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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Studie implementiert kompletten Genoms für die Analyse von Mutationen in Genen konferieren antimykotische Resistenzen in Candida Glabrata. Resistent gegen Echinocandine, Azole und 5-Flucytosine, C. Glabrata Isolate wurden sequenziert, um die Methodik zu veranschaulichen. Profile der Anfälligkeit der Isolate korreliert mit Vorhandensein oder Fehlen von spezifischen Mutation Muster in den Genen.

Zusammenfassung

Candida Glabrata erwerben rasch Mutationen, die zu Resistenzen, vor allem Azole und Echinocandine führen. Identifizierung von genetischen Mutationen ist wichtig, da Widerstand erkannt, dass in-vitro- oft mit klinischen Versagen korreliert werden können. Wir untersuchten die Machbarkeit der Verwendung von kompletten Genoms (WGS) für genomweite Analyse von Antimykotika Resistenzen in C. Glabrata. Das Ziel war Torecognize Enabler und Hindernisse bei der Umsetzung WGS und seine Effektivität zu messen. Dieses Papier beschreibt die wichtigsten Qualitätskontrolle Checkpoints und wesentliche Bestandteile der WGS Methodik, genetische Marker, die mit verringerte Empfänglichkeit gegenüber Antimykotika zu untersuchen. Er schätzt auch die Genauigkeit der Datenanalyse und Zug-um-Zeit der Erprobung.

Phänotypische Anfälligkeit von 12 klinische und ein ATCC Stamm von C. Glabrata wurde durch antimykotische Empfindlichkeitsprüfungen ermittelt. Diese enthalten drei isolieren Paare aus drei Patienten, die Anstieg der Droge minimalen inhibitorischen Konzentration entwickelt. Zwei Paare die zweite jedes Paar entwickelt Resistenz gegen Echinocandine isolieren. Das zweite Isolat des dritten Paares entwickelt Resistenz gegen 5-Flucytosine. Die restlichen bestehend anfällig und Azole resistente Isolate. Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in Verbindung mit Echinocandin, Azole und 5-Flucytosine Widerstand Gene wurden in resistenten Isolate durch WGS mit der nächsten Generation-Sequenzierung bestätigt.  Non-Synonyme SNPs in antimykotische Widerstand Gene wie FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 und FCY2 wurden identifiziert. Alles in allem, durchschnittlich 98 % des WGS lautet C. Glabrata Isolate auf das Referenz-Genom mit ca. 75-fold lesen Sie Tiefe Abdeckung abgebildet. Die Turnaround-Zeit und die Kosten waren vergleichbar mit Sanger Sequenzierung.

Zusammenfassend war WGS von C. Glabrata möglich bei der Aufdeckung klinisch signifikanten Genmutationen, die Resistenz gegen verschiedene Antimykotika Medikamentenklassen ohne die Notwendigkeit für mehrere PCR/DNA Sequenzierung Reaktionen beteiligt. Dies ist einen positiven Schritt hin zu WGS Fähigkeit im klinischen Labor für simultane Detektion von Antimykotika Widerstand Verleihung Substitutionen.

Einleitung

Candida Glabrata ist eine zunehmend auftretende Erreger mit Bedeutung als eine Art, der Widerstand der azole sowie in jüngerer Zeit, die Echinocandine1,2,3aufweist. Im Gegensatz zu den diploiden C. Albicanskönnen die haploide Genom von C. Glabrata Mutationen zu erwerben und entwickeln Multi-Resistenzen leichter. Co-Resistenz an beide Substanzklassen wurde auch berichtet,4. Daher ist frühzeitige Bewertung der pilzbefallverhütende Anfälligkeit und Erkennung von Resistenzen in C. Glabrata entscheidend für die richtige und gezielte Therapie sowie im Zusammenhang mit Antimykotika Treuhandschaft, Fahrer von Antibiotikaresistenzen1 zu begrenzen , 5 , 6. Gründung einen effizienten Workflow, schnell zu erkennen, das Vorhandensein von bestätigenden Mutationen verbunden mit Widerstand Biomarker in resistenten Isolate werden auch Entscheidungen zur Verbesserung der Verschreibung und klinische Ergebnisse.

Pilzbefallverhütende Anfälligkeit bemisst sich in der Regel durch die Messung der minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) definiert als die niedrigste Wirkstoffkonzentration, die Ergebnisse in einer signifikanten Reduktion Wachstum eines Mikroorganismus im Vergleich zu einem drogenfreien Wachstum Kontrolle. Klinische und Labor Standards Institute (CLSI) und European Committee auf antimikrobielle Empfindlichkeit Testing (EUCAST) haben standardisierte Anfälligkeit Prüfmethoden um MIC Bestimmung, präzise und konsistente7, 8. Bleibt jedoch das Dienstprogramm antimykotische MIC begrenzt, vor allem für die Echinocandine, insbesondere in Bezug auf laborübergreifenden Vergleiche wo sind unterschiedliche Methoden und Bedingungen verwendeten9. Es gibt auch unsicher Korrelation von Mikrofonen mit Reaktion auf Echinocandin Behandlung und Unfähigkeit WT zu unterscheiden (oder anfällig) Isolate von denen beherbergen FKS Mutationen (Echinocandin-resistente Stämme)10,11. Trotz der Verfügbarkeit von bestätigenden Single-gen PCRs und Sanger Sequenzierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern, Realisierung der Ergebnisse ist oft verzögert aufgrund mangelnder simultane Detektion von mehreren Widerstand Markierungen5,12. Gleichzeitige Erfassung von Widerstand konferieren Mutationen an verschiedenen Orten im Genom, aktiviert durch die gesamte Genom-Sequenzierung basierende Analyse bietet somit erhebliche Vorteile gegenüber aktuellen Ansätzen.

Gesamte Genom-Sequenzierung (WGS) wurde erfolgreich umgesetzt, um die Übertragung von Krankheiten während der Ausbrüche als auch einen Ansatz zur genomweiten Risiko Bewertung und Resistenz in Bakterien und Viren13Tests zu verfolgen. Jüngste Fortschritte in der Technologie der Nukleinsäure-Sequenzierung unternommen des kompletten Genoms (WGS) von Krankheitserregern in einen klinisch verwertbare Zug-um-Time technisch und wirtschaftlich machbare. DNA-Sequenzierung bietet wichtige Vorteile gegenüber anderen Methoden der Erreger Identifizierung und Charakterisierung in Mikrobiologie Labors14,15,16beschäftigt. Erstens bietet es eine universelle Lösung mit hohem Durchsatz, Schnelligkeit und Qualität. Sequenzierung kann auf alle Mikroorganismen angewendet werden und ermöglicht Skaleneffekte auf lokaler oder regionaler Laboratorien. Zum anderen produziert sie Daten in einem "zukunftssicher" Format zugänglich Vergleich nationaler und internationaler Ebene. Schließlich hat der potenzielle Nutzen von WGS in der Medizin ergänzt durch das rasante Wachstum der öffentlichen Datenbanken mit Referenz Genome, die entsprechende Datenbanken verknüpft werden können, die zusätzliche klinische und epidemiologische Metadaten17 enthalten ,18.

Jüngsten Studien belegen den Nutzen der WGS zur Identifizierung von Antimykotika Antibiotikaresistenz-Markern von klinischen Isolaten von Candida Spp. 10 , 19 , 20. Dies ist vor allem aufgrund der Verfügbarkeit von Hochdurchsatz-Benchtop-Sequenzer, etablierten Bioinformatik Rohrleitungen und sinkenden Kosten der Sequenzierung21,22. Der Vorteil von Pilz WGS über Sanger-Sequenzierung ist, dass WGS Sequenzierung mehrere Genome auf einem einzigen Lauf ermöglicht. Darüber hinaus können WGS von Candida Genomen Roman Mutationen im Drogeziele zu identifizieren, verfolgen Sie genetische Entwicklung und Entstehung von klinisch relevanten Sequenztypen20,22,23. Im Falle einer intrinsischen multidrug-Resistenz helfen WGS vor allem bei der Früherkennung von Widerstand konferieren Mutationen vor Behandlung Auswahl22,24.

Hier untersuchten wir die Machbarkeit der WGS-fähigen Screening auf Mutationen im Zusammenhang mit Resistenzen auf verschiedene Klassen von Antimykotika. Wir präsentieren eine Methodik für die Durchführung der WGS von End-User und Diagnose Mykologie Labor Perspektiven. Wir enthalten in dieser Analyse, dass drei Paare aus drei separaten klinische Fälle in die in-vitro- Widerstand gegen die Echinocandine und 5-Flucytosine entwickelt im Laufe der Zeit nach antimykotische Behandlung kultiviert zu isolieren.

Protokoll

Es bedurfte keine ethischen Genehmigung für diese Studie.

(1) Subkultur und Inokulum Vorbereitung auf Candida glabrata

  1. Wählen Sie eine Schalttafel C.glabrata Isolate untersucht werden, auch mindestens ein C. Glabrata American Art Kultur Sammlung (ATCC) mit bekannten Anfälligkeit Muster umfassen sollte.
  2. Subkultur Isolat durch Berühren einer einzigen Kolonie mit einer sterilen Einweg-Kunststoff-Schleife und Streifen auf einem Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) Platte8.
  3. Inkubieren Sie die SDA-Platte für 24-48 h bei 35 ° C für Isolat mit gutem Wachstum in Reinkultur.

2. Bestimmung der pilzbefallverhütende Anfälligkeit

  1. Verwendung eine sterile Einweg Kunststoff Schleife um 4-5 Kolonien von etwa 1 mm Durchmesser aus einem frisch subcultured C. Glabrata isolieren auf SDA-Platte. In 3 mL sterilem destilliertem Wasser Aufschwemmen. Mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um homogene Suspension zu erhalten.
  2. Passen Sie die Zelldichte, 0,5 McFarland, 1 x 106 , 5 x 106 Zellen/mL mit einem Densitometer 8entspricht.
  3. Anfälligkeitstests mit kommerziellen Assay durchzuführen (siehe Tabelle der Werkstoffe und Reagenzien) auf alle C. Glabrata isoliert nach Anweisungen des Herstellers. Interpretieren Sie die Anfälligkeit der Isolate basierend auf daraus resultierende MICs von Antimykotika nach CLSI Richtlinien zu und bereiten Sie Bericht (Tabelle 1)8.

(3) genomische DNA-Extraktion für die Sequenzierung

  1. Aufschwemmen Sie eine Impföse Kolonien von einer frisch gewachsenen SDA-Platte in 300 µL 50 mM EDTA in der 1,5 mL Tube.
  2. Hinzu kommen 40 µL Zymolyase (10 mg/mL) die Aussetzung und sanft Pipettieren 5 Mal bis Aussetzung einheitlich ist.
  3. Inkubation der Probe bei 37 ° C für ca. 1-2 h, die Zellwand zu verdauen. Bei Raumtemperatur für 5 min abkühlen.
  4. Zentrifugieren Sie die Federung bei 14.000 × g für 2 min und dann entfernen Sie vorsichtig den überstand.
  5. Genomischen DNA DNA-Extraktion Kit Richtlinien (siehe Tabelle der Materialien) zu extrahieren.
  6. Aufschwemmen extrahiert DNA-Pellet in 50 µL 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5-8,5) anstelle der Elution Puffer im Kit enthalten.
  7. Überprüfen Sie die Reinheit der DNA durch Messung der optischen Dichte (O.D) um 260/280 nm25.

4. genomische DNA Quantifizierung

  1. Bereiten Sie eine 1 x Tris-EDTA (TE) Puffer im Assay Kit enthalten basierend auf Richtlinien des Herstellers für die Fluoreszenz-Assay (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Verdünnen Sie die DNA-Probe durch Zugabe von 2 µL bis 98 µL 1 x TE-Assay-Puffer (Endvolumen von 100 µL, Verdünnung Faktor 01:50) in eine Einweg-96-well-Platte. Dieser Verdünnungsschritt kann entweder manuell über einen Mehrkanal-Pipette durchgeführt werden oder durch automatisierte Handhabung Workstation Flüssigkeit.
  3. Bereiten Sie das Spektrum der Normen durch Verdünnung der Lambda DNA (100 µg/mL) im Fluoreszenz-Assay Kit enthalten (Tabelle 2) und sind für die Messung zusammen mit Proben.
  4. Fügen Sie 100 µL der Fluoreszenzfarbstoff zu 100 µL DNA-Proben und Standards für die Reaktion verdünnt. Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt werden.
  5. Messung der Fluoreszenz aller Proben anhand der Anweisungen des Herstellers.
  6. Plot der Standardkurve mit der Fluoreszenz-Lesungen und berechnen Sie die ursprüngliche Konzentration der DNA-Proben.
  7. Bestimmen Sie die Lautstärke von DNA und 10 mM Tris-Puffer (pH 8) hinzugefügt werden, die DNA-Konzentration auf 0,2 ng/µL einzustellen.
  8. Führen Sie die DNA-Verdünnungen mit automatisierten Flüssigkeit Umgang mit Workstation aus. Dieser Schritt kann auch durch manuelle Pipettieren erreicht werden.

(5) DNA-Bibliothek Vorbereitung

Hinweis: Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung erfolgte nach Herstellerangaben Protokolle und Richtlinien von Unternehmen (Abb. 1A) zur Verfügung gestellt (siehe Tabelle der Materialien).

  1. Tagmentation und PCR-Amplifikation
    1. Beschriften Sie eine neue 96-Well Hartschalen dünne Wand Platte.
    2. Hinzufügen von 5 µL der quantifizierten Eingabe DNA auf 0,2 ng/µL (1 ng insgesamt) zu jeder Probe gut der Platte.
    3. Jeder gut mit DNA 10 µL Tagmentation-Puffer und 5 µL Puffer Verstärkung hinzu und pipette vorsichtig mischen. Dichtplatte mit einer Haftplatte Dichtung.
    4. Die Platte in einem Thermocycler und führen Sie das folgende PCR-Programm: 55 ° C für 5 min und halten bei 10 ° C. Wenn die Probe 10 ° C erreicht, gehen Sie sofort zu neutralisieren.
    5. Die Platte, die Amplifikate Reaktion zu neutralisieren 5 µL der Neutralisation Puffer hinzu, und pipette vorsichtig mischen. Die Dichtplatte und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    6. Fügen Sie 15 µL der Indizierung PCR Mastermix zu Proben.
    7. Verwenden Sie einen Karton Index Grundierung Röhren zur Verfügung für eine Einrichtung von 96-Well-Plattenformat, so dass jede Probe eine einzigartige Kombination von Indizes basierend auf Index der Vorlage (Tabelle 3 wird).
    8. Index Grundierung Röhren im Index Tellerhalter (Abbildung 1B) unter Verwendung der in der Vorlage auf Tabelle 3 angegebenen Reihenfolge ordnen und die Stellung der Indizes auf der Vorlage aufnehmen.
    9. Legen Sie die Tagmentation Platte mit zusätzlichen PCR Mastermix auf die Tellerhalter Index mit der Index-Rohre in Ordnung.
    10. Setzen Sie Index-Primer 1-Röhren in vertikaler Anordnung und Index Grundierung 2 Röhren in horizontale Anordnung auf dem Index-Rack. Mit einer Mehrkanal-Pipette, sorgfältig fügen Sie 5 µL Index Zündkapseln jede Probe hinzu.
    11. Ersetzen Sie alte Kappen der Index Röhren mit neuen Kappen um Kreuzkontaminationen zwischen Indizes zu vermeiden.
    12. Die Dichtplatte mit klaren 96-Well Platte Versiegelungen und die zweiten PCR wie folgt durchführen: 95 ° C für 30 s, 12 Zyklen von 95 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s und 72 ° C für 5 Minuten.
  2. PCR-Bereinigung
    1. Das PCR-Produkt für die PCR-Bereinigung, von der Tagmentation-Platte, eine Deep-Well-Platte zu übertragen (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Wirbel der kommerziellen magnetische Beads-Lösung (siehe Tabelle der Materialien) basierend auf Angaben des Herstellers und jeder PCR-Produkt in Deep-Well-Platte 30 µL Perlen hinzufügen.
    3. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 2 min und ohne Schütteln für 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Legen Sie die Platte auf ein Magnetstativ für 2 min bis der Überstand abgeklungen.
    5. Den Überstand vorsichtig mit der Platte noch auf die Magnetstativ zu verwerfen.
    6. Fügen Sie 200 µL von frisch zubereiteten 80 % Ethanol mit der Platte auf die Magnetstativ.
    7. Inkubieren Sie die Platte auf die Magnetstativ für 30 s und sorgfältig entfernen und entsorgen den Überstand ohne zu stören die Perlen.
    8. Der Waschschritt wiederholen und die Perlen 15 min. entfernen überschüssige Ethanol ggf. an der Luft trocknen lassen.
    9. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und die Perlen fügen Sie 52,5 µL Wiederfreisetzung Puffer hinzu.
    10. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 2 min und ohne Schütteln bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren.
    11. Legen Sie die Platte auf die Magnetstativ und erlauben des Überstands zu löschen.
    12. Transfer mit einer Mehrkanal-Pipette, sorgfältig 50 µL des Überstands von der Bereinigung-Platte auf eine neue Hartschalen-Platte.
  3. Bibliothek-Normalisierung
    1. Tauen Sie Bibliothek Normalisierung Reagenzien gemäß Richtlinien des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien).
    2. Übertragen Sie 20 µL des Überstands von der Bereinigung Platte auf einen neuen Deep-Well-Platte.
    3. Fügen Sie 45 µL magnetischer Wulst Suspension und Dichtplatte mit einer Platte-Versiegelung.
    4. Schütteln Sie die Platte auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 30 min. Diese Inkubationszeit ist entscheidend und sollte nicht überschritten werden.
    5. Legen Sie die Platte auf einem Magnetstativ für 2 min und bestätigen Sie, dass der Überstand (Abbildung 1B) gelöscht hat.
    6. Entfernen und entsorgen des Überstands in einem entsprechenden Sondermüll-Behälter mit der Platte noch auf die Magnetstativ.
    7. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und waschen Sie die Perlen mit 45 µL Waschpuffer.
    8. Schütteln Sie die Platte mit Waschpuffer auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 5 min.
    9. Stellen Sie Platte auf Magnetstativ für 2 min und überstand verwerfen, wenn es klar wird.
    10. Entfernen Sie die Platte aus der magnetischen stehen und wiederholen Sie das Waschen mit Waschpuffer.
    11. Entfernen Sie die Platte aus dem Magnetstativ und fügen Sie 30 µL von 0,1 N NaOH hinzu.
    12. Schütteln Sie die Platte mit 0,1 N NaOH auf einer Mikrotestplatte Shaker bei 1800 u/min für 5 min und legen Sie die Platte auf Magnetstativ 2 min. lang oder bis die Flüssigkeit klar ist.
    13. Jede Vertiefung einer neuen 96-Well Hartschalen dünnwandige endgültige normalisierte Bibliothek Platte 30 µL Elution Puffer hinzufügen.
    14. Übertragen Sie 30 µL des Überstands von Normalisierung Platte auf endgültige normalisierte Bibliothek Teller Endvolumen 60 µL zu machen. Die Bibliotheken sind jetzt bereit, sequenziert werden.
  4. Bestimmung der DNA-Bibliothek Konzentration von qPCR
    1. Tauen Sie den Mastermix, Primer und Standards in der qPCR-Kit nach Herstellerangaben (siehe Tabelle der Materialien) zur Verfügung gestellt.
    2. Kombinieren Sie die PCR Reagenz Mastermix und Grundierung mitgelieferten qPCR nach Anweisungen des Herstellers und Aliquote können bei-20 ° c gelagert werden
    3. Um die DNA-Bibliothek-Konzentration zu bestimmen, stellen Sie eine Verdünnung von 1/8000 von den DNA-Bibliotheken mit 10 mM Tris-Puffer (pH 8) durch die Durchführung einer Verdünnung von 1: 100 (1,5 µL DNA-Bibliothek auf 148,5 µL Tris-Puffer), gefolgt von einer Verdünnung von 1: 80 (2 µL von 1: 100 auf 158 µL Tris-Puffer).
    4. Die Verdünnung Platte bei 700 u/min für mindestens 1 Minute schütteln und dann bei 14000 × g für 1 min zentrifugieren.
    5. Bereiten Sie 20 µL der letzten PCR-Reaktion durch Mischen von 4 µL verdünnter DNA-Bibliothek oder DNA-Standards und 16 µL Mastermix vor.
    6. Führen Sie folgenden Einstellungen des Herstellers im Thermocycler PCR: 95 ° C für 5 min, 35 Zyklen von 95 ° C für 30 s und 60 ° C für 45 s und endgültige 65 ° C bis 95 ° C für Schmelze Kurvenanalyse.
    7. Erhalten Sie die Ct-Werte der Probe DNA-Bibliotheken und Standards von qPCR Thermocycler.
    8. Generieren Sie eine Standardkurve aus den Ct-Wert von Standards (Abbildung 2). Definieren Sie den oberen und unteren QC-Bereich von ± 3 Zyklen vom Mittelwert. Beispielsweise ist der Mittelwert Ct Wert 13 Zyklen ist dann der QC-Bereich zwischen 16 und 10 Zyklen.
    9. Die individuelle und durchschnittliche Bibliothek-Konzentrationen (ALC) aus der Standardkurve und Ct-Werte zu bestimmen.
    10. Bestimmen Sie das Volumen der gesamten gepoolten Bibliotheken (PAL) verwendet werden anhand der Berechnung, die unten gegeben werden, für die endgültige Sequenzierung, wenn man bedenkt, dass Zielkonzentration Bibliothek zwischen 1,4-13:08.
      Hinweis: Bibliothek-Konzentration von qPCR erhalten im Durchschnitt = ALC; Gepoolte Bibliotheken (PAL) Gesamt = ALC / 2; Denaturiert PAL (DAL) = PAL * 0.666
      Je nach der Anzahl von DAL, der mit Puffer gemischt wird, ist die Konzentration der Bibliothek hinzugefügt werden, der Messzelle. Zum Beispiel wenn 835 µL Puffer 65 µL der Bibliothek hinzugefügt wird, dann von dieser Verdünnung (Dil 1) 195 wird hinzugefügt auf ein Gesamtvolumen von 1300 µL: (65/900) * DnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = Endkonzentration (sollte zwischen 1,4-13:08)

6. Bibliothek pooling und initiieren Sequenzierung im Benchtop-Sequenzer

  1. Tauen Sie Reagenzkassette nach Richtlinien des Herstellers. Nehmen Sie eine neue Messzelle aus der Packung von 4 ° C Lagerung und bringen auf Raumtemperatur mindestens 30 min vor der Sequenzierung. Puffer-Patrone und prechill Sequenzierung Puffer vor dem Gebrauch herausnehmen (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Bereiten Sie eine Steuerelementbibliothek durch Mischen 5 µL der Bibliothek (1 nM) und 5 µL 0,2 N NaOH. Vortex kurz und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur auf der Steuerelementbibliothek in Einzelstränge zu denaturieren.
  3. Fügen Sie 5 µL 200 mM Tris-HCl, pH 7 und Wirbel. 235 µL prechilled Sequenzierung Puffer hinzufügen und vorsichtig mischen. Das Gesamtvolumen beträgt 250 µL mit Kontrolle Bibliothek Endkonzentration um 20 Uhr.
  4. Pool DNA-Bibliotheken durch die Übertragung von 5 µL jedes Sample-Library von der endgültigen normalisierte Bibliothek-Platte in ein einzelnes Low-Bind 1,5 mL Röhrchen sequenziert werden.
  5. Fügen Sie 30 µL der gepoolten Bibliothek und 30 µL 0,2 N NaOH zu Bibliotheken in einem anderen niedrigen Bind Gefäß zu denaturieren.
  6. Wirbel der niedrig-Bind tube und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur zu Bibliotheken in Einzelstränge zu denaturieren.
  7. Fügen Sie 30 µL 200 mM Tris-HCl, pH 7 und Rohr mit denaturierten Bibliotheken Reaktion zu neutralisieren.
  8. Fügen Sie 65 µL neutralisierte denaturierten Bibliotheken Suspension und 835 µL vorgekühlt Sequenzierung Puffer und Vortex gut mischen.
  9. In einem letzten niedrigen Bind-Rohr verbinden Folgendes: 195 µL aus neutralisierten denaturierten Bibliotheken, 1,30 µL Steuerelementbibliothek und 1103.70 µL Sequenzierung Puffer. Mischen Sie richtig.
  10. Laden Sie den endgültigen Bibliothek Mix (1300 µL) in der dafür vorgesehenen Stelle auf Reagenzkassette.
  11. Aufbau der Sequenzierung durch Eingabe von Projekt-und Probe im Sequenzer gestartet bezeichneten Website nach Richtlinien.
  12. Initiieren Sequenzierung nach Richtlinien. Durchflusszelle, Reagenzkassette mit Bibliotheken und Puffer Patrone in Benchtop-Sequenzer zu laden.
  13. Notieren Sie Batch-Nummern aller Reagenz-Kits und Patronen, die in der Sequenzierung verwendet.

7. Daten herunterladen von Sequenzierung Website

  1. Dateien Sie FASTQ nach Anweisungen des Herstellers auf der Website zur Verfügung gestellt.
  2. Für eine gute Qualität führen Sie, dass der Anteil Q30 ≥ 75 % und Cluster-Dichte liegt zwischen 170-280 K/mm2 mit optimalen bei 200-210 K/mm2 (Tabelle 4).

8. die Sequenzierung Datenanalyse

  1. FASTQ Dateien von sequenzierten Proben in Daten-Analyse-integriertes Software-Paket importieren (siehe Tabelle der Materialien).
  2. Erstellen Sie einen Sequenzierung Workflow Software durch Hinzufügen von Features aus Liste nämlich trimmen, Zuordnung zu Referenz (Wählen Sie Referenz-Genom), lokale Neuausrichtung und variant Analyse (Bild 3A) Einstellungen in Tabelle 5 aufgeführt.
  3. Führen Sie Workflow durch die Auswahl einer einzigen Probe oder einen Stapel von FASTQ Beispieldateien und speichern Sie Ausgabedateien in dafür vorgesehenen Probe Ordnern zu.
  4. Bericht für Sequenz Abdeckung Tiefe, zugeordneten Regionen und Liste der strukturellen Varianten im Genom (Abbildung 3B) generieren.
  5. Verwenden Sie Liste der strukturellen Varianten zum suchen nicht gleichbedeutend single-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in den Genen verleiht Resistenz und Virulenz.
  6. Bericht von SNP Lage, gen und Anzahl der resistenten oder anfällig Isolate (Tabelle 6) auflisten.

Ergebnisse

Dreizehn C. Glabrata bestehend aus C. Glabrata ATCC 90030 und 12 Isolaten aus der klinischen Mykologie Referenzlabor (isoliert CMRL1, CMRL12), Westmead Hospital, Sydney wurden untersucht (Tabelle 1). Dazu gehörten die drei Paare von Isolaten CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 und CMRL-/ CMRL 5-6 vor und nach der antimykotischen Therapie mit keine epidemiologischen Zusammenhänge zwischen ihnen erhalten 24 (Tabelle 1).

Diskussion

Diese Studie stellte fest, Machbarkeit, ungefähre Timelines und Präzision der WGS-geführte Nachweis von Resistenzen in C. Glabrata. Die Bearbeitungszeit (TAT) für die Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung wurde vier Tage und Berichterstattung der analysierten Ergebnisse ein bis zwei Tage. Im Vergleich dazu mindestens einer ähnlichen Menge TAT für Anfälligkeit Assays von Kultur Teller und Sanger-Sequenzierung mit deutlich höheren Anzahl von Proben. Ca. 30-90 C. Glabrata Genome sequenziert wer...

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt und keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom Zentrum für Infektionskrankheiten und Mikrobiologie, die öffentliche Gesundheit unterstützt. Die Autoren erhielten keine anderen Mittel für diese Studie nicht. Die Autoren danken Drs Alicia Arnott, Nathan Bachmann und Ranjeeta Menon für ihre kompetente Beratung und Unterstützung mit dem gesamten Genom-Sequenzierung-Experiment.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DensiCHECK PlusBioMérieux IncK083536Densitometer used for McFarland readings
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs.
Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and NeedlesFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required.
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubesSigma Aldrich, MerckT2795   Volume 2.0 mL, natural
 
ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Used for cell wall lysis of fungal isolate before
DNA extraction
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120Does 100 DNA extractions
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitThermo Fisher ScientificP7589 Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol.
Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay.
Nextera XT DNA Sample Preparation KitIlluminaFC-131-1096Includes Box 1 and Box 2  reagents for 96 samples
Nextera XT Index Kit v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Index set A
Index set B
Index set C
Index set D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cycles, More than 250 samples per kit
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cycles, More than 130 samples per kit
PhiX Control KitIlluminaFC-110-3001To arrange indices from Index kit in order
TruSeq Index Plate Fixture KitFC-130-1005 2 Fixtures
KAPA Library Quantification Kit
for Next-Generation Sequencing		KAPA BiosystemsKK4824Includes premade standards, primers and MasterMix
Janus NGS Express Liquid handling system PerkinElmerYJS4NGSUsed for DNA dilutions during sequencing
 0.8 mL Storage PlateThermo ScientificAB0765BMIDI Plate for DNA Library cleanup and
normalisation
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881 Magnetic beads in solution for library purification
Magnetic Stand-96Thermo Fisher ScientificAM10027Used for magnetic bead based DNA purification
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-well plate shaker with 4 platforms
Hard Shell PCR PlateBioRadHSP9601Thin Wall, 96 Well
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Accomodates 96 well plate
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001Clear 96-well plate sealers
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioSoftware for data analysis, Version 8
NextSeq500 instrumentIllumina Illumina Benchtop Sequencer used for next generation sequencing

Referenzen

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

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