JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Это исследование реализован всего генома для анализа мутаций в генах, присвоении противогрибковым препаратам в Candida glabrata. C. glabrata изолятов устойчивых к echinocandins, азолов и 5-флуцитозин, были упорядочены для иллюстрации методологии. Восприимчивость профили изолятов, связаны с наличием или отсутствием структур конкретных мутаций в генах.

Аннотация

Кандида glabrata можно быстро приобрести мутаций, приводящих к лекарственной устойчивости, особенно для азолов и echinocandins. Определение генетических мутаций имеет важное значение, как сопротивление обнаруженные в vitro часто может быть соотнесена с клинической недостаточностью. Мы изучили возможность использования всего генома (РГ) для анализа генома общесистемной противогрибковым препаратам в C. glabrata. Цель была и создают условия и препятствия в осуществлении WGS и оценивать ее эффективность. В этом документе изложены основные качества контроля контрольно-пропускных пунктов и основных компонентов WGS методологии для изучения генетических маркеров, связанные с уменьшенной восприимчивости к противогрибковых препаратов. Она также оценивает точность анализа данных и поворот вокруг времени тестирования.

Фенотипические восприимчивость 12 клинических и один ATCC штамм C. glabrata был определен путем противогрибковые восприимчивость тестирования. Эти включены три изолировать пар, из трех пациентов, разработанные рост минимальный тормозной концентрации наркотиков. В две пары второй изолировать каждой пары разработан сопротивления echinocandins. Второй изолировать третьей пары развилась устойчивость к 5-флуцитозин. Оставшиеся состоит из восприимчивых и устойчивостью азол изолятов. Единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генов, связанных с echinocandin, азол и 5-флуцитозин сопротивления были подтверждены в устойчивые изолятов через WGS, с помощью следующего поколения последовательности.  Non синоним ОНП в противогрибковые сопротивления, были определены гены как FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 и FCY2 . В целом, в среднем 98% говорится WGS изолятов C. glabrata , сопоставляются с геном ссылку с охватом около 75-fold чтения глубины. Сроки и стоимость, были сопоставимы с Сэнгер последовательности.

В заключение WGS C. glabrata было возможно в выявление мутаций гена клинически, участвующих в сопротивлении классов различных противогрибковый препарат без необходимости использования нескольких последовательности реакций ПЦР/ДНК. Это представляет собой позитивный шаг на пути к созданию WGS возможности в клинической лаборатории для одновременного обнаружения противогрибковые сопротивления присвоении замен.

Введение

Кандида glabrata это все чаще встречающихся возбудителя с значение как вид, который проявляет устойчивость к азолов, а также совсем недавно,1,echinocandins,2,,3. В отличие от диплоидных C. albicansгаплоидным геномом C. glabrata может позволить ему приобрести мутации и более легко развить множественной лекарственной устойчивости. Совместное сопротивление для обоих классов наркотиков был также сообщили4. Таким образом ранние оценки противогрибковые восприимчивости и выявления лекарственной устойчивости в C. glabrata имеет решающее значение для правильного, целевые терапии в контексте противогрибковые руководством ограничить водителей антибиотикорезистентности1 , 5 , 6. Создание эффективного рабочего процесса быстро обнаружить наличие подтверждающих мутаций, связанных с Сопротивления биомаркеров в устойчивые изолятов будет также поможет улучшить предписывающих решениях и клинические исходы.

Противогрибковые восприимчивости обычно оценивается путем измерения минимальный тормозной концентрации (MIC), которая определяется как низкая концентрация препарата, что приводит к значительному сокращению темпов роста по сравнению с немедикаментозными роста микроорганизма управления. Клинические и лабораторные стандарты Института (CLSI) и Европейского комитета по тестирования по антимикробной чувствительности (EUCAST) имеют стандартизированные методы испытаний для определения MIC восприимчивости более точной и последовательной в7, 8. Однако утилита противогрибковые MIC остается ограниченным особенно для echinocandins, в частности отношении межлабораторных сравнений различных методологий и условия которых используются9. Существует также неопределенной корреляции с ответом на лечение echinocandin и неспособность отличить WT Мико (или подверженных) изоляты от тех, кто укрывает FKS мутации (echinocandin устойчивые штаммы)10,11. Несмотря на наличие подтверждающих сингл ген ГКДЗ и Сэнгер последовательности противогрибковые сопротивление, реализация результатов часто задерживается из-за отсутствия одновременного обнаружения нескольких сопротивления маркеры5,-12. Следовательно параллельных обнаружения сопротивления вручение мутаций в разных местах в геноме, включаемые на основе последовательности анализа всего генома, предлагает значительные преимущества в сравнении с текущими подходами.

Весь геном последовательности (РГ) успешно реализованы для отслеживания передачи болезни во время вспышек, а также подход для генома общесистемного риска оценки и наркотиков сопротивления, тестирование в13бактерий и вирусов. Последние достижения в технологии секвенирование нуклеиновой кислоты сделали всего генома (РГ) патогенов в клинически осуществимое поворот вокруг времени технически и экономически осуществимы. Секвенирования ДНК обеспечивает важные преимущества по сравнению с другими методами идентификации возбудителя и характеристика, занятых в микробиологии лаборатории14,,1516. Во-первых он обеспечивает универсальное решение с высокой пропускной способностью, скорость и качество. Последовательность может быть применен к любой из микроорганизмов и позволяет масштаба на местных или региональных лабораторий. Во-вторых он производит данные в формате «будущее» поддаются сравнения на национальном и международном уровнях. Наконец был увеличен потенциальной полезности WGS в медицине быстрый рост общественного данных баз, содержащих ссылку геномов, которые могут быть связаны с базы эквивалентных данных, которые содержат дополнительные метаданные клинических и эпидемиологических17 ,18.

Недавние исследования продемонстрировали полезность WGS для идентификации противогрибковые сопротивления маркеров из клинических изолятов Candida spp. 10 , 19 , 20. это главным образом объясняется наличие высокой пропускной способностью benchtop секвенсеры, установленным биоинформатики трубопроводов и снижается стоимость секвенирования21,22. Преимущество грибковых WGS Сэнгер, последовательности, что РГ позволяет секвенирования геномов несколько на один запуск. Кроме того РГ Candida геномов может идентифицировать новые мутации в наркотиков цели, отслеживать генетической эволюции и появление клинически значимых типов последовательности20,,2223. Самое главное в случае внутренней множественной лекарственной устойчивости, WGS может помочь раннего выявления мутаций присвоении сопротивления до лечения выбор22,24.

Здесь мы изучили возможности WGS-поддержкой скрининга для мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью к различным классам противогрибковых препаратов. Мы представляем методологии для осуществления WGS с точки зрения лабораторных диагностических микология и конечных пользователей. Мы включили в этот анализ, что три изолировать пар, культивированный из трех отдельных клинических случаев, в которых в vitro устойчивость к echinocandins и 5-флуцитозин разработаны со временем, после противогрибковое лечение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Для этого исследования требовалось не этические утверждения.

1. субкультуры и посевные подготовка Candida glabrata

  1. Выберите группу изолятов C.glabrata быть изучены, которые также должны включать по крайней мере один C. glabrata американский тип культуры коллекции (ЦУВД) с известными восприимчивость узором.
  2. Субкультура изолят, прикоснувшись единую колонию с использованием стерильных одноразовых пластиковых цикла и мелирование на Sabouraud декстроза агар (SDA) пластины8.
  3. Инкубируйте пластину ПДД за 24-48 ч при 35 ° C для чистой культуры изолировать с хорошим ростом.

2. Определение противогрибковых восприимчивости

  1. Используйте Стерильные одноразовые пластиковые петли подобрать 4-5 колоний диаметром около 1 мм от свеже subcultured C. glabrata изолировать на табличке ПДД. Ресуспензируйте в 3 мл стерильной дистиллированной воды. Смешайте хорошо нежный дозирование для получения единообразных подвеска.
  2. Отрегулируйте плотность клеток до 0.5 МакФарланд, что эквивалентно6 1 x 10-5 х 106 клеток/мл с помощью денситометр 8.
  3. Выполните тестирование чувствительности с использованием коммерческих пробирного (см. таблицу материалов и реагентов) на всех C. glabrata изолятов, следуя инструкциям производителя. Интерпретировать восприимчивость изолятов в основанные на результирующей ОПГВ противогрибковыми препаратами согласно рекомендации CLSI и подготовить доклад (таблица 1)8.

3. genomic извлечения ДНК для виртуализации

  1. Ресуспензируйте loopful колоний от свежезаваренным выращенных пластины ПДД в 300 мкл 50 мм ЭДТА в 1,5 мл.
  2. Мкл 40 zymolyase (10 мг/мл) подвеска, и аккуратно накапайте 5 раз до тех пор, пока подвеска единообразной.
  3. Инкубируйте образца при 37 ° C для 1-2 h переваривать клеточной стенки. Охладить при комнатной температуре в течение 5 мин.
  4. Центрифуга для подвески на 14 000 × g на 2 мин и затем тщательно удалить супернатант.
  5. Экстракт геномной ДНК, ДНК добыча комплект руководящих принципов (см. таблицу материалы).
  6. Ресуспензируйте извлечь ДНК Пелле в 50 мкл 10 мм трис буфере (рН 7,5-8,5) вместо Элюирующий буфер, предоставленный в комплекте.
  7. Проверьте чистоту ДНК путем измерения оптической плотности (О.Д) 260/280 Нм25.

4. геномной ДНК количественная оценка

  1. Подготовить 1 x буфер Tris ЭДТА (TE) поставляется в комплекте пробирного, основанный на руководящих принципах производителя для assay флуоресценции в (см. таблицу материалы).
  2. Разбавьте образец ДНК путем добавления 2 мкл 98 мкл 1 x TE пробирного буфера (окончательный объем 100 мкл, коэффициент разбавления 1:50) в одноразовых 96 пластины хорошо. Этот шаг в разбавления можно выполнить вручную с помощью многоканальные пипетки или автоматизированных жидкости рабочих станций.
  3. Подготовка перечня стандартов путем разбавления лямбда ДНК (100 мкг/мл) флуоресценции пробирного комплекта (таблица 2) и включают для измерения вместе с образцами.
  4. Добавьте 100 мкл флуоресцентного красителя на 100 мкл разбавленной образцов ДНК и стандартов для реакции. Инкубируйте 5 мин при комнатной температуре, в защищенном от света.
  5. Измерьте флуоресценции всех образцов, на основе руководящих принципов производителя.
  6. Участок калибровочной кривой с помощью флуоресценции чтений и рассчитать оригинальный концентрация образцов ДНК.
  7. Определите объем ДНК и буфер Tris 10 мм (рН 8) добавлены для регулировки концентрации ДНК до 0,2 нг/мкл.
  8. Выполните разведений ДНК, с помощью автоматизированных жидкости рабочих станций. Этот шаг также достигается за счет ручной закупорить.

5. ДНК библиотеки подготовка

Примечание: Библиотека подготовка и последовательность была выполнена после производителя протоколы и руководящие принципы, предоставляемые компанией (рис. 1А) (см. таблицу материалы).

  1. Tagmentation и PCR амплификация
    1. Ярлык нового 96-луночных hard-shell тонкой настенной.
    2. 5 мкл количественных ввода ДНК на 0.2 нг/мкл (1 нг в общей сложности) для каждой выборки хорошо пластины.
    3. Добавить 10 мкл буфера tagmentation и 5 мкл буфера усиления каждой хорошо содержащих ДНК и аккуратно Пипетка смешивать. Уплотнение пластину с клейкой пластины печать.
    4. Установите пластину в тепловая велосипедист и запустите следующую программу ПЦР: 55 ° C за 5 мин и провести на 10 ° C. Когда образец достигает 10 ° C, немедленно приступить к нейтрализации.
    5. 5 мкл буфера нейтрализации к пластине для нейтрализации ампликон реакции, и осторожно Пипетка микс. Печать пластину и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    6. 15 мкл индексации mastermix ПЦР для образцов.
    7. Используйте поле Индекс грунтовка труб доступны для установки формат 96-луночных пластины, чтобы каждый образец получает уникальное сочетание индексов, основанных на индекс шаблона (таблица 3).
    8. Организовать индекс грунтовка труб в стойку индекс пластины (рис. 1Б) с использованием указанной последовательности в шаблоне таблицы 3 и записать позицию индексов на шаблоне.
    9. Место tagmentation пластина с добавил mastermix ПЦР на индекс пластины стойку с трубками индекс в порядке.
    10. Поместить индекс грунтовка 1 трубы в вертикально и индекс грунтовка 2 трубы в горизонтальном расположении на стойку индекс. С помощью многоканальных дозаторов, тщательно мкл 5 праймеров индекс для каждого образца.
    11. Замените старый шапки индекс трубок с новой шапки, чтобы избежать перекрестного загрязнения между индексами.
    12. Печать пластину с помощью шпатлевки 96-луночных четкие пластины и выполнить второй PCR следующим: 95 ° C за 30 s, 12 циклов 95 ° c 10 s, 55 ° C за 30 сек, 72 ° C за 30 s и 72 ° C за 5 мин.
  2. ПЦР очистка
    1. Передача продукта PCR для ПЦР очистки, от tagmentation пластины к пластине штанхглубинных (см. таблицу материалы).
    2. Вихревой коммерческие магнитной бусины решение (см. таблицу материалы) на основе инструкции производителя и 30 мкл бусы для каждого продукта ПЦР в глубокой скважины пластины.
    3. Shake пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин и инкубации при комнатной температуре без встряхивания в течение 5 мин.
    4. Место пластину на магнитного стенд за 2 мин до тех пор, пока расчистил супернатант.
    5. Выбросите супернатант тщательно с табличке еще магнитного стенд.
    6. Добавьте 200 мкл свежеприготовленные 80% этанола с пластиной магнитного стенд.
    7. Инкубировать пластину на магнитного стенд для 30 s и осторожно снимите и выбросьте супернатант не нарушая бисер.
    8. Повторите шаг мыть и позволяют бисером высохнуть за 15 мин удалить избыток этанола, если таковые имеются.
    9. Снять пластину из магнитного стенд и 52,5 мкл буфера ресуспендирования корда.
    10. Shake пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин на 2 мин и инкубации при комнатной температуре на 2 мин без встряхивания.
    11. Место пластину на магнитную подставку и позволяют супернатант очистить.
    12. С помощью многоканальных дозаторов, тщательно передать 50 мкл супернатант от очистки пластины новой пластинкой твердой скорлупой.
  3. Нормализация библиотеки
    1. Оттепель библиотека нормализации реагенты согласно рекомендациям производителя (см. таблицу материалы).
    2. Передача 20 мкл супернатант от очистки пластины к новой плите глубокой скважины.
    3. 45 мкл суспензии магнитного шарик и печатью пластины с sealer пластины.
    4. Встряхните пластину на шейкере Гонав при 1800 об/мин за 30 мин. Это время инкубации имеет решающее значение и не должен быть превышен.
    5. Установите пластину на магнитного стенд на 2 мин и подтвердите, что супернатант расчистил (рис. 1Б).
    6. Снимите и выбросьте супернатант в контейнере соответствующего опасных отходов с табличке еще магнитного стенд.
    7. Снять пластину из магнитного стенд и мыть бусины с 45 мкл буфера мытья.
    8. Встряхните пластину с буфером мыть на шейкере Гонав при 1800 об/мин за 5 мин.
    9. Поместите пластину на магнитного стенд 2 мин и удалить супернатант, когда она становится ясно.
    10. Снять пластину из магнитного стенд и повторите мыть с буфером мыть.
    11. Снять пластину из магнитного стенд и 30 мкл 0,1 Н NaOH.
    12. Встряхнуть пластины с 0,1 Н NaOH в шейкере Гонав при 1800 об/мин за 5 мин и место пластину на магнитного стенд для 2 минут или до тех пор, пока жидкость ясно.
    13. Добавьте 30 мкл буфера в каждой скважине новой пластинкой окончательный нормализованных библиотека 96-луночных hard-shell тонкие стены.
    14. Передать 30 мкл супернатант от нормализации пластины пластины окончательный нормализованных библиотека сделать окончательный объем 60 мкл. Библиотеки теперь готовы к виртуализации.
  4. Определение концентрации библиотеки ДНК, ПЦР
    1. Оттепель mastermix, грунты и стандартов ПЦР комплекта согласно рекомендациям производителя (см. таблицу материалы).
    2. Объединить mastermix реагент ПЦР и грунт, в комплект ПЦР, соблюдая инструкции производителя и аликвоты могут храниться при температуре-20 ° C.
    3. Для определения концентрации библиотеки ДНК, сделайте 1/8000 разрежения библиотек ДНК, используя буфер Tris 10 мм (рН 8), выполняя разбавления 1: 100 (1.5 библиотеки ДНК мкл 148.5 буфер Tris мкл) следуют 1:80 разрежения (2 мкл от 1: 100 до 158 мкл буфера Tris).
    4. Shake пластину разрежения на 700 об/мин для по крайней мере 1 мин и затем центрифуги на 14000 × г за 1 мин.
    5. Подготовка 20 мкл окончательной реакции PCR путем смешивания 4 мкл разбавленного библиотеки ДНК или ДНК стандартов и 16 мкл mastermix.
    6. Выполнять следующие параметры производителя в Термоциклер ПЦР: 95 ° C за 5 мин, 35 циклов 95 ° C за 30 s-60 ° C для 45 s и заключительный 65 ° C до 95 ° C для анализа кривой расплава.
    7. Получите значения Ct библиотек образцов ДНК и стандартов Термоциклер ПЦР.
    8. Генерировать калибровочной кривой от Ct значения стандартов (рис. 2). Определите диапазон КК верхнего и нижнего, ± 3 циклов от среднего значения. Например если среднее значение Ct 13 циклов затем КК диапазон находится между 16 и 10 циклов.
    9. Определите индивидуальный и средняя библиотека концентрации (ALC) от стандартной кривой и Ct значения.
    10. Определите объем общего пула библиотек (PAL), которые будут использоваться на основании расчета, приведены ниже для окончательного последовательности, считая, что концентрация целевой библиотеки между 1.4 - 1 8 вечера.
      Примечание: Средняя концентрация Библиотека, полученные от ПЦР = ALC; Всего пула библиотек (PAL) = ALC / 2; Денатурированный PAL (DAL) = PAL * 0.666
      В зависимости от объема DAL, который смешивается с буфером является концентрация библиотеки, чтобы добавить в ячейку потока. Например, если 65 мкл библиотеки добавляется 835 мкл буфера, то от этого разрежения (Dil 1) 195 добавляется суммарный объем 1300 мкл: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = конечная концентрация (должно быть между 1.4 - 1 8 вечера)

6. Библиотека объединения и инициирование последовательности в Benchtop секвенсор

  1. Оттепель реагент патрон согласно рекомендациям производителя. Возьмите новую ячейку потока от своего пакета от 4 ° C для хранения и довести до комнатной температуры atleast 30 мин до последовательности. Вынуть картридж буфера и prechill последовательности буфера перед использованием (см. таблицу материалы).
  2. Подготовьте библиотеку элементов управления путем смешивания 5 мкл библиотеки (1 Нм) и 5 мкл 0,2 N NaOH. Вихревой кратко и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать Библиотека элементов управления в одиночных стренги.
  3. 5 мкл 200 мм трис-HCl, pH 7 и вихря. Добавьте 235 мкл буфера prechilled последовательности и осторожно перемешать. Общий объем-250 мкл с управления Библиотека конечная концентрация на 20 вечера.
  4. Бассейн библиотеки ДНК путем передачи 5 мкл каждого образца библиотеки для виртуализации от окончательного нормализованных библиотека пластины в одной низкой свяжите 1,5 мл трубку.
  5. Добавьте 30 мкл пуле библиотеки и 30 мкл 0,2 N NaOH чтобы денатурировать библиотеки в другой трубки низкого bind.
  6. Вихревой низкий bind трубки и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы денатурировать библиотек в одиночных стренги.
  7. 30 мкл 200 мм трис-HCl, pH 7 трубка с денатурированного библиотек для нейтрализации реакции.
  8. Добавьте 65 мкл нейтрализованы денатурированного библиотек подвеска и 835 мкл предварительно охлажденные последовательности буфера и вихревой хорошо перемешайте.
  9. В трубке окончательный низким bind объединить следующие: 195 мкл от нейтрализованы денатурированного библиотеки, 1,30 мкл библиотеки элементов управления и 1103.70 мкл буфера последовательности. Mix правильно.
  10. Загрузите окончательный библиотека микс (1300 мкл) в назначенный пятно на реагент картриджа.
  11. Настройка последовательности запуска введя детали проекта и образец в программе Sequencer места для веб-сайта после руководящих принципов.
  12. Начало последовательности с руководящими принципами. Загрузить поток клеток, реагент картридж с библиотеками и буфера картридж в секвенсор benchtop.
  13. Запишите номера партии всех наборов реагентов и картриджи, используемых в последовательности.

7. данные скачать с сайта последовательности

  1. Скачайте FASTQ файлы, следуя инструкциям на веб-сайте изготовителя.
  2. Для хорошего качества, проверить, что процент Q30 ≥ 75% и кластера плотность является между 170-280 K/мм2 с оптимальной на 200-210 K/мм2 (таблица 4).

8. последовательности анализа данных

  1. Импорт файлов FASTQ виртуализированного образцов в интегрированный программный пакет анализа данных (см. таблицу материалы).
  2. Создание рабочего процесса виртуализации программного обеспечения путем добавления функций из списка а именно обрезки, сопоставления ссылок (выберите ссылку генома), местные перестройки и вариант анализа (рисA) с помощью параметров, перечисленных в таблице 5.
  3. Запуск рабочего процесса, выбрав один образец или пакетных файлов образцов FASTQ и сохранить выходные файлы в папках указанного образца.
  4. Создать отчет для последовательности глубину охвата, сопоставленных регионов и список структурных вариантов в геноме (рис. 3B).
  5. Используйте список структурных вариантов для поиска не являются синонимами единичных нуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах, присвоении сопротивления и вирулентности.
  6. Подготовьте доклад, перечисляя SNP местоположение, ген и количество устойчивостью или подверженных изоляты (таблица 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Тринадцать C. glabrata составе изолятов ATCC 90030 и 12 C. glabrata от клинической микологии референс-лаборатории (изоляты CMRL1 до CMRL12), были изучены больницы Westmead, Сидней (таблица 1). К ним относятся три пары изолятов, CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 и CMRL-5/CMRL-6, полученные до и после противогрибк...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Это исследование определяет целесообразность, приблизительные сроки и точность обнаружения WGS-руководствуясь лекарственной устойчивости в C. glabrata. Время обработки (ТАТ) для подготовки библиотека и последовательности было четыре дня и отчетности проанализированы результаты одно?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы имеют без финансовых интересов и конфликта интересов не разглашать.

Благодарности

Эта работа была поддержана центра инфекционных заболеваний и микробиологии, общественного здравоохранения. Авторы не получили каких-либо других источников финансирования для этого исследования. Авторы благодарят Drs Alicia Арнотт, Натан Бахман и Ranjeeta Менон за их квалифицированную консультацию и помощь с весь геном последовательности эксперимент.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

Ссылки

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718(2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824(2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314(2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268(2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110(2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

130Candida glabrataechinocandins5

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены