Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מיושם רצף הגנום כולו עבור ניתוח של מוטציות בגנים היוועצות תרופתיים פטרת, קנדידה glabrata. Glabrata ג מבודד עמידים echinocandins, azoles ו- 5-flucytosine, היו רציף כדי להמחיש את המתודולוגיה. הרגישות פרופילים של מבודד בקורלציה עם נוכחות או היעדרות של המוטציה דפוסי בגנים.

Abstract

קנדידה glabrata יכול לרכוש במהירות מוטציות שגורמות עמידות לתרופות, במיוחד אל azoles ואל echinocandins. זיהוי של מוטציות גנטיות חיוני, כמו ההתנגדות זוהה במבחנה ניתן לעיתים קרובות בקורלציה עם כשלון קליני. בדקנו את הכדאיות של שימוש רצף הגנום כולו (WGS) לניתוח ברמת הגנום של עמידות לתרופות נגד פטריות ב- glabrata ג. המטרה הייתה torecognize נחותות ומחסומים ביישום WGS ומדידת יעילותו. מאמר זה מתאר את בקרת איכות מפתח מחסומים ואת מרכיבים חיוניים של מתודולוגיה WGS לחקור גנטיים המשויכים הרגישות מופחתת סוכני פטריות. זה גם מעריך את הדיוק של ניתוח נתונים, סיבוב סביב הזמן של בדיקות.

הרגישות פנוטיפי של 12 קליני, בקרת האוויר אחד, מזן glabrata ג נקבע באמצעות בדיקות רגישות נגד פטריות. שלושת אלה כלולים לבודד זוגות, של שלושה מטופלים, שהתפתח עלייה בריכוזים מעכבות המינימלי סמים. ב שני זוגות, השני בודד של כל זוג פיתח עמידות echinocandins. בידוד השני בזוג השלישי פיתח עמידות 5-flucytosine. הנותרים מורכבת רגישים ועמיד azole מבודד. פולימורפיזמים נוקלאוטיד יחיד (SNPs) גנים הקשורים echinocandin, azole והתנגדות 5-flucytosine היו אישר מבודד עמיד דרך WGS באמצעות רצף הדור הבא.  SNPs Non-נרדף בהתנגדות פטריות זוהו גנים כגון FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 , FCY2 . בסך הכל, ממוצע של 98% הקריאות WGS של glabrata ג מבודד למפות את הגנום הפניה עם כיסוי על 75-fold עומק קריאה. משך העבודה והעלות היו דומות סנגר רצף.

לסיכום, WGS של glabrata ג היה ריאלי בגילוי משמעות קלינית מוטציות מעורב ההתנגדות סמים פטריות שונות שיעורים ללא צורך מרובים PCR/DNA רצף תגובות. זה מייצג צעד חיובי לקראת הקמת WGS יכולת במעבדה קלינית לגילוי סימולטני של החלפות ומעניקה עמידות נגד פטריות.

Introduction

קנדידה glabrata הוא הפתוגן יותר ויותר המערכת נתקלה עם חשיבות כמו זן תערוכות ההתנגדות של azoles וכן לאחרונה,2,1,echinocandins3. בניגוד דיפלואידי אלביקנס ג, הגנום הפלואידי של glabrata ג עשוי לאפשר לו לרכוש מוטציות ולפתח עמידות לתרופות מרובות בקלות רבה יותר. ההתנגדות שותף עד שתי הכיתות סמים היה גם דיווח על4. לפיכך, הערכה מוקדמת של פטריות רגישות וזיהוי של עמידות לתרופות ב glabrata ג הוא קריטי עבור גם טיפול נכון, יישוב כמו ההקשר של סדרנות פטריות להגביל את מנהלי ההתקנים של עמידות מיקרוביאלית1 , 5 , 6. הקמת זרימת עבודה יעילה במהירות לזהות הנוכחות של מוטציות מאשרות מקושר סמנים ההתנגדות מבודד עמיד יהיה גם עזרה לשיפור יגרור החלטות התוצאות הקליניות.

הרגישות פטריות מוערך בדרך כלל על ידי מדידת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) אשר מוגדר את ריכוז התרופה הנמוך, שמביאה לירידה משמעותית בצמיחה של מיקרואורגניזם לעומת זה של גידול ללא סמים שליטה. קלינית, מכון תקנים מעבדה (CLSI) ואת הוועדה האירופית-מיקרוביאלית הרגישות בדיקות (EUCAST) יש סטנדרטית הרגישות בדיקות בשיטות כדי להפוך מיקרופון נחישות יותר מדויקים ועקביים7, 8. עם זאת, השירות של מיקרופון פטריות נותר מוגבל במיוחד עבור echinocandins, בפרט לגבי השוואות inter-laboratory היכן מתודולוגיות שונות ותנאים נמצאים בשימוש9. יש גם קורלציה לא בטוח של מיקרופונים עם תגובה לטיפול echinocandin, יכולת להבחין WT (או רגישים) מבודד מאלה מחסה FKS מוטציות (זנים עמידים echinocandin)10,11. למרות הזמינות של מותני יחיד-גן מאשרות ו סנגר רצף של סמני עמידות נגד פטריות, מימוש התוצאות לעיתים קרובות מתעכבת בשל חוסר זיהוי בו זמנית של מספר ההתנגדות סמני5,12. לפיכך, זיהוי בו-זמניות של היוועצות ההתנגדות מוטציות במיקומים שונים בגנום, מופעל על-ידי ניתוח המבוסס על רצף הגנום כולו, מציעה יתרונות רבים על פני לגישות.

הגנום כולו רצף (WGS) יושמה בהצלחה כדי לעקוב אחר העברת המחלה בעת התפרצויות, כמו גם גישה עבור הסיכון הגנום כולו הערכת סמים והתנגדות בדיקות חיידקים ווירוסים13. ההתקדמות בטכנולוגיית רצפי חומצות גרעין הפכו את רצף הגנום כולו (WGS) של פתוגנים קלינית שבידיך התור-מסביב-זמן ריאלי הן מבחינה טכנית והן מבחינה כלכלית. רצפי DNA מציע יתרונות חשובים על פני שיטות אחרות של פתוגן זיהוי ואפיון המועסקים ב מיקרוביולוגיה מעבדות14,15,16. ראשית, הוא מספק פתרון אוניברסלי עם תפוקה גבוהה, מהירות ואיכות. רצף ניתן להחיל על כל מיקרואורגניזמים ומאפשר לגודל במעבדות מקומיים או אזוריים. שנית, הוא מייצר נתונים בתבנית 'העתיד-הוכחה' לבצע השוואה ברמות לאומיים ובינלאומיים. בסופו של דבר, השירות פוטנציאל של WGS ברפואה כבר בתוספת מאת צמיחתם המהירה של בסיסי נתונים ציבורי המכיל הפניה הגנום, אשר יכולה להיות קשורה מסדי נתונים שווה ערך להכיל מטה-נתונים קליניים ואפידמיולוגיים נוספים17 ,18.

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את התועלת של WGS לזיהוי סמנים עמידות נגד פטריות מ מבודד קליני של קנדידה spp. 10 , 19 , 20. זאת בעיקר בשל הזמינות של תפוקה גבוהה benchtop סקוונסרים, ביואינפורמטיקה הוקמה צינורות, הפחתת העלות של רצף21,22. היתרון של WGS פטרייתי על סנגר רצף הוא WGS מאפשר רצף של הגנום מרובים בריצה יחיד. בנוסף, WGS של קנדידה הגנום יכול לזהות מוטציות הרומן סמים מטרות, לעקוב אחר ההתפתחות הגנטית, הופעתה של רצף הרלוונטית קלינית-סוגים20,22,23. והכי חשוב, במקרים של התנגדות multidrug מהותי, WGS יכול לסייע בזיהוי מוקדם של מוטציות היוועצות התנגדות לפני טיפול הבחירה22,24.

. בדקנו את הכדאיות של התומכים ב- WGS הקרנה של מוטציות הקשורות תרופתיים לסוגים שונים של סוכני פטריות. אנו מציגים מתודולוגיה ליישום WGS של משתמש הקצה ופרספקטיבות מעבדה מיקולוגיה אבחון. אנו כלולים בניתוח זה לבודד שלושה זוגות תרבותי של שלושה מקרים קליניים נפרדות אשר במבחנה ההתנגדות echinocandins ו- 5-flucytosine שפותחו לאורך זמן בעקבות טיפול נגד פטריות.

Protocol

אין אישור מוסרי היה נדרש עבור מחקר זה.

1. תת-תרבות ו inoculum הכנה קנדידה glabrata

  1. בחר פאנל של מבודד C.glabrata שילמדו אשר גם לכלול לפחות אחד glabrata ג אמריקאי סוג תרבות אוסף (בקרת האוויר) עם דפוס רגישות ידועה.
  2. תת-תרבות בידוד על-ידי נגיעה שמושבה בודדת באמצעות לולאה פלסטיק חד פעמיות סטריליות והופעת פסים, על גבי דקסטרוז אגר של Sabouraud (SDA) לוח8.
  3. דגירה לצלחת SDA במשך 24-48 שעות-35 ° C טהור תרבות של בידוד עם גדילה טובה.

2. קביעת הרגישות פטריות

  1. שימוש לולאה פלסטיק חד פעמי סטרילי לבחור 4-5 מושבות של-1 מ מ קוטר מתוך טרי subcultured glabrata ג לבודד בצלחת SDA. Resuspend ב 3 מ ל מים מזוקקים סטריליים. מערבבים היטב בעזרת pipetting עדין לקבל השעיה אחיד.
  2. התאם את צפיפות תא ל 0.5 מקפרלנד ששווה ל עונה 1 פרק 106 5 x 106 תאים למ"ל שימוש דחיסות 8.
  3. לבצע בדיקות רגישות שימוש assay המסחרי (ראה טבלה של חומרים, ריאגנטים) על כל glabrata ג מבודד ההוראות של היצרן. לפרש את הרגישות של מבודד מבוסס על תוצאות מיקרוגרם של תרופות נגד פטריות בהתאם להנחיות CLSI ולהכין דו ח (טבלה 1)8.

3. מיצוי DNA גנומי עבור רצף

  1. Resuspend loopful של המושבות מצלחת SDA בוגר טרי ב- 300 µL של 50 מ מ EDTA צינור 1.5 מ.
  2. להוסיף 40 µL של zymolyase (10 mg/mL) ההשעיה של בעדינות pipet 5 פעמים עד ההשעיה יהיה אחיד.
  3. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h לעכל את דופן התא. מגניב בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  4. Centrifuge את המתלים ב 14,000 × g למשך 2 דקות, לאחר מכן הסר בזהירות את תגובת שיקוע.
  5. תמצית הדנ א בעקבות ה-DNA החילוץ ערכת הנחיות (ראה טבלה של חומרים).
  6. Resuspend חילצה צניפה דנ א ב 50 µL 10 מ מ טריס מאגר (pH 7.5-8.5) במקום המאגר • תנאי המסופק בערכה.
  7. בדוק את הטוהר של ה-DNA על ידי מדידה של צפיפות אופטית (וייפר)-260/280 ננומטר25.

4. כימות דנ א גנומי

  1. להכין 1 x טריס EDTA (TE) מאגר המסופק בערכה assay בהתבסס על הנחיות היצרן וזמינותו קרינה פלואורסצנטית (ראה טבלה של חומרים).
  2. לדלל את דגימת ה-DNA על-ידי הוספת 2 µL µL 98 1 x טה assay מאגר (סופי נפח של 100 µL, גורם לדילול 1:50) בצלחת חד פעמית טוב 96. שלב דילול זה יכול להתבצע באופן ידני באמצעות פיפטה רב-ערוצי או על-ידי אוטומטיים נוזל טיפול תחנת עבודה.
  3. הכן את המגוון לסטנדרטים באמצעות דילול של למדא דנ א (100 µg/mL) המסופק בערכה assay קרינה פלואורסצנטית (טבלה 2) וכוללים למדידה יחד עם דוגמאות.
  4. להוסיף 100 µL של הפלורסנט ל 100 µL מדולל דגימות די אן איי של תקנים עבור התגובה. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
  5. למדוד את זריחה של כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן.
  6. התווה את עקומת רגיל באמצעות קרינה פלואורסצנטית המקראות ולחשב את הריכוז המקורי של דגימות ה-DNA.
  7. קבע את עוצמת הקול של ה-DNA ומאגר טריס 10 מ מ (pH 8) שיש להוסיף כדי להתאים את ריכוז הדנ א כדי 0.2 ng/µL.
  8. לבצע את דילולים הדנ א באמצעות נוזל אוטומטיות טיפול תחנת עבודה. שלב זה יכולה להיות מושגת גם על ידי pipetting ידנית.

5. הכנה ספריית דנ א

הערה: ספריית הכנה ורצף בוצעה בעקבות פרוטוקולים והנחיות היצרן שסופקו על-ידי החברה (איור 1א') (ראה טבלה של חומרים).

  1. הגברה Tagmentation ו- PCR
    1. תווית hard-shell 96-ובכן דק קיר צלחת חדשה.
    2. להוסיף 5 µL של כימות קלט DNA ב 0.2 ng/µL (1 ng סה כ) כל מדגם טוב של הצלחת.
    3. להוסיף 10 µL מאגר tagmentation ו- µL 5 הגברה מאגר כל DNA המכיל טוב, בעדינות פיפטה לערבב. חותם את הצלחת בחותם צלחת דבק.
    4. למקם את הצלחת הצנטרפוגה תרמי ולהפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 55 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, והחזק -10 מעלות צלזיוס. כאשר המדגם מגיע ל- 10 ° C, פנה/י מיד כדי לנטרל.
    5. הוסף 5 µL ניטרול המאגר הצלחת לנטרל את התגובה אמפליקון ולאחר בעדינות פיפטה מיקס. לאטום את הצלחת, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    6. הוסף µL 15 אידקס PCR mastermix את הדגימות.
    7. להשתמש בתיבת של צינורות פריימר האינדקס הזמינים עבור התקנה של צלחת 96-ובכן בפורמט כך כל מדגם מקבל שילוב ייחודי של מדדים המבוססים על תבנית אינדקס (טבלה 3).
    8. לארגן את השפופרות פריימר אינדקס בארון צלחת אינדקס (איור 1B) באמצעות הסדר מסופקים בתבנית של טבלה 3 ולהקליט את המיקום של המדדים על התבנית.
    9. המקום לצלחת tagmentation עם mastermix הוסיף PCR על המדף צלחת אינדקס עם הצינורות אינדקס סדר.
    10. הכניסו הסדר אופקי על המדף אינדקס אינדקס פריימר 1 צינורות הסדר אנכי, אינדקס פריימר 2 צינורות. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף בזהירות µL 5 של אינדקס תחל כל דגימה.
    11. החלף בקבוקים הישן של צינורות אינדקס כתרים חדשים כדי למנוע זיהום צולב בין מדדי.
    12. לאטום את הצלחת באמצעות חומרי איטום צלחת 96-ובכן ברור ולבצע את ה-PCR השני כדלקמן: 95 ° C ל 30 s, 12 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 55 ° C ל 30 s, 72 ° C ל 30 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  2. ניקוי ה-PCR
    1. להעביר את המוצר PCR עבור ה-PCR-ניקוי, בלוח tagmentation צלחת באר (ראה טבלה של חומרים).
    2. מערבולת הפתרון beads מגנטי מסחרי (ראה טבלה של חומרים) המבוסס על הוראות היצרן ומוסיפים µL 30 של חרוזים כל מוצר ה-PCR בצלחת באר.
    3. לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 2 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר בלי טלטולים למשך 5 דקות.
    4. מניחים את הצלחת על דוכן מגנטית למשך 2 דקות עד ניקה תגובת שיקוע.
    5. למחוק את תגובת שיקוע בזהירות עם לוחית עדיין על הדוכן מגנטי.
    6. להוסיף 200 µL של אתנול 80% טריות עם הלוחית לדוכן מגנטי.
    7. דגירה את הצלחת על הדוכן מגנטי עבור 30 s ו בזהירות להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע מבלי להפריע את החרוזים.
    8. חזור על השלב לשטוף שוב ולאפשר את החרוזים מילה נהדרת עבור 15 דקות להסיר עודפי אתנול, אם בכלל.
    9. הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי ולהוסיף µL 52.5 מאגר resuspension החרוזים.
    10. לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 2 דקות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות מבלי לרעוד.
    11. מקם את הצלחת על הדוכן מגנטי ולאפשר את תגובת שיקוע לנקות.
    12. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, בזהירות להעביר 50 µL של תגובת שיקוע מהצלחת ניקוי צלחת hard-shell חדשה.
  3. ספריית נורמליזציה
    1. הפשרת ספריית ריאגנטים הנורמליזציה בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
    2. העברה µL 20 של תגובת שיקוע מהצלחת ניקוי צלחת באר חדשה.
    3. הוסף µL 45 של ההשעיה מגנטי חרוז, לאטום את הצלחת עם סילר לאיטום צלחת.
    4. לנער את הצלחת על מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 30 דקות. הפעם הדגירה הוא קריטי, לא צריך להיות חריגה.
    5. מניחים את הצלחת על דוכן מגנטית למשך 2 דקות ואשר תגובת שיקוע ניקה (איור 1B).
    6. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע במיכל פסולת מסוכנת המתאים עם לוחית עדיין על הדוכן מגנטי.
    7. הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי ולשטוף את החרוזים עם מאגר לשטוף µL 45.
    8. נתנער לצלחת עם שטיפת מאגר מטרף microplate-1800 סל"ד למשך 5 דקות.
    9. מניחים צלחת על מעמד מגנטי עבור 2 דקות ותגובת שיקוע להשליך כשיתחיל ברורה.
    10. הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי וחזור בכביסה באמצעות מאגר לשטוף שוב.
    11. הסר את הלוחית של הדוכן מגנטי, להוסיף 30 µL של 0.1 N NaOH.
    12. נתנער לצלחת עם 0.1 N NaOH מטרף microplate-1800 rpm עבור 5 דקות ומניחים את הצלחת על הדוכן מגנטית למשך 2 דקות, או עד שהנוזל הוא ברור.
    13. להוסיף 30 µL • תנאי מאגר כל טוב של צלחת חדשה של ספריית מנורמל הסופי hard-shell 96-ובכן קיר דק.
    14. להעביר 30 µL של תגובת שיקוע נורמליזציה צלחת צלחת ספריית מנורמל הסופי כדי להפוך הסופי נפח 60 µL. הספריות מוכנים עכשיו היה לסדרם.
  4. קביעת ריכוז ספריית ה-DNA על ידי qPCR
    1. להפשיר את mastermix, תחל ותקני המסופק בערכה qPCR בהתאם להנחיות היצרן (ראה טבלה של חומרים).
    2. לשלב את ה-PCR ריאגנט mastermix ואת פריימר המסופק בערכה qPCR בעקבות הוראות היצרן, aliquots שניתן לאחסן ב-20 ° C.
    3. כדי לקבוע ריכוז ספריית ה-DNA, לגרום לדילול 1/8000 של ספריות DNA באמצעות מאגר טריס 10 מ מ (pH 8) על-ידי ביצוע לדילול בטחונות (1.5 µL DNA ספריית למאגר טריס 148.5 µL) ואחריו לדילול 1:80 (2 µL של בטחונות למאגר טריס µL 158).
    4. לנער את הצלחת דילול ב 700 סל ד לפחות 1 דקות, ואז צנטריפוגה ב 14000 × g עבור 1 דקות.
    5. הכן µL 20 של תגובת ה-PCR סופית על ידי ערבוב 4 µL של ספריית ה-DNA מדולל או תקני ה-DNA ו 16 µL של mastermix.
    6. לבצע PCR בעקבות הגדרות היצרן thermocycler: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 35 מחזורי 95 ° C עבור s 30 ו- 60 ° C s 45, ואת סופי-65 ° C עד 95 ° C לניתוח עקומת להמיס.
    7. השג הערכים Ct של דגימת DNA ספריות, תקני thermocycler qPCR.
    8. ליצור עיקול רגיל מהערך Ct את הסטנדרטים (איור 2). להגדיר את הטווח QC העליון והתחתון מאת ± 3 מחזורים מהממוצע. לדוגמה, אם ערך Ct הינו 13 מחזורים ואז QC הטווח הוא בין 16 ו- 10 מחזורים.
    9. לקבוע ריכוז ספריית בודדים, ממוצע (ALC) עיקול רגיל ו Ct ערכים.
    10. לקבוע את עוצמת הקול של ספריות במאגר הכולל (PAL) כדי לשמש מבוסס על חישוב כדלקמן עבור רצף הסופי בהתחשב בעובדה ריכוז ספריית היעד היא בין 1.4 - 1-8 pM.
      הערה: ממוצע ריכוז ספריית המתקבל qPCR = ALC; סה כ במאגר ספריות (PAL) = ALC / 2; . שפגע בסימני PAL (DAL) = חבר * 0.666
      בהתאם לנפח של דאל זה מעורבב עם מאגר, נמצא הריכוז של ספריית להוסיף לתא זרימה. לדוגמה, אם µL 65 של ספריית מתווסף µL 835 המאגר, ואז מ זה דילול (דיל 1) 195 מתווסף הנפח הכולל של 1300 µL: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = ריכוז סופי (צריך להיות בין 1.4 - 1-8 pM)

6. ספריית באגירת ורצף יזום של הרצפים (sequencer) Benchtop

  1. מחסנית ריאגנט הפשרה בהתאם להנחיות היצרן. להוציא תא זרם חדש מחבילת שלה מתוך 4 ° C אחסון ולהביא לטמפרטורת החדר לפחות 30 דקות לפני רצף. להוציא מחסנית מאגר ומאגר רצף prechill לפני השימוש (ראה טבלה של חומרים).
  2. להכין ספריה שליטה על ידי ערבוב 5 µL של הספרייה (1 ננומטר) ו µL 5 של 0.2 N NaOH. מערבולת בקצרה דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי denature הספרייה שליטה לתוך גדילי יחיד.
  3. להוסיף 5 µL של 200 מ"מ טריס-HCl, pH 7 ו מערבולת. להוסיף מאגר רצף prechilled µL 235 ולערבב בעדינות. אמצעי האחסון הכולל הוא µL 250 עם בקרת ספרייה הריכוז הסופי בגיל 20 pM.
  4. בריכת ספריות ה-DNA על ידי העברת 5 µL של כל ספריה לדוגמה היה לסדרם מהצלחת ספריית מנורמל הסופי לתוך צינור בודד נמוך-bind 1.5 מ.
  5. להוסיף 30 µL של ספריית במאגר ו 30 µL של 0.2 N NaOH כדי denature ספריות בצינור bind נמוך אחרת.
  6. מערבולת הנמוכה-bind צינור, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי denature ספריות לתוך גדילי יחיד.
  7. להוסיף 30 µL של 200 מ מ טריס-HCl, pH 7 צניעותו עם ספריות שפגע בסימני כדי לנטרל. את התגובה.
  8. הוסף µL 65 של ספריות שפגע בסימני ינוטרלו השעיה µL 835 של מאגר רצף טרום מקורר, מערבולת לערבב היטב.
  9. צינור bind נמוך הסופי לשלב הבא: 195 µL של ספריות שפגע בסימני מונטסקייה, 1.30 µL שליטה ספריית ו µL 1103.70 רצף המאגר. מערבבים היטב.
  10. טען את המיקס הסופי בספריה (1300 µL) במקום המיועד לכך שעל מחסנית ריאגנט.
  11. הגדרת הרצף המנוהל על ידי הזנת פרטי פרוייקט המדגם של הרצפים (sequencer) המיועד באתר, לאחר הנחיות.
  12. רצף אתחול בעקבות הנחיות. לטעון תא זרימה, ריאגנט מחסנית עם ספריות, המחסנית מאגר benchtop ברצף.
  13. לתעד את מספרי אצווה של כל ערכות ריאגנט מכלי הדיו המשמשים את הרצף.

7. הנתונים להוריד מאתר רצף

  1. להוריד קבצים FASTQ בעקבות הוראות היצרן המופיע באתר.
  2. באיכות טובה בדיקת זה האחוז Q30 ≥ 75% ואשכול צפיפות היא בין K 170-2802 עם אופטימלית-K 200-210/מ מ2 (טבלה 4).

8. רצף נתונים ניתוח

  1. לייבא קבצים FASTQ של דגימות ברצף חבילת תוכנה משולבת ניתוח הנתונים (ראה טבלה של חומרים).
  2. ליצור רצף זרימת עבודה בתוכנה על ידי הוספת תכונות מרשימת כלומר זמירה, מיפוי על הפניה (הפניה בחר גנום), ההתכנסות המקומי וניתוח variant (איור 3א) תוך שימוש בהגדרות המפורטות בטבלה 5.
  3. להפעיל את זרימת העבודה על-ידי בחירת דוגמה אחת או על אצוות מדגם FASTQ קבצים ולשמור קבצי פלט בתיקיות מדגם המיועד.
  4. להפיק דוח עבור רצף כיסוי עומק, האזורים הממופים רשימה של משתנים מבניים של הגנום (איור 3ב).
  5. השתמש ברשימת של משתנים מבניים כדי לחפש נוקלאוטיד יחיד-שם נרדף פולימורפיזמים (SNPs) בגנים היוועצות והתנגדות התקפה אלימה.
  6. להכין דוח על-ידי רישום הסנ פ המיקום, ג'ין, ומספר מבודד עמיד או רגישים (טבלה 6).

תוצאות

13 glabrata ג הכוללת glabrata ג מבודד בקרת האוויר 90030 ו-12 מהמעבדה קליניים הפניה מיקולוגיה (מבודד CMRL1 כדי CMRL12), בית החולים Westmead, סידני נחקרו (טבלה 1). אלה כללו שלושה זוגות מבודד CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ו- CMRL-5/CMRL-6 שהושגו לפני ואחרי טיפול נגד פטריות עם קישורים אפידמיולוגיים ביניהם

Discussion

מחקר זה נקבע היתכנות, צירי זמן משוער ודיוק של זיהוי מונחה WGS של עמידות לתרופות ב glabrata ג. זמן טיפול (TAT) כדי להפוך את הספריה הכנת רצף היה ארבעה ימים ודיווח תוצאות שנותחה שתיים ימים. זה משווה עם כמות דומה של פחות TAT על מבחני רגישות בין צלחות לתרבות סנגר רצף עם מספר גבוה משמעותית של דגימות. בס?...

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים, אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המרכז למחלות זיהומיות, מיקרוביולוגיה, בריאות הציבור. המחברים לא קיבלו כל אחרים מימון למחקר זה. המחברים מודים Drs אלישיה Arnott, נתן בכמן, Ranjeeta מנון על שלהם מומחים יעוץ וסיוע עם הניסוי רצף הגנום כולו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

References

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130glabrataechinocandinsazoles5 flucytosine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved