Todo genoma secuencia del glabrata de la Candida para detección de marcadores de antihongos drogas resistencia

Resumen

Este estudio implementa la secuenciación del genoma entero para el análisis de mutaciones en genes que confieren resistencia a los fármacos antifúngicos en Candida glabrata. Aislamientos de C. glabrata resistentes a equinocandinas, azoles y 5-flucitosina, se secuenciaron para ilustrar la metodología. Perfiles de susceptibilidad de los aislamientos correlacionados con la presencia o ausencia de patrones de la mutación específica de genes.

Resumen

Candida glabrata puede adquirir rápidamente las mutaciones que resultan en resistencia a los medicamentos, especialmente a azoles y equinocandinas. Identificación de mutaciones genéticas es esencial, como la resistencia detectada en vitro a menudo puede ser correlacionado con la falta clínica. Examinamos la viabilidad de utilizar la secuenciación del genoma entero (gt) para el análisis del genoma de resistencia a los fármacos antimicóticos en C. glabrata. El objetivo era torecognize facilitadores y barreras en la implementación WGS y medir su eficacia. Este documento describe los puntos clave de control de calidad y componentes esenciales de la metodología de grupos para investigar marcadores genéticos asociados con reducida susceptibilidad a antifúngicos. También estima la precisión de análisis de datos y vuelta alrededor de tiempo de prueba.

Susceptibilidad fenotípica de 12 clínicas y una cepa ATCC de C. glabrata se determinan mediante las pruebas de susceptibilidad antifúngica. Estos incluyeron tres aislar a pares de tres pacientes que desarrollaron aumento de concentraciones inhibitorias mínimas de drogas. En dos pares, aislar a la segunda de cada par desarrollado resistencia a las equinocandinas. El segundo aislante del tercer par desarrolló resistencia a 5-flucitosina. El restante compuesto por susceptibles y resistentes a azoles aislados. Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) en genes relacionados con resistencia equinocandina, azoles y 5-flucitosina fueron confirmados en aislantes resistentes a través de grupos usando la siguiente secuencia de generación.  No-sinónimas SNPs en resistencia antifúngica se identificaron genes como FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 y FCY2 . General, un promedio de 98% de las lecturas WGS de aislamientos de C. glabrata trazados el genoma de referencia con cobertura sobre 75-fold profundidad leer. El tiempo de entrega y el coste eran comparables a Sanger secuenciación.

En conclusión, era factible en revelar mutaciones en el gen clínicamente significativos implicados en la resistencia a las clases diferentes antimicóticos sin la necesidad de múltiples reacciones de secuenciación de ADN PCR WGS de C. glabrata . Esto representa un paso positivo hacia el establecimiento de capacidad WGS en el laboratorio clínico para la detección simultánea de sustituciones que confiere resistencia a antifúngicos.

Introducción

Candida glabrata es un patógeno encontrado cada vez más importancia como una especie que exhibe resistencia a los azoles así como más recientemente, las equinocandinas^1,2,3. A diferencia de los diploides de C. albicans, el genoma haploide de C. glabrata puede permitir adquirir mutaciones y desarrollan resistencia a múltiples drogas más fácilmente. La resistencia a ambas clases de drogas también ha sido reportado⁴. Por lo tanto, la evaluación temprana de antihongos de la susceptibilidad y la detección de resistencia a medicamentos en C. glabrata es cruciales para la terapia correcta y específica, así como en el contexto de corresponsabilidad antihongos para limitar los conductores de resistencia a los antimicrobianos^{1 , 5 , 6}. establecer un flujo de trabajo eficiente para detectar rápidamente la presencia de confirmación mutaciones vinculadas a biomarcadores de resistencia en aislamientos resistentes será también ayuda a mejorar la prescripción de las decisiones y los resultados clínicos.

Antihongos de la susceptibilidad generalmente se evaluaron mediante la medición de la concentración inhibitoria mínima (MIC) que se define como la menor concentración de droga que resulta en una reducción significativa en el crecimiento de un microorganismo en comparación con la de un crecimiento libre de drogas control. La clínica e Instituto de normas de laboratorio (CLSI) y Comité Europeo en pruebas de susceptibilidad antimicrobiana (EUCAST) han estandarizado métodos de prueba para determinación de MIC la susceptibilidad más precisa y consistente^{7, 8}. Sin embargo, la utilidad de MIC antihongos sigue siendo limitada especialmente para las equinocandinas, en particular con respecto a las comparaciones entre laboratorios donde diferentes metodologías y las condiciones son usadas⁹. También existe correlación incierto de micrófonos con respuesta al tratamiento de la equinocandina e incapacidad de distinguir el peso (o susceptibles) aislados de aquellos que FKS mutaciones (cepas resistentes a la equinocandina)^10,11. A pesar de la disponibilidad de confirmación PCR de gen único y Sanger secuenciación de los marcadores de resistencia a antimicóticos, realización de resultados se retrasa a menudo debido a la falta de detección simultánea de múltiples marcadores de resistencia^5,12. Por lo tanto, la detección simultánea de mutaciones que confieren resistencia en diversas localizaciones en el genoma, de análisis basados en la secuenciación de todo el genoma, ofrece importantes ventajas sobre enfoques actuales.

Todo el genoma secuencia (WGS) se ha implementado con éxito para seguir la transmisión de la enfermedad durante los brotes, así como un enfoque para genoma riesgo evaluación y drogas prueba de resistencia en las bacterias y los virus¹³. Los avances recientes en tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos han hecho la secuenciación del genoma entero (gt) de patógenos en una vuelta alrededor de tiempo clínicamente útiles técnicamente y económicamente factible. Secuencia de la DNA ofrece importantes ventajas sobre otros métodos de identificación de patógenos y caracterización empleadas en laboratorios de Microbiología^14,15,16. En primer lugar, proporciona una solución universal con calidad, rapidez y alto rendimiento. La secuencia puede ser aplicada a cualquiera de los microorganismos y permite economías de escala en laboratorios locales o regionales. En segundo lugar, produce datos en un formato de 'futuro' susceptible de comparación a nivel nacional e internacional. Finalmente, la utilidad potencial de gt en medicina ha sido aumentada por el rápido crecimiento de bases de datos públicas que contienen genomas de referencia, que pueden ser vinculadas a bases de datos equivalentes que contienen metadatos adicionales clínicos y epidemiológicos^{17 ,18}.

Estudios recientes han demostrado la utilidad de gt para la identificación de marcadores de resistencia antifúngica de aislamientos clínicos de Candida spp. ^{10 , 19 , 20}. esto se debe principalmente a la disponibilidad de secuenciadores de sobremesa de alto rendimiento, tuberías de Bioinformática establecidos y disminuir el costo de la secuenciación de^21,22. La ventaja de WGS hongos sobre Sanger secuenciación es que WGS permite la secuenciación de genomas múltiples en una única prueba. Además, WGS de genomas de Candida pueden identificar mutaciones en las dianas farmacológicas, seguimiento de evolución genética y la aparición de tipos de secuencia clínicamente relevantes^20,22,23. Lo más importante, en casos de multirresistencia intrínseca, WGS puede ayudar en la detección temprana de las mutaciones que confieren resistencia antes de tratamiento selección^22,24.

Aquí, hemos examinado la viabilidad de WGS habilitada detección de mutaciones asociadas con resistencia a diferentes clases de agentes antimicóticos. Se presenta una metodología para la implementación de grupos desde la perspectiva del laboratorio de Micología diagnóstica y usuario final. Se incluyeron en este análisis tres aislar a pares cultivados de tres casos clínicos diferentes en que en vitro resistencia a las equinocandinas y 5-flucitosina se convirtió con el tiempo después del tratamiento antifúngico.

Protocolo

No aprobación ética fue requerida para este estudio.

1. subcultura e inóculo preparación para Candida glabrata

1. Seleccione un panel de aislados de C.glabrata a estudiar que también debería incluir al menos una C. glabrata americano tipo Culture Collection (ATCC) con el patrón de susceptibilidad conocida.
2. Subcultivo de una cepa tocando una sola Colonia utilizando un asa estéril de plástico desechable y vetas en agar de dextrosa de Sabouraud (SDA) de la placa⁸.
3. Incubar la placa SDA por 24-48 h a 35 ° C para la pura cultura de aislamiento con buen crecimiento.

2. determinación de sensibilidad antifúngica

1. Uso de aislar un asa de plástico desechable estéril hasta una recién subcultivadas C. glabrata colonias de 4-5 de aproximadamente 1 mm de diámetro en placa de SDA. Resuspender en 3 mL de agua destilada estéril. Mezclar bien mediante pipeteo suave para obtener suspensión uniforme.
2. Ajustar la densidad celular a McFarland 0.5 que equivale a 1 x 10⁶ a 5 x 10⁶ células/mL, utilizando un densitómetro ⁸.
3. Realizar pruebas de sensibilidad utilizando el ensayo comercial (véase tabla de materiales y reactivos) sobre todo de C. glabrata aísla siguiendo las instrucciones del fabricante. Interpretar la susceptibilidad de aislamientos basados en MICs resultantes de fármacos antimicóticos según las directrices CLSI y preparar informe (tabla 1)⁸.

3. genómica extracción de ADN para secuenciación

1. Suspender un asa llena de colonias de una placa de SDA recién crecida en 300 μL de EDTA de 50 m m en un tubo de 1,5 mL.
2. Agregar 40 μl de zymolyase (10 mg/mL) a la suspensión y suavemente la pipeta 5 veces hasta que la suspensión es uniforme.
3. Incubar la muestra a 37 ° C durante 1-2 h para digerir la pared celular. Enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Centrifugar la suspensión a 14.000 × g durante 2 minutos y luego retire con cuidado el sobrenadante.
5. Extraer el ADN genómico siguiendo pautas de kit de extracción de ADN (véase tabla de materiales).
6. Resuspenda cuidadosamente extraído pellet de DNA en 50 μl de 10 mM tampón Tris (pH 7.5-8.5) en lugar del tampón de elución proporcionado en el kit.
7. Compruebe la pureza del ADN por la medida de densidad óptica (OD) a 260/280 nm²⁵.

4. genómica cuantificación de ADN

1. Preparar un 1 x de tampón Tris EDTA (TE) suministrado en el kit de ensayo basado en las instrucciones del fabricante para el ensayo de fluorescencia (véase tabla de materiales).
2. Diluir la muestra de ADN mediante la adición de 2 μl μl 98 de 1 x de tampón de ensayo TE (volumen final de 100 μl de dilución factor 1:50) en una placa bien 96 desechables. Este paso de dilución se puede realizar manualmente utilizando una pipeta multicanal o por estación de trabajo para manejo de líquidos automatizados.
3. Preparar la gama de estándares diluyendo la lambda ADN (100 μg/mL) suministrado en el kit de ensayo de fluorescencia (tabla 2) y son para la medición de muestras.
4. Añadir 100 μl de colorante fluorescente a 100 μl diluir muestras de ADN y las normas para la reacción. Incubar por 5 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
5. Medir la fluorescencia de las muestras basadas en las instrucciones del fabricante.
6. Trazar la curva estándar utilizando las lecturas de la fluorescencia y la concentración original de las muestras de ADN.
7. Determinar el volumen de ADN y 10 mM de tampón Tris (pH 8) para ser añadido para ajustar la concentración de DNA a 0,2 ng/μl.
8. Realizar las diluciones de ADN utilizando estación de trabajo para manejo de líquidos automatizados. Este paso puede lograrse también mediante pipeteo manual.

5. ADN biblioteca preparación

Nota: Preparación de la biblioteca y la secuencia fue realizado siguiendo los protocolos y guías proporcionados por la empresa (figura 1A) del fabricante (véase tabla de materiales).

1. Tagmentation y PCR amplificación
   1. Etiquetar una placa de pared fina rígida de 96 pocillos nueva.
   2. Añadir 5 μl de entrada cuantificada ADN a 0,2 ng/μl (1 ng en total) para cada muestra de la placa.
   3. Añadir 10 μl de tampón de tagmentation y 5 μl de tampón de amplificación para cada bien que contiene ADN y pipetee suavemente para mezclar. Selle la placa con un sello de placa adhesiva.
   4. Colocar la placa en un termociclador y ejecutar el siguiente programa PCR: 55 ° C por 5 min y espera a 10 ° C. Cuando la muestra llega a 10 ° C, proceda inmediatamente a neutralizar.
   5. Añadir 5 μl de tampón de neutralización a la placa para neutralizar la reacción de amplicones y pipetee suavemente la mezcla. Sellar la placa e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   6. Añadir 15 μl del mastermix PCR a las muestras de indexación.
   7. Utilice una caja de tubos de primer índice disponibles para una configuración de formato de la placa de 96 pocillos para que cada muestra tiene una combinación única de índices basados en la plantilla de índice (cuadro 3).
   8. Colocar los tubos del primer índice en el estante de placa índice (figura 1B) usando la orden en la plantilla en la tabla 3 y registrar la posición de los índices en la plantilla.
   9. Coloque la placa de tagmentation con agregado mastermix PCR en el estante de placa índice con los tubos del índice en orden.
   10. Poner índice cartilla 1 tubos en arreglo vertical e índice cartilla 2 tubos en arreglo horizontal en la bandeja de índice. Cuidadosamente con una pipeta multicanal, añadir 5 μl de primers de índice a cada muestra.
   11. Reemplazar tapas de tubos de índice con tapas nuevas para evitar la contaminación cruzada entre índices.
   12. Sellar la placa con el sellador de placa 96 pocillos claro y realizar la segunda PCR como sigue: 95 ° C por 30 s, 12 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 30 s y 72 ° C durante 5 minutos.
2. Limpieza PCR
   1. Transferir el producto de PCR PCR-limpieza de la placa de tagmentation a una placa de la pozo profundo (véase tabla de materiales).
   2. Mezclar la solución comercial bolas magnéticas (véase tabla de materiales) basado en las instrucciones del fabricante y añadir 30 μl de granos a cada producto PCR en la placa de la pozo profundo.
   3. Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente sin agitar durante 5 minutos.
   4. Coloque la placa en un soporte magnético por 2 min hasta que el sobrenadante ha desaparecido.
   5. Descartar el sobrenadante con cuidado la placa en el soporte magnético.
   6. Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado con la placa en el soporte magnético.
   7. Incube la placa en el soporte magnético por 30 s y cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante sin molestar a los granos.
   8. Repetir la etapa de lavado y deje los granos secar 15 minutos quitar exceso etanol si cualquier.
   9. Retire la placa del soporte magnético y añadir 52.5 μl de buffer de resuspensión a los granos.
   10. Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 2 min e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos sin agitación.
   11. Coloque la placa en el soporte magnético y permiten el sobrenadante borrar.
   12. Usando una pipeta multicanal, cuidadosamente transferir 50 μl del sobrenadante de la placa de limpieza a una nueva placa rígida.
3. Normalización de la biblioteca
   1. Descongele los reactivos de normalización biblioteca según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales).
   2. Transferir 20 μl del sobrenadante de la placa de limpieza a una nueva placa de la pozo profundo.
   3. Agregue 45 μl de suspensión de grano magnético y sellar la placa con un sellador de placas.
   4. Agitar la placa sobre un agitador de microplacas a 1800 rpm por 30 min. Este tiempo de incubación es fundamental y no debe ser excedida.
   5. Colocar la placa sobre un soporte magnético por 2 min y confirmar que el sobrenadante haya desaparecido (figura 1B).
   6. Retire y descarte el sobrenadante en un recipiente de residuos adecuados con la placa en el soporte magnético.
   7. Retire la placa del soporte magnético y lavar los granos con 45 μl de tampón de lavado.
   8. Agitar la placa con tampón de lavado en un agitador de microplacas a 1800 rpm por 5 min.
   9. Coloque la placa en soporte magnético por 2 min y descartar sobrenadante cuando resulta claro.
   10. Retire la placa del soporte magnético y repetir el lavado con tampón de lavado.
   11. Retire la placa del soporte magnético y añadir 30 μl de 0,1 N NaOH.
   12. Agitar la placa con 0,1 N NaOH en un agitador de microplacas a 1800 rpm por 5 min y coloque la placa en el soporte magnético durante 2 minutos o hasta que el líquido es claro.
   13. Añadir 30 μl de tampón de elución a cada pocillo de una placa nueva de biblioteca normalizada final 96-bien rígida pared delgada.
   14. Transferencia 30 μL del sobrenadante de la placa de la normalización a la placa final biblioteca normalizada para hacer volumen final de 60 μL. Las bibliotecas están ahora listas para ser ordenados.
4. Determinación de concentración de ADN biblioteca por qPCR
   1. Descongelar el mastermix, cartillas y normas previstas en el kit qPCR según las instrucciones del fabricante (véase tabla de materiales).
   2. Combinar el mastermix de reactivos PCR y la cartilla suministrada con el kit qPCR siguiendo las instrucciones del fabricante y alícuotas pueden almacenarse a-20 ° C.
   3. Para determinar la concentración de la biblioteca de ADN, hacer una dilución de 1/8000 de las bibliotecas de ADN utilizando tampón Tris 10 mM (pH 8) realizando una dilución 1: 100 (1,5 μl ADN biblioteca a 148,5 μl de tampón de Tris) seguido de una dilución de 1: 80 (2 μl de 1: 100 a 158 μl de tampón de Tris).
   4. Agitar la placa dilución a 700 rpm durante al menos 1 minuto y luego centrifugar a 14000 x g durante 1 minuto.
   5. Preparar 20 μl de reacción de PCR final mezclando 4 μL de diluido biblioteca de ADN o DNA y 16 μl del mastermix.
   6. Realizar la siguiente configuración del fabricante en termociclador PCR: 95 ° C por 5 min, 35 ciclos de 95 ° C para 30 s y 60 ° C por 45 s y final 65 ° C a 95 ° C para el análisis de la curva de fusión.
   7. Obtener los valores de Ct de los estándares y las bibliotecas de ADN de muestra del qPCR termociclador.
   8. Generar una curva estándar del valor del Ct de los estándares (figura 2). Para definir el rango de control de calidad superior e inferior ± 3 ciclos de la media. Por ejemplo, si la media valor de Ct es 13 ciclos entonces la gama de control de calidad es entre 16 y 10 ciclos.
   9. Determinar las concentraciones individuales y media biblioteca (ALC) de la curva estándar y los valores de Ct.
   10. Determinar volumen de bibliotecas total combinadas (PAL) que se utilizará se basa en cálculo que indicamos a continuación para la secuencia final, considerando que la concentración de la biblioteca de destino es entre 1.4-13:08.
       Nota: Promedio de concentración de la biblioteca de qPCR = ALC; Total de bibliotecas agrupadas (PAL) = ALC / 2; Desnaturalizado PAL (DAL) = PAL * 0.666
       Dependiendo del volumen de DAL que se mezcla con el buffer, es la concentración de biblioteca que se añade a la celda de flujo. Por ejemplo, si 65 μl de biblioteca se agrega a 835 μl de buffer, luego de esta dilución (1 Dil) 195 se añade a un volumen total de 1300 μl: (65/900) * dnPAL = Dil1
       Dil1 * (195/1300) = concentración Final (debe estar entre 1.4-13:08)

6. Biblioteca pooling y la secuencia de inicio en secuenciador de sobremesa

1. Cartucho de reactivo de deshielo según las instrucciones del fabricante. Sacar una nueva célula de flujo del paquete de almacenamiento de 4 ° C y a temperatura ambiente al menos 30 minutos antes de la secuencia. Saque el cartucho de tampón y tampón de secuenciación prechill antes de usar (véase tabla de materiales).
2. Preparar una biblioteca de control mediante la mezcla de 5 μl de biblioteca (1 nM) y 5 μl de 0.2 N NaOH. Brevemente Vortex e incubar por 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar la biblioteca control en solos filamentos.
3. Añadir 5 μl de 200 mM Tris-HCl, pH 7 y vortex. Añadir 235 μl de tampón de prechilled secuenciación y mezclar suavemente. El volumen total es de 250 μl con la concentración final de biblioteca de control a las 20 pM.
4. Bibliotecas de ADN de piscina mediante la transferencia de 5 μl de cada biblioteca de muestra para ser secuenciados de la placa final biblioteca normalizada en un tubo único lazo baja 1,5 mL.
5. Añadir 30 μl de biblioteca agrupado y 30 μl de 0.2 N NaOH para desnaturalizar las bibliotecas en otro tubo de atar bajo.
6. Vórtice el lazo de la baja del tubo e incubar 5 min a temperatura ambiente para desnaturalizar las bibliotecas en solos filamentos.
7. Añadir 30 μl de 200 mM Tris-HCl, pH 7 al tubo con bibliotecas desnaturalizadas para neutralizar la reacción.
8. Añadir 65 μl de suspensión de bibliotecas desnaturalizada neutralizado y 835 μl de tampón de la secuencia previamente enfriada y de vortex para mezclar bien.
9. En un tubo de atar bajo final combinar lo siguiente: 195 μl de bibliotecas desnaturalizadas neutralizadas, 1.30 μl de biblioteca de control y 1103.70 μl de tampón de la secuencia. Mezclar correctamente.
10. Cargar la mezcla final de la biblioteca (1300 μL) en el lugar designado en el cartucho de reactivo.
11. Configurar la secuencia de entrar en detalles de proyecto y muestra en el secuenciador señalado sitio web siguiendo las instrucciones.
12. Iniciar secuencia siguiendo las instrucciones. De carga celda de flujo, cartucho de reactivo con bibliotecas y tampón en secuenciador de sobremesa.
13. Grabar números de lote de kits de reactivos y cartuchos utilizados en la secuenciación.

7. datos de descargar del sitio web de la secuencia

1. Descargar archivos FASTQ siguiendo las instrucciones del fabricante en el sitio Web.
2. Para una buena calidad ejecutada comprueba que el porcentaje Q30 ≥ 75% y cluster densidad es entre 170-280 K/mm² con óptima a 200-210 K/mm² (tabla 4).

8. secuencia de análisis de datos

1. Importar archivos FASTQ de muestras secuenciadas en paquete de software integrado de análisis de datos (véase tabla de materiales).
2. Crear un flujo de trabajo de secuenciación en software añadiendo características de lista es decir, recortar, cartografía de referencia (referencia select genoma), reajuste local y variante análisis (figura 3A) parámetros listados en la tabla 5.
3. Ejecutar el flujo de trabajo mediante la selección de una muestra o un lote de archivos de ejemplo FASTQ y guardar archivos en carpetas de muestra señalado.
4. Generar informe para profundidad de cobertura de secuencia, regiones asignadas y lista de variantes estructurales en el genoma (figura 3B).
5. Utilizar lista de variantes estructurales para buscar polimorfismos no sinónimo de un solo nucleótido (SNPs) en genes que confieren resistencia y virulencia.
6. Preparar informe de lista de ubicación de SNP, gene y número de cepas resistentes o susceptibles (cuadro 6).

Resultados

13 C. glabrata con aislamientos de C. glabrata ATCC 90030 y 12 desde el laboratorio de referencia de Micología clínica (aislantes CMRL1 a CMRL12), Hospital de Westmead, Sydney fueron estudiados (tabla 1). Estos incluyen tres pares de aislados CMRL-CMRL 1-2, CMRL-CMRL 3.4 y CMRL-5/CMRL-6 obtienen antes y después de la terapia antifúngica sin vínculos epidemiológicos entre ellos ²⁴ (tabla 1).

Discusión

Este estudio determinó viabilidad, plazos aproximados y precisión de guiado de WGS detección de resistencia de C. glabrata. El tiempo de respuesta (TAT) para la preparación de la biblioteca y la secuencia fue cuatro días e informe de los días de doblete de resultados analizados. Esto se compara con al menos una cantidad similar TAT para los ensayos de susceptibilidad de placas y Sanger secuenciación con un número significativamente mayor de muestras. Unos 30-90 C. glabrata genomas pueden ser sec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DensiCHECK Plus	BioMérieux Inc	K083536	Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOne	TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific	YO10	Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles	Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific	22-363-605	Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes	Sigma Aldrich, Merck	T2795	Volume 2.0 mL, natural
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus	MP Biomedicals, LLC	8320921	Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120	Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	P7589	Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A Index set B Index set C Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2	Illumina	FC-404-2004	300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 Kit	Illumina	FC-404-2003	300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control Kit	Illumina	FC-110-3001	To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture Kit		FC-130-1005	2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing	KAPA Biosystems	KK4824	Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system	PerkinElmer	YJS4NGS	Used for DNA dilutions during sequencing
0.8 mL Storage Plate	Thermo Scientific	AB0765B	MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96	Thermo Fisher Scientific	AM10027	Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP	Benchmark Scientific	BT1502	96-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR Plate	BioRad	HSP9601	Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II	Roche	5015278001	Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical	BioRad	MSB1001	Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics Workbench	Qiagen	CLCBio	Software for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrument	Illumina	Illumina	Benchtop Sequencer used for next generation sequencing