في المقاومة لفئات مختلفة من العقاقير المضادة للفطور دون الحاجة إلى عدة ردود فعل تسلسل بكر/الحمض النووي. وهذا يمثل خطوة إيجابية نحو إنشاء قدرة الأفرقة العاملة في المختبرات السريرية للكشف المتزامن استبدالات تخول المقاومة المضادة للفطور.

Introduction

هو صناعي المبيضات ممرض مصادفة على نحو متزايد بأهمية الأنواع الذي يسلك المقاومة الآزولات وكذلك في الآونة الأخيرة،2،1،اتشينوكاندينس3. على عكس مثنوية المبيضة، فرداني جينوم صناعي جيم- قد تسمح لها بالحصول على الطفرات وتطوير المقاومة للعقاقير المتعددة بسهولة أكبر. وأفادت المقاومة المشارك فئات المخدرات على حد سواء كان أيضا4. ومن ثم، التقييم المبكر لقابلية المضادة للفطور والكشف عن المقاومة للعقاقير في جيم-صناعي أمر حاسم للعلاج الصحيح، وهادفة، وكذلك كما هو الحال في سياق الإشراف مضاد للحد من العوامل المحركة لمقاومة مضادات الميكروبات1 , 5 , 6-إنشاء سير عمل فعالة لسرعة الكشف عن وجود توكيدي الطفرات المرتبطة بالمؤشرات الحيوية المقاومة في مقاومة يعزل سيتم أيضا إلى المساعدة على تحسين وصف المقررات والنتائج السريرية.

وعادة ما يتم تقييم القابلية المضادة للفطور بقياس تركيز الحد الأدنى المثبطة (MIC) الذي يعرف بأنه أدنى تركيز المخدرات التي ينتج عنها انخفاض كبير في نمو الكائنات الدقيقة المقارنة مع نمو خال من المخدرات عنصر التحكم. السريرية ومعهد المعايير المختبرية (كلسي) واللجنة الأوروبية على الميكروبات قابلية الاختبار (يوكاست) قد توحيد قابلية طرق الاختبار من أجل البت في هيئة التصنيع العسكري أكثر دقة واتساقا7، 8. بيد الفائدة من الأدوية المضادة للفطور هيئة التصنيع العسكري لا تزال محدودة لا سيما بالنسبة اتشينوكاندينس، خاصة فيما يتعلق بإجراء مقارنات المختبرات فيها منهجيات مختلفة والشروط المستخدمة9. وهناك أيضا ترابط غير مؤكد من البلدان المتوسطة الدخل مع الاستجابة للعلاج اتشينوكاندين وعدم القدرة على التمييز بين WT (أو عرضه) المعزولة من تلك التي تأوي FKS الطفرات (سلالات مقاومة اتشينوكاندين)10،11. وعلى الرغم من توافر تقارير إتمام المشروعات وحيدة الجين توكيدي وسانجر تسلسل علامات المقاومة المضادة للفطور، تحقيق النتائج غالباً ما يتأخر الواجب لعدم الكشف عن واحد من علامات المقاومة متعددة5،12. ومن ثم، المتزامنة الكشف عن الطفرات المقاومة منح في مواقع مختلفة في الجينوم، مكنت من التحليل القائم على تسلسل الجينوم كله، يوفر مزايا هامة أكثر من النهج الحالي.

الجينوم كله التسلسل (WGS) نفذت بنجاح لتتبع انتقال المرض خلال تفشي فضلا عن نهج لمقاومة المخدرات وتقييم المخاطر على نطاق الجينوم الاختبار في البكتيريا والفيروسات13. التطورات الحديثة في تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي جعلت تسلسل الجينوم كله (WGS) من مسببات الأمراض في عملي سريرياً بدوره حولها-وقت مجدية تقنيا واقتصادياً على حد سواء. تسلسل الحمض النووي يوفر مزايا هامة على أساليب أخرى لتحديد العوامل الممرضة وتوصيف المستخدمة في علم الأحياء المجهرية المختبرات14،،من1516. أولاً، أنه يوفر حلاً عالمياً مع ارتفاع الإنتاجية والسرعة والجودة. التسلسل يمكن تطبيقها على أي من الكائنات الحية الدقيقة ويسمح وفورات الحجم في المختبرات المحلية أو الإقليمية. وثانيا، أنها تنتج البيانات في تنسيق 'المستقبل واقية' قابلة للمقارنة على المستويين الوطني والدولي. وأخيراً، زادت الفائدة المحتملة للأفرقة العاملة في مجال الطب بالنمو السريع لقواعد البيانات العامة التي تحتوي على مرجع جينومات، التي يمكن ربطها بقواعد بيانات معادلة التي تحتوي على بيانات تعريف إضافية السريرية والوبائية17 ،18.

وقد أثبتت الدراسات الأخيرة لفائدة من الأفرقة العاملة لتحديد علامات المقاومة المضادة للفطور من يعزل السريرية من المبيضات spp. 10 , 19 , 20-وهذا في الغالب بسبب توافر التعاقب benchtop الفائق والمعلوماتية أنشئت خطوط الأنابيب وانخفاض التكلفة لتسلسل21،22. الاستفادة من الأفرقة العاملة للفطريات عبر سانغر التسلسل WGS يسمح تسلسل الجينوم متعددة على تشغيل واحد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحديد الطفرات الرواية في أهداف المخدرات WGS الجينومات المبيضات ، تتبع التطور الجيني، وظهور أنواع التسلسل ذات الصلة سريرياً20،،من2223. الأهم من ذلك، في حالات مقاومة عصيات الجوهرية، WGS يمكن أن تساعد في الكشف المبكر عن الطفرات المقاومة تمنح قبل العلاج التحديد22،24.

هنا، قمنا بدراسة الجدوى للأفرقة العاملة لتمكين الكشف عن الطفرات المرتبطة بالعقاقير المقاومة لفئات مختلفة من العوامل المضادة للفطور. نقدم منهجية لتنفيذ WGS من منظوري مختبر علم الفطريات التشخيصية والمستخدم النهائي. وأدرجنا في هذا التحليل عزل ثلاثة أزواج مثقف من ثلاث حالات سريرية منفصلة في التي في المختبر وضعت المقاومة اتشينوكاندينس و 5-فلوسيتوسيني مع مرور الوقت بعد العلاج المضادة للفطور.

Protocol

وكان لا الموافقة الأخلاقية المطلوبة لهذه الدراسة.

1-إعداد ثقافة فرعية والعدوى صناعي المبيضات

  1. حدد فريق يعزل C.glabrata من الدراسة التي ينبغي أن تشمل أيضا واحد على الأقل صناعي جيم- أمريكية نوع الثقافة جمع (ATCC) مع نمط حساسية معروفة.
  2. ثقافة فرعية عزل لمس مستعمرة واحدة باستخدام حلقة بلاستيك القابل للتصرف عقيمة و streaking على سكر العنب أجار سابوراود (حزب العمل الديمقراطي) لوحة8.
  3. احتضان لوحة حزب العمل الديمقراطي ح 24-48 في 35 درجة مئوية لثقافة نقية من عزل مع نمو جيد.

2-تحديد قابلية مضاد فطري

  1. استخدام حلقة بلاستيك القابل للتصرف عقيمة لاختيار المستعمرات 4-5 من قطر 1 ملم تقريبا من سوبكولتوريد طازجة صناعي جيم- عزل على لوح حزب العمل الديمقراطي. ريسوسبيند في 3 مل ماء المقطر المعقم. مزيج جيد من قبل بيبيتينج لطيف للحصول على تعليق موحدة.
  2. ضبط كثافة الخلية إلى 0.5 ماكفارلاند الذي يساوي 1 × 106 إلى 5 × 106 خلايا/مل تستخدم الكثافة 8.
  3. قم بإجراء اختبار قابلية استخدام التحليل التجاري (انظر الجدول للمواد والمواد الكاشفة) على جميع صناعي جيم- يعزل اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تفسير قابلية عزل استناداً إلى المؤشرات الناتجة من الأدوية المضادة للفطور ووفقا للمبادئ التوجيهية كلسي وإعداد التقرير (الجدول 1)8.

3. الجينوم استخراج الحمض النووي للتسلسل

  1. ريسوسبيند لوبفول مستعمرات من صفيحة التعطيل الذاتي المزروعة حديثا في 300 ميليلتر من 50 مم يدتا في أنبوب 1.5 مل.
  2. إضافة 40 ميليلتر من زيمولياسي (10 مغ/مل) إلى تعليق، ولطف بيبيت 5 مرات حتى يتم تعليق موحدة.
  3. احتضان العينة في 37 درجة مئوية ح 1-2 لهضم جدار الخلية. تبريد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. الطرد المركزي من التعليق في 14,000 ز × 2 دقيقة ثم قم بإزالة المادة طافية بعناية.
  5. استخراج الحمض النووي الحمض النووي استخراج مجموعة المبادئ التوجيهية (انظر الجدول للمواد) التالية.
  6. ريسوسبيند استخراج الحمض النووي بيليه في 50 ميليلتر من 10 ملم تريس المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.5-8.5) بدلاً من المخزن المؤقت شطف المنصوص عليها في هذه المجموعة.
  7. فحص نقاء الحمض النووي بقياس الكثافة البصرية (O.D) في 260/280 nm25.

4-المجينية الحمض النووي الكمي

  1. إعداد 1 × تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت المقدمة في أدوات المقايسة استناداً إلى المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة للمقايسة الأسفار (انظر الجدول للمواد).
  2. تمييع عينة الحمض النووي بإضافة 2 ميليلتر ميليلتر 98 1 × TE الإنزيم المخزن المؤقت (الحجم النهائي من 100 ميليلتر، إضعاف عامل 01:50) في لوحة جيدا 96 المتاح. يمكن إجراء هذه الخطوة إضعاف أما يدوياً باستخدام ماصة الأقنية أو بسائل الآلي التعامل مع محطة العمل.
  3. إعداد مجموعة المعايير بتمييع لامدا الحمض النووي (100 ميكروغرام/مل) في أدوات التحليل الفلورية (الجدول 2) وتتضمن قياس جنبا إلى جنب مع عينات.
  4. إضافة 100 ميليلتر من صبغة الفلورسنت إلى 100 ميليلتر المخفف عينات الحمض النووي، ومعايير لرد الفعل. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
  5. قياس الأسفار من جميع العينات استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة.
  6. ارسم المنحنى القياسي استخدام قراءات الأسفار وحساب تركيز الأصلي من عينات الحمض النووي.
  7. تحديد حجم الحمض النووي والعازلة تريس 10 مم (درجة الحموضة 8) المراد إضافتها إلى ضبط تركيز الحمض النووي إلى 0.2 نانوغرام/ميليلتر.
  8. إجراء تخفيف الحمض النووي باستخدام سائل الآلي التعامل مع محطة العمل. ويمكن تحقيق هذه الخطوة أيضا بدليل بيبيتينج.

5. إعداد مكتبة الحمض الخلوي الصبغي

ملاحظة: إعداد مكتبة وتسلسل أجرى عقب الشركة المصنعة للبروتوكولات والمبادئ التوجيهية التي قدمتها شركة (الشكل 1أ) (انظر الجدول للمواد).

  1. تاجمينتاتيون وبكر التضخيم
    1. قم بتسمية لوحة الجدار رقيقة واقية 96-بئر جديدة.
    2. إضافة 5 ميليلتر من إدخال كمية الحمض النووي في 0.2 نانوغرام/ميليلتر (1 نانوغرام في المجموع) لكل نموذج جيد اللوحة.
    3. إضافة 10 ميليلتر من المخزن المؤقت تاجمينتيشن و 5 ميليلتر من المخزن المؤقت لتضخيم الحمض النووي التي تحتوي على كل ولطف "الماصة؛" لخلط. ختم اللوحة مع ختم لوحة لاصقة.
    4. ضع اللوحة في cycler حرارية وقم بتشغيل برنامج الاسترداد التالية: 55 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وعقد في 10 درجة مئوية. عند وصول العينة إلى 10 درجة مئوية، والشروع فورا في تحييد.
    5. إضافة 5 ميليلتر لتحييد المخزن المؤقت للوحة لتحييد رد فعل أمبليكون، ولطف "الماصة؛" ميكس. ختم اللوحة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة 15 ميليلتر من الفهرسة PCR mastermix للعينات.
    7. استخدام مربع من الفهرس التمهيدي أنابيب المتاحة لإعداد لتنسيق لوحة 96-جيدا حيث يحصل كل عينة على مزيج فريد من مؤشرات تستند إلى قالب الفهرس (الجدول 3).
    8. ترتيب الفهرس التمهيدي أنابيب في مؤشر لوحة الحامل (الشكل 1ب) استخدام النظام المنصوص عليه في القالب على الجدول 3 وتسجيل موقف الأرقام القياسية في القالب.
    9. ضع لوحة تاجمينتيشن مع إضافة PCR mastermix على الرف لوحة الفهرس مع أنابيب الفهرس في الترتيب.
    10. وضع الفهرس التمهيدي 1 أنابيب في الترتيب العمودي، والفهرس التمهيدي 2 أنابيب في الترتيب الأفقي على حامل الرقم القياسي. استخدام ماصة متعددة القنوات، بعناية إضافة 5 ميليلتر من الإشعال فهرس لكل عينة.
    11. استبدال قبعات القديمة من أنابيب الفهرس مع قبعات جديدة لتجنب التلوث المتبادل بين الأرقام القياسية.
    12. ختم لوحة استخدام السدادات لوحة واضحة 96-جيدا وأداء بكر الثاني كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، دورات 12 من 95 درجة مئوية لمدة 10 s، 55 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. تنظيف بكر
    1. نقل المنتج بكر بكر-تنظيف، من لوحة تاجمينتاتيون إلى لوحة الآبار العميقة (انظر الجدول للمواد).
    2. (انظر الجدول للمواد) استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة دوامة الحل التجاري المغناطيسي الخرز وإضافة 30 ميليلتر من حبات لكل منتج PCR في لوحة الآبار العميقة.
    3. هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة واحتضان في درجة حرارة الغرفة دون المصافحة لمدة 5 دقائق.
    4. وضع اللوحة على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة حتى أزال المادة طافية.
    5. تجاهل المادة طافية بعناية مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسية.
    6. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% طازجة مع اللوحة على الوقوف المغناطيسية.
    7. احتضان لوحة على موقف المغناطيسية لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية وتجاهل المادة طافية بدون الإخلال بالخرز.
    8. كرر الخطوة يغسل مرة أخرى والسماح الخرز أيردري لإزالة 15 دقيقة الإيثانول الزائدة أن وجدت.
    9. إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وإضافة 52.5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاستثارة الخرز.
    10. هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة دون أن تهتز.
    11. وضع اللوحة على الوقوف المغناطيسية، وتسمح المادة طافية لمسح.
    12. استخدام ماصة متعددة القنوات، بعناية نقل 50 ميليلتر من المادة طافية من لوحة التنظيف لصفيحة واقية جديدة.
  3. مكتبة التطبيع
    1. ذوبان الجليد مكتبة تطبيع الكواشف طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    2. نقل 20 ميليلتر من المادة طافية من لوحة تنظيف لوح الآبار العميقة جديدة.
    3. إضافة ميليلتر 45 تعليق حبة المغناطيسية وختم اللوحة مع السدادة لوحة.
    4. هز اللوحة على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. هذه المرة حضانة أمر بالغ الأهمية، ويجب عدم تجاوزها.
    5. وضع اللوحة على الوقوف مغناطيسية لمدة 2 دقيقة وتأكيد أن المادة طافية مسح (الشكل 1ب).
    6. إزالة وتجاهل المادة طافية في حاوية نفايات الخطرة مناسبة مع لوحة لا تزال على موقف المغناطيسية.
    7. إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وتغسل الخرز مع 45 العازلة أغسل ميليلتر.
    8. هز اللوحة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
    9. وضع لوحة على موقف المغناطيسي 2 دقيقة وتجاهل المادة طافية عندما يتحول واضحة.
    10. إزالة اللوحة من موقف المغناطيسي وتكرار الغسيل مع المخزن المؤقت للغسيل مرة أخرى.
    11. إزالة اللوحة من موقف المغناطيسية وإضافة 30 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.1.
    12. هز اللوحة مع هيدروكسيد الصوديوم N 0.1 على شاكر ميكروسكوبية 1800 لفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ووضع اللوحة على الوقوف المغناطيسية لمدة 2 دقيقة أو حتى السائل واضح.
    13. إضافة 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت لكل بئر من لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية الجدار رقيقة واقية 96-بئر جديدة.
    14. نقل 30 ميليلتر من المادة طافية من لوحة التطبيع إلى لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية لجعل وحدة التخزين النهائي 60 ميليلتر. المكتبات جاهزة الآن تكون متسلسلة.
  4. تحديد تركيز مكتبة الحمض النووي قبكر
    1. ذوبان الجليد mastermix والإشعال والمعايير المنصوص عليها في مجموعة qPCR طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
    2. تجمع بين PCR mastermix الكاشف والتمهيدي المنصوص عليها في عدة قبكر اتباع إرشادات الشركة المصنعة ومختبرين يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية.
    3. لتحديد تركيز مكتبة الحمض النووي، جعل إضعاف 1/8000 من مكتبات الحمض النووي باستخدام 10 ملم تريس المخزن المؤقت (pH 8) عن طريق إجراء تخفيف 1: 100 (مكتبة ميليلتر الحمض النووي 1.5 إلى 148.5 المخزن المؤقت تريس ميليلتر) متبوعاً بإضعاف 1:80 (2 ميليلتر من 1: 100 إلى 158 المخزن المؤقت تريس ميليلتر).
    4. اهتزاز لوحة تمييع 700 لفة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة على الأقل وثم الطرد المركزي في 14000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    5. إعداد 20 ميليلتر لتفاعل PCR النهائي بخلط 4 ميليلتر المخفف الحمض النووي مكتبة أو معايير الحمض النووي وميليلتر 16 من mastermix.
    6. إجراء PCR بعد إعدادات الشركة المصنعة في ثيرموسيكلير: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، دورات 35 من 95 درجة مئوية عن 30 ثانية و 60 درجة مئوية 45 ثانية، والنهائي 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لتحليل منحنى تذوب.
    7. الحصول على قيم Ct المكتبات عينة الحمض النووي والمعايير من ثيرموسيكلير قبكر.
    8. إنشاء منحنى قياسي من قيمة الأشعة المقطعية للمعايير (الشكل 2). تعريف نطاق مراقبة الجودة العليا والسفلي من ± 3 دورات من الوسط. على سبيل المثال، إذا كان متوسط قيمة قيراط 13 دورات ثم نطاق مراقبة الجودة بين 16 و 10 دورات.
    9. تحديد مكتبة الفردية ومتوسط التركيزات (ALC) من المنحنى المعياري والقيم المقطعية.
    10. تحديد حجم مجموع المكتبات المجمعة (PAL) لاستخدامها استناداً إلى الحساب الواردة أدناه للتسلسل النهائي وبالنظر إلى أن تركيز مكتبة الهدف بين 1.4-01:08 م.
      ملاحظة: متوسط تركيز المكتبة التي تم الحصول عليها من قبكر = جيش تحرير الكونغو؛ مجموع المكتبات المجمعة (PAL) = جيش تحرير الكونغو/2؛ التشويه والتحريف بال (DAL) = بال * 0.666
      اعتماداً على حجم DAL مختلطة مع المخزن المؤقت، هو تركيز مكتبة تضاف إلى الخلية التدفق. على سبيل المثال، إذا تم إضافة ميليلتر 65 من مكتبة إلى 835 ميليلتر من المخزن المؤقت، ثم من هذا التخفيف (ديل 1) 195 هو إضافة إلى إجمالي حجم ميليلتر 1300: (65/900) * دنبال = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = "تركيز النهائي" (يجب أن يكون بين 1.4-01:08 م)

6-مكتبة تجمع وتتابع الشروع في التسلسل Benchtop

  1. ذوبان الجليد خرطوشة كاشف طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. تأخذ بها خلية تدفق جديد من مجموعتها من مخزن 4 درجات مئوية وتقديمهم إلى الأقل درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة قبل التسلسل. إخراج كارتريدج المخزن المؤقت وتسلسل بريتشيل المخزن المؤقت قبل الاستخدام (انظر الجدول للمواد).
  2. إعداد مكتبة تحكم بخلط 5 ميليلتر من مكتبة (1 نانومتر) و 5 ميليلتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم. الدوامة بإيجاز واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تجريدها مكتبة عنصر التحكم في خيوط واحد.
  3. إضافة 5 ميليلتر من 200 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 7 ودوامه. إضافة ميليلتر 235 التسلسل بريتشيليد المخزن المؤقت وتخلط برفق. الحجم الإجمالي هو 250 ميليلتر مع مكتبة التحكم التركيز النهائي في 20 بعد الظهر.
  4. تجمع مكتبات الحمض النووي عن طريق نقل 5 ميليلتر لكل نموذج في مكتبة تكون متسلسلة من لوحة مكتبة تم تسويتها النهائية في أنبوب واحد منخفض--ربط 1.5 مل.
  5. إضافة 30 ميليلتر من مكتبة المجمعة و 30 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم N 0.2 تجريدها المكتبات في أنبوب منخفض ربط آخر.
  6. الدوامة المنخفضة-الربط أنبوب واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة تجريدها المكتبات في خيوط واحد.
  7. إضافة 30 ميليلتر من 200 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 7 إلى أنبوب مع مكتبات التشويه والتحريف لتحييد رد فعل.
  8. إضافة ميليلتر 65 تعليق مكتبات التشويه والتحريف معادلتها و 835 ميليلتر من المخزن المؤقت لتسلسل مبردة مسبقاً ودوامه مزيج جيد.
  9. في أنبوب ربط منخفض نهائي ضم ما يلي: 195 ميكروليتر من المكتبات التشويه والتحريف معادلتها، ميليلتر 1.30 مكتبة التحكم و 1103.70 ميليلتر من المخزن المؤقت للتسلسل. المزيج بشكل صحيح.
  10. تحميل ميكس مكتبة النهائي (1300 ميليلتر) إلى بقعة معينة على كاشف خرطوشة.
  11. إنشاء تسلسل تشغيل عن طريق إدخال تفاصيل المشروع وعينه في التسلسل تسمية الموقع المبادئ التوجيهية التالية.
  12. بدء تسلسل المبادئ التوجيهية التالية. تحميل خلية تدفق، خرطوشة الكاشف مع المكتبات والمخزن المؤقت في التسلسل benchtop.
  13. تسجيل أرقام دفعة لجميع مجموعات كاشف والخراطيش المستخدمة في التسلسل.

7-بيانات التحميل من الموقع التسلسل

  1. تحميل ملفات فاستق اتباع إرشادات الشركة المصنعة المقدمة على الموقع.
  2. لتشغيل التحقق من نوعية جيدة أن النسبة المئوية Q30 كثافة ≥ 75% والمجموعة ما بين 170-280 ك/مم2 مع الأمثل في ك 200-210/مم2 (الجدول 4).

8-تسلسل تحليل البيانات

  1. استيراد ملفات فاستق من عينات متسلسلة في حزمة برامج متكاملة لتحليل البيانات (انظر الجدول للمواد).
  2. إنشاء سير عمل تسلسل في البرنامج عن طريق إضافة ميزات من القائمة هي التشذيب، ورسم خرائط للمرجع (حدد مرجع الجينوم)، التقويم المحلي وتحليل متغير (الشكل 3أ) باستخدام الإعدادات المذكورة في الجدول 5.
  3. تشغيل سير العمل عن طريق تحديد عينة واحدة أو مجموعة من الملفات فاستق عينة وحفظ ملفات الإخراج في مجلدات نموذج معين.
  4. إنشاء تقرير لتسلسل عمق التغطية والمناطق المعينة وقائمة بالمتغيرات الهيكلية في الجينوم (الشكل 3ب).
  5. استخدم قائمة بالمتغيرات الهيكلية للبحث عن النوكليوتيدات واحدة غير مترادفين مجمع الأشكال المتعددة (بطانات) في الجينات منح المقاومة وضراوة.
  6. إعداد تقرير بسرد SNP الموقع والجينات، وعدد من عزلات مقاومة أو عرضه (الجدول 6).

النتائج

ثلاثة عشر درست صناعي جيم- تضم صناعي C. ATCC 90030 و 12 يعزل من سريرية علم الفطريات المختبر (يعزل CMRL1 إلى CMRL12)، مستشفى Westmead، سيدني (الجدول 1). وشملت هذه ثلاثة أزواج من يعزل كمرل-1/كمرل-2، كمرل-3/كمرل-4 وكمرل-5/كمرل-6 التي تم الحصول عليها قبل وبعد العلاج بالأدوية المضادة للفطور ل?...

Discussion

تحدد هذه الدراسة الجدوى والحدود الزمنية التقريبية والدقيقة الموجهة بالأفرقة العاملة للكشف عن مقاومة العقاقير في جيم-صناعي. وكان الزمنية (تأت) اللازمة لإعداد مكتبة وتسلسل أربعة أيام، والإبلاغ عن نتائج تحليل 1-2 يوما. ويقارن هذا مع على الأقل مبلغ مماثل تأت لفحوصات الحساسية من لوحات الث?...

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب المصالح المالية ولا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل المركز للأمراض المعدية وعلم الأحياء المجهرية، والصحة العامة. المؤلفين لم تتلق أي تمويل آخر لهذه الدراسة. يشكر المؤلفون Drs أليسيا ارنوت، باخمان ناثان ورانجيتا مينون لمشورة الخبراء والمساعدة مع التجربة تسلسل الجينوم كله.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

References

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130 5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved