Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada Candida glabrataantifungal ilaç direnci veriyor genlerdeki mutasyonlar çözümlenmesi için tüm genom sıralama uygulanmaktadır. C. glabrata yalıtır echinocandins, azoles ve 5-flucytosine, dayanıklı metodoloji göstermek için sıralı. Duyarlılık profilleri varlığı ya da yokluğu genler belirli mutasyon desenleri ile ilişkili yalıtır.

Özet

Candida glabrata hızla ilaç direnci, özellikle azoles ve echinocandins neden mutasyonlar elde edebilirsiniz. Direnç vitro kez klinik başarısızlık ile ilişkili olduğu tespit gibi Genetik mutasyonlar tanımlanması önemlidir. Genom geniş analizi C. glabrataantifungal ilaç direnci için tüm genom sıralama (WGS) kullanarak fizibilite inceledi. Amaç torecognize yardımcı teknolojiler ve engelleri WGS uygulamasında ve onun etkinliğini ölçmek. Bu kağıt anahtar kalite kontrol kontrol noktaları ve genetik işaretler antifungal ajanları düşük duyarlılık ile ilgili araştırmaya WGS metodolojisi temel bileşenlerine önerilmektedir. Ayrıca veri analizi doğruluğunu ve dönüş çevresinde-test zamanı tahmin ediyor.

12 klinik fenotipik duyarlılık ve C. glabrata bir ATCC suşu antifungal duyarlılık testi ile tespit edilmiştir. Dahil bu üç çift, uyuşturucu minimum inhibitör konsantrasyonu artış geliştirilmiş üç hastalardan izole et. İki çift olarak ikinci izole echinocandins her çift geliştirilen direnç. Üçüncü çiftinin ikinci izole 5-flucytosine direnç geliştirmiştir. Kalan duyarlı ve azole dayanıklı yalıtır oluşur. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) echinocandin, azole ve 5-flucytosine direnç bağlantılı genlerdeki dayanıklı yalıtır WGS sonraki nesil sıralama kullanarak üzerinden teyit edildi.  Sigara eşanlamlı SNPs antifungal direnç genleri FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 ve FCY2 gibi tespit edildi. Genel olarak, ortalama % 98 oranında başvuru genom ile yaklaşık 75-fold okuma derinlik örtmek için eşlenen C. glabrata yalıtır WGS okur. Gerçekleştirme süresi ve maliyeti Sanger için karşılaştırılabilir sıralama.

Sonuç olarak, C. glabrata WGS klinik olarak anlamlı gen mutasyonlarının farklı antifungal ilaç sınıfları birden fazla PCR/DNA sıralama reaksiyonlar için gerek kalmadan direnç yer vermeden mümkün. Bu WGS yeteneklilik içinde eşzamanlı antifungal direnç saldırıyı oyuncu değişikliği algılanması için klinik laboratuvar kurulması yolunda olumlu bir adım temsil eder.

Giriş

Candida glabrata giderek karşılaşılan bir patojen azoles yanı sıra son zamanlarda, echinocandins1,2,3direnç sergileyen bir tür olarak öneme sahip olduğunu. Diploit C. albicans, C. glabrata haploit genom mutasyonlar elde etmek ve çoklu ilaç direnci daha kolay geliştirmek için izin verebilir. Co direnç için her iki ilaç sınıfları Ayrıca olmuştur4bildirdi. Bu nedenle, erken antifungal duyarlılık değerlendirilmesi ve C. glabrata ilaç direnci tespiti doğru hedeflenen tedavisi için Antimikrobiyal direnç1 sürücüleri sınırlamak için antifungal yönetimi bağlamında olduğu gibi çok önemlidir , 5 , 6. hızla direnç biyolojik olarak dirençli yalıtır bağlı doğrulama mutasyonların varlığı da reçete artırmak için yardımcı kararlar olduğunu algılar için etkin bir iş akışı ve klinik sonuçlar oluşturma.

Antifungal duyarlılık genellikle bir uyuşturucu ücretsiz büyüme ile karşılaştırıldığında bir mikroorganizma gelişimini önemli bir azalma sonucunda en düşük ilaç konsantrasyonu olarak tanımlanan minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) ölçülerek değerlendirilir Denetim. Klinik ve laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Komitesi antimikrobiyal duyarlılık testi (EUCAST) üzerinde duyarlılık testi yöntemleri mikrofon tespiti yapmak için standartlaşmış daha doğru ve tutarlı7, 8. Ancak, antifungal mikrofon yarar özellikle inter-laboratory karşılaştırmalar açısından çeşitli metodolojiler ve koşullar kullanılan9nerede özellikle echinocandins için sınırlı kalır. Ayrıca mikrofon belirsiz ilişki echinocandin tedavi ve yetersizlik WT ayırt etmek için yanıt ile olduğunu (ya da duyarlı) bu FKS mutasyonlar (echinocandin dirençli suşların)10,11yataklık yalıtır. Doğrulayıcı tek gen PCR ve Sanger rağmen antifungal direnç işaretleri sıralama, sonuçları gerçekleştirilmesinin kez nedeniyle birden fazla direnç işaretleri5,12eşzamanlı Algılama eksikliği gecikir. Bu nedenle, tüm genom analizi tarafından-dayandırılmış, etkin genom, farklı yerlerdeki direnci veriyor mutasyonların eş zamanlı algılama güncel yaklaşımları önemli avantajlar sunmaktadır.

(WGS) sıralama tüm genom genom genelinde risk değerlendirme ve ilaç direnci bakteri ve virüsleri13' te test için bir yaklaşım yanı sıra hastalık iletim sırasında salgınlar izlemek için başarıyla uygulamaya konmuştur. Nükleik asit sıralama teknolojisindeki son gelişmeler tüm genom sıralama (WGS) patojenler bir klinik olarak dava açmak-çevresinde-zamanında hem teknik hem de ekonomik açıdan uygulanabilir yaptık. DNA sıralama patojen kimlik ve Mikrobiyoloji laboratuvarları14,15,16' istihdam karakterizasyonu diğer yöntemler üzerinde önemli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, yüksek işlem hacmi, hız ve kalite ile evrensel bir çözüm sağlar. Sıralama mikroorganizmaların için uygulanabilir ve yerel veya bölgesel laboratuarlarında ölçek ekonomileri sağlar. İkinci olarak, ulusal ve uluslararası düzeyde karşılaştırma için mükellef bir 'gelecek-proof' biçiminde veri üretir. Son olarak, WGS potansiyel yarar tıpta genel veri tabanları ek klinik ve epidemiyolojik meta veriler17 içeren eşdeğer veri tabanları için bağlı başvuru genleri içeren hızlı büyüme tarafından artar ,18.

Son yıllarda yapılan çalışmalarda WGS yarar antifungal direnç işaretleri Candida sppklinik yalıtır üzerinden tanımlaması için göstermiştir. 10 , 19 , 20. bu çoğunlukla yüksek-den geçerek benchtop sıralayıcılar, kurulan Biyoinformatik boru hatları ve21,22sıralama maliyeti azalan durumu nedeniyle olduğunu. Avantajı mantar WGS Sanger sıralama WGS sıralama birden çok genleri bir tek kaçak sağlanmıştır. Buna ek olarak, WGS Candida genleri roman mutasyonların uyuşturucu hedefleri belirlemek, genetik evrim ve klinik sıra türleri20,22,23ortaya çıkması izleyebilirsiniz. En önemlisi, içsel tedavisine direnç durumlarda, erken teşhis tedavi seçimi22,24önce direnç veriyor mutasyonların WGS yardımcı olabilir.

Burada, WGS etkin tarama antifungal ajanların farklı sınıflar için ilaç direnci ile ilgili mutasyonlar için fizibilite inceledi. Biz bir metodoloji WGS uygulanması son kullanıcı ve tanılama Mikoloji laboratuvar bakış açıları için mevcut. Biz üç üç ayrı klinik durumlarda hangi vitro echinocandins ve 5-flucytosine direnç antifungal tedavi aşağıdaki zaman içinde geliştirilen kültürlü çiftleri ayırmak bu analizde dahil.

Protokol

Etik onay bu çalışma için gerekli oldu.

1. alt kültür ve inoculum hazırlık Candida glabrata için

  1. Hangi de en az bir C. glabrata Amerikan tipi kültür koleksiyonu (ATCC) bilinen duyarlılık desenli içermelidir belirlenmesi için C.glabrata yalıtır panelini seçin.
  2. Alt kültür bir koloni dokunarak bir izole bir steril tek kullanımlık plastik döngü kullanarak ve'nın bir Sabouraud dekstroz agar (SDA) çizgiler plaka8.
  3. 24-48 h izole iyi büyüme ile saf kültür için 35 ° C'de SDA plaka kuluçkaya.

2. Antifungal duyarlılık tespiti

  1. 4-5 kolonileri yaklaşık 1 mm çapında taze subcultured C. glabrata almak için steril bir tek kullanımlık plastik döngü izole SDA plaka üzerinde kullanın. 3 mL steril distile su resuspend. De nazik tek tip süspansiyon elde etmek için pipetting tarafından karıştırın.
  2. 1 x 106 5 x 106 hücre/ml Densitometre 8kullanarak eşdeğeri olan 0.5 McFarland için hücre yoğunluğu ayarlayın.
  3. Ticari tahlil kullanarak duyarlılık testi yapmak (bkz: malzemeler tablo ve reaktifler) tüm C. glabrata üzerinde üretici talimatları izole ediyor. Sonuç MICs CLSI esaslarına göre antifungal ilaçların temel yalıtır duyarlılık yorumlayabilir ve rapor (tablo 1)8hazırlamak.

3. genomik DNA ekstraksiyon sıralama için

  1. 50 mm EDTA 1,5 mL tüp içinde 300 µL içinde bir loopful kolonileri taze yetişkin SDA plaka resuspend.
  2. Süspansiyon Tekdüzen olana zymolyase (10 mg/mL) 40 µL süspansiyon ve damlalıklı yavaşça 5 kez eklemek.
  3. Örnek 1-2 h hücre duvarı sindirimi için 37 ° C'de kuluçkaya. Oda sıcaklığında 5 min için serin.
  4. 14.000 × g 2 min için de süspansiyon santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant kaldır.
  5. Genomik DNA (tablo malzemeleri görmek) DNA ekstraksiyon kiti yönergeleri izleyerek ayıklayın.
  6. Resuspend 10 mm Tris arabellek (pH 7.5-8.5) kit ile sağlanan elüsyon tampon yerine 50 µL DNA Pelet ayıklanır.
  7. DNA saflık optik yoğunluğu (O.D) 260/280 nm25ölçümü tarafından kontrol edin.

4. genomik DNA miktar

  1. 1 x Floresans tahlil için üreticisinin yönergeleri dayalı tahlil kitinde sağlanan Tris EDTA (TE) arabelleği hazırlamak (tablo malzemeleri görmek).
  2. DNA örneği 2 µL 1 TE tahlil arabellek (son hacmi 100 µL, seyreltme faktörü 1:50) bir tek kullanımlık 96 iyi plaka x 98 µL ekleyerek sulandırmak. Bu seyreltme adım da kullanarak el ile bir çok kanallı pipet gerçekleştirilebilir veya otomatik sıvı iş istasyonu işleme tarafından.
  3. Lambda DNA sulandrarak standartları aralığını hazırlamak (100 µg/mL) Floresans tahlil Seti'nde (Tablo 2) sağlanan ve örnekleri ile birlikte ölçüm için içerir.
  4. DNA örnekleri ve reaksiyon için standartları için 100 µL floresan boya 100 µL seyreltilmiş ekleyin. Işıktan korunan oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  5. Tüm örneklerini üreticisinin yönergeleri dayalı Floresans ölçmek.
  6. Floresans okuma kullanarak standart eğri çizmek ve DNA örnekleri özgün konsantrasyonu hesaplayın.
  7. DNA ve 10 mM Tris arabellek (pH 8) hacmi 0,2 ng/µL için DNA toplama ayarlamak için eklenecek belirlemek.
  8. DNA dilutions otomatik sıvı iş istasyonu işleme kullanarak gerçekleştirin. Bu adımı da el ile pipetting tarafından elde edilebilir.

5. DNA Kütüphane hazırlık

Not: Kütüphane hazırlık ve sıralamanın gerçekleştirilen üreticinin iletişim kuralları ve şirket (şekil 1A) tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek (tablo malzemeleri görmek).

  1. Tagmentation ve PCR güçlendirme
    1. Yeni bir 96-şey sert kabuklu ince duvar tabağı etiketleyin.
    2. 5 µL quantified giriş DNA 0.2 ng/µL ekleyin (1 Toplam ng) plaka de her örneği için.
    3. Tagmentation arabellek 10 µL ve amplifikasyon arabelleği 5 µL de içeren her DNA ekleyin ve karışımı yavaşça pipet. Plaka ile bir yapışkan plaka mühür mühür.
    4. Plaka bir termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 5 min ve tutun 10 ° C'de 55 ° C Örnek 10 ° C ulaştığında hemen etkisiz hale getirmek için devam edin.
    5. 5 µL nötralizasyon arabelleği amplicon reaksiyon nötralize etmek için plaka ekleyin ve hafifçe karıştırın pipet. Plaka mühür ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. 15 µL PCR mastermix örnekleri için dizin ekleyin.
    7. Böylece her örnek dizin şablonu (Tablo 3) temel alan dizinler benzersiz bir kombinasyonu alır dizin astar tüpleri kullanılabilir bir kutu 96-şey plaka biçimi bir kurulum için kullanın.
    8. Tablo 3 şablonunda sağlanan sıra kullanarak dizin astar tüpler dizin plaka rafa (şekil 1B) düzenlemek ve endeksler şablonu konumunu kaydetmek.
    9. Tagmentation plaka ile eklenen PCR mastermix dizin plaka raf dizin tüpler sırayla yerleştirin.
    10. Dizin astar 1 tüplerde dikey düzenleme ve dizin astar 2 tüpler yatay düzenleme dizin rafa koymak. Bir çok kanallı pipet kullanarak, her örnek için dizin astar 5 µL dikkatle ekleyin.
    11. Dizin tüplerinin eski kapaklar endeksleri arasında çapraz bulaşma önlemek için yeni kapaklar ile değiştirin.
    12. 96-şey açık plaka tutkal kullanarak plaka mühür ve ikinci PCR aşağıdaki gibi yapın: 30 95 ° C s, 12 devredir 10 95 ° c s, 30 55 ° C s, 30 72 ° C s ve 5 min için 72 ° C.
  2. PCR Temizleme
    1. PCR ürünü derin-şey plaka tagmentation plakasına PCR-temizlik için transfer (tablo malzemeleri görmek).
    2. Girdap ticari manyetik boncuklar çözüm üretici yönergelerine dayanarak (tablo malzemeleri görmek) ve derin-şey plaka her PCR ürünü 30 µL boncuk ekleyin.
    3. Plaka 2 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve oda sıcaklığında 5 dk'ya sallayarak olmadan kuluçkaya.
    4. Süpernatant temizledi kadar 2 min için manyetik bir stand plaka koyun.
    5. Süpernatant dikkatle hala manyetik stand üzerinde plaka ile atmak.
    6. Plaka ile taze hazırlanmış %80 etanol 200 µL manyetik kürsüye ekleyin.
    7. Plaka 30 için manyetik stand üzerinde kuluçkaya s ve dikkatle kaldırmak ve süpernatant boncuk bozmadan.
    8. Tekrar yıkama adımı yineleyin ve boncuk varsa 15 dk. Kaldır aşırı etanol için kurumasını bekleyin.
    9. Plaka manyetik standından kaldırın ve resuspension arabelleği 52,5 µL boncuk için ekleyin.
    10. Plaka 2 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve sallayarak olmadan, oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
    11. Plaka manyetik kürsüye yerleştirin ve temizlemek süpernatant sağlar.
    12. Bir çok kanallı pipet kullanarak, dikkatle süpernatant ile 50 µL Temizleme plaka yeni bir sert kabuklu tabağa aktarın.
  3. Kütüphane normalleştirme
    1. Kütüphane normalleştirme reaktifler (tablo malzemeleri görmek) Üretici esaslarına göre çözülme.
    2. 20 µL süpernatant ile Temizleme plaka yeni bir derin-şey tabağa aktarın.
    3. Manyetik boncuk süspansiyon, 45 µL ekleyin ve bir plaka mühürleyen ile plaka mühür.
    4. Plaka üzerinde 30 dk için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker sallamayın. Bu kuluçka süresi kritik ve aşılmaması gereken.
    5. Plaka 2 min için manyetik bir stand yerleştirin ve süpernatant (şekil 1B) işaretli doğrulayın.
    6. Kaldırmak ve süpernatant hala manyetik stand üzerinde plaka ile bir uygun tehlikeli atık kapsayıcısında atın.
    7. Manyetik standından plaka kaldırmak ve boncuk 45 µL yıkama arabelleği ile yıkayın.
    8. Yıkama arabellek ile plaka 5 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker sallamayın.
    9. Zaman açık döner levha 2 dk ve atma süpernatant için manyetik stand yerleştirin.
    10. Manyetik standından plaka kaldırmak ve yıkama yıkama arabellek ile tekrar tekrar.
    11. Plaka manyetik standından kaldırın ve 0.1 N NaOH 30 µL ekleyin.
    12. 0.1 N NaOH ile plaka 5 min için 1800 devirde bir Mikroplaka shaker çalkalanır ve plaka 2 dk ya da sıvı temizlenene kadar manyetik mahkemeye yerleştirin.
    13. 30 µL elüsyon arabelleği yeni bir 96-şey sert kabuklu ince duvar son normalleştirilmiş Kütüphane tabak her şey için ekleyin.
    14. 30 µL süpernatant, normalleştirme tabaktan son hacim 60 µL yapmak için son normalleştirilmiş Kütüphane plakasına aktarın. Kitaplıkları artık sıralı hazırsınız.
  4. DNA Kütüphane konsantrasyonu tayini qPCR tarafından
    1. Mastermix, astar ve qPCR seti (tablo malzemeleri görmek) Üretici esaslarına göre sağlanan standartları çözülme.
    2. PCR reaktif mastermix ve astar üreticisinin yönergeleri izleyerek qPCR Seti'nde sağlanan birleştirmek ve aliquots-20 ° C'de depolanan
    3. DNA Kütüphane konsantrasyonu belirlemek için 1/8000 seyreltme 1:80 seyreltme (158 µL Tris arabelleğine 1: 100 den 2 µL) ardından bir 1: 100 seyreltme (1,5 µL DNA kitaplığına 148,5 µL Tris arabellek) gerçekleştirerek 10 mM Tris tampon (pH 8) kullanarak DNA kütüphanelerinin olun.
    4. 14000 × g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve en az 1 dk. için 700 RPM seyreltme plaka sallamak.
    5. Son PCR reaksiyon 20 µL 4 µL seyreltilmiş DNA kütüphane veya DNA standartları ve mastermix 16 µL karıştırarak hazırlayın.
    6. Thermocycler ayarlarında üretici takip PCR gerçekleştirmek: 5 min, 95 35 döngüleri için 95 ° C ° C-30 ve 60 ° C için 45 s ve son 65 ° C ila 95 ° C eritebilir eğrisi analizi için için.
    7. Örnek DNA kütüphaneleri ve standartları Ct değerleri qPCR thermocycler edinin.
    8. Standart bir eğri standartları (Şekil 2) Ct değeri oluşturur. Üst ve alt QC aralığı ± tarafından ortalama üzerinden 3 kür tanımlayın. Örneğin, Ct değeri ortalama 13 döngüleri ise QC aralığı 16 ve 10 döngüleri arasında olur.
    9. Standart eğri ve Ct değerleri bireysel ve ortalama kitaplığına konsantrasyonları (ALC) belirlemek.
    10. Toplam havuza alınan kütüphaneler (PAL) kullanılmak üzere hacmi son sıralama hedef kitaplığı konsantrasyon 1.4 - 1.20: arasında olduğunu düşünürsek için aşağıda verilen hesaplama dayalı olmadığını.
      Not: Ortalama qPCR elde edilen Kütüphane konsantrasyon ALC; = Toplam havuza alınan kütüphaneler (PAL) ALC = / 2; Denatüre PAL (DAL) PAL = * 0,666
      Arabellek ile karışık DAL hacmine bağlı olarak, akış hücreye eklemek için kütüphane bölgedir. 65 µL kitaplığının arabelleği 835 µL eklediyseniz, örneğin, daha sonra bu seyreltme (Dil 1) 195 toplam hacmi 1300 µL için eklenir: (65/900) * dnPAL Dil1 =
      Dil1 * (195/1300) son konsantrasyonu (1.4 - 1.20: arasında olmalı) =

6. Kütüphane havuz ve Benchtop sıralayıcıdaki Initiating sıralama

  1. Tezcan reaktif kartuşu üreticisinin esaslarına göre. 4 ° C depolama ambalajından yeni akışı hücreden çıkar ve oda sıcaklığında en az 30 dk önce sıralama getirmek. Arabellek kartuş ve prechill sıralama tampon kullanmadan önce çıkarın (bkz. tablo malzeme).
  2. Denetim Kitaplığı Kütüphane 5 µL karıştırarak hazırlayın (1 nM) ve 0.2 N NaOH 5 µL. Kısaca girdap ve Denetim Kitaplığı tek iplikçikler halinde denatüre için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  3. 200 mM Tris-HCl, pH 7 ve girdap 5 µL ekleyin. 235 µL prechilled sıralama arabellek ekleyin ve karışımı yavaşça. Toplam birim Denetim Kitaplığı son konsantrasyon 20 ile 250 µL değil am.
  4. Son normalleştirilmiş Kütüphane plaka bir tek düşük bağ 1.5 mL tüp sıralı için her örnek kitaplık 5 µL aktarma tarafından DNA kitaplıkları Havuzu.
  5. Havuza alınan kitaplığının 30 µL ve başka bir düşük bağlama tüp kitaplıklarda denatüre için 0.2 N NaOH 30 µL ekleyin.
  6. Girdap düşük bağ tüp ve kitaplıkları tek iplikçikler halinde denatüre için oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
  7. 200 mm Tris-HCl, pH 7 Tube tepki nötralize etmek için denatüre kütüphaneler ile 30 µL ekleyin.
  8. 65 µL etkisiz denatüre kitaplıkları süspansiyon ve önceden soğutulmuş sıralama arabellek ve girdap karıştırın 835 µL ekleyin.
  9. Şu son düşük bağlama tüpte birleştirmek: 195 µL etkisiz denatüre kitaplıkları, Denetim Kitaplığı ve sıralama arabelleği 1103.70 µL 1.30 µL. Düzgün karıştırın.
  10. Reaktif kartuşu belirlenen yerinde içine son Kütüphane mix (1300 µL) yükleyin.
  11. Set-up Sequencer proje ve örnek ayrıntıları girerek çalıştırmak sıralama yönergeleri izleyerek Web sitesi özel içilir.
  12. Yönergeleri izleyerek başlatın sıralama. Yük akımı hücre, reaktif kartuşu kitaplıklarla ve arabellek kartuş benchtop sıralayıcıdaki.
  13. Toplu iş numaraları tüm reaktif kitleri ve sıralama içinde kullanılan kartuşu kaydedin.

7. veri sıralama Web sitesinden indirin

  1. Sitede verilen üretici talimatları FASTQ dosyaları indirmek.
  2. İyi bir kalite kontrol için yüzde Q30 ≥ % 75 ve küme yoğunluğu ile 170-280 K/mm2 arasında olduğunu en iyi 200-210 K/mm2 (Tablo 4).

8. sıralama veri analizi

  1. FASTQ dosyaları sıralı örnek veri çözümleme entegre yazılım paketi almak (tablo malzemeleri görmek).
  2. Başvuru (select başvuru genom) eşleme, yerel yeniden düzenlenmesi ve varyant analizi (şekil 3A) ayarları kullanarak listelenen tablo 5'te, yani düzeltme listesinden özellikler ekleyerek yazılımında sıralama iş akışı oluşturun.
  3. İş akışı tek bir örnek veya örnek FASTQ dosyaları toplu seçerek çalıştırın ve belirlenen örnek klasörlerde çıktı dosyalarını kaydetmek.
  4. Rapor sırası kapsama derinlik, eşlenen bölgeler ve yapısal değişik listesi için genom (şekil 3B) oluşturun.
  5. Eşanlamlı olmayan tek nükleotid polimorfizmleri (SNPs) direnç ve virülans veriyor genlerdeki aramak için yapısal varyantları listesini kullanın.
  6. Rapor SNP konumu, gen ve dayanıklı veya duyarlı yalıtır (tablo 6) sayısı listeleyerek hazırlayın.

Sonuçlar

Onüç C. glabrata C. glabrata ATCC 90030 ve 12 yalıtır (izole CMRL1 CMRL12 için) klinik Mikoloji başvuru laboratuvarından oluşan, Westmead hastane, Sydney inceledi (tablo 1). Bu CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 ve CMRL-5/CMRL-6 elde önce ve sonra aralarında epidemiyolojik hiçbir bağlantıları ile antifungal tedavi yalıtır üç çift dahil 24 (tablo 1).

Mikrofonlar CLSI yorumsa...

Tartışmalar

Bu çalışmada, fizibilite, yaklaşık zaman çizelgeleri ve hassas WGS-güdümlü algılama C. glabratailaç direnci belirledi. Kütüphane hazırlık ve sıralama gerçekleştirme süresi (TAT) dört gün ve raporlama analiz sonuçları iki gün oldu. Bu kültür plakaları ve Sanger duyarlılık deneyleri için benzer en az bir miktar TAT ile karşılaştırır anlamlı olarak daha yüksek sayıda örnekleri sıralama. Yaklaşık 30-90 C. glabrata genleri hücre içi akış kapasitesi, 80-%100 sıra...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının ve hiçbir çıkar çatışması ifşa etmek hakkına sahiptir.

Teşekkürler

Bu eser enfeksiyon hastalıkları ve Mikrobiyoloji, halk sağlığı Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar bu çalışma için diğer bir fon almadım. Yazarlar Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann ve Ranjeeta Menon onların uzman tavsiyesi ve tüm genom sıralama deney ile yardım için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

Referanslar

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 130Candida glabratat m genom s ralamaantifungal ila direnciechinocandinsazoles5 flucytosinegenom geni analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır