هيندبراين الماوس كنموذج لدراسة الخلايا الجنينية

Summary

يوضح هذا المقال كيفية hindbrain الجنينية الماوس يمكن استخدامها كنموذج لدراسة الخلايا التنموية في كل من الجهاز كله واستعدادات قسم الأنسجة.

Abstract

Forebrain الجنين الماوس هو نظام العاملين الأكثر شيوعاً لدراسة الخلايا الثديية أثناء التطوير. ومع ذلك، نيوروبيثيليوم forebrain مطوية عالية غير قابلة لتحليل ووليماونت دراسة أنماط الخلايا على مستوى الجهاز. وعلاوة على ذلك، تحديد آليات الخلايا forebrain ليست بالضرورة التنبؤية للخلايا في أجزاء أخرى من الدماغ؛ على سبيل المثال، بسبب وجود أنواع فرعية محددة forebrain السلف. هيندبرين الماوس يوفر نموذج بديل لدراسة الخلايا الجنينية التي قابلة للتحليل ووليماونت، فضلا عن أقسام الأنسجة لمراقبة توزيع الزمانية المكانية وسلوك موروث العصبية. وعلاوة على ذلك، هو تشريح بسهولة للتطبيقات المتلقين للمعلومات الأخرى، مثل تحليل العزلة أو البيولوجيا الجزيئية في خلية. كما يمكن تحليل hindbrain الماوس سهولة في عدد كبير من خلية نسب مراسل وسلالات متحولة الماوس التي أصبحت متاحة، ويقدم نموذجا قويا لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية للخلايا التنموية في الثدييات الكائن الحي. نقدم هنا، طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام hindbrain الجنين الماوس لتحليل سلوك الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت.

Introduction

أثناء تطوير الثدييات الجنينية، تقسيم الشخصيات في البطين (VZ) ومناطق (SVZ) سوبفينتريكولار نيوروبيثيليوم الآخذة في التوسع لتوليد الخلايا العصبية الجديدة في عملية تسمى 'الخلايا'. جيل جديد من الخلايا العصبية وسلائفها نواب تم التحقيق على نطاق واسع في forebrain¹، بينما يعرف عن هذه العملية في مناطق أخرى.

Forebrain هو بنية معقدة ومعقد مطوية التي يتم دراستها إلى حد كبير مع أساليب نسيجية بعد تقطيع الأنسجة، مما يجعل فهم أنماط الخلايا عبر الجهاز كله تحديا. وبالإضافة إلى ذلك، دراسات للخلايا forebrain ليست التنبؤية بالضرورة سلوك العصبية في مناطق أخرى في الدماغ أو في الحبل الشوكي. على سبيل المثال، إشارات العظة قد الحصول على ردود متباينة عبر مناطق متميزة في الجهاز العصبي المركزي، كما لوحظ في حالة عامل نيوروتروفيك الهدبية واللوكيميا المثبطة، التي تشجع التجديد الذاتي للشخصيات في الأفقي ganglionic فضيلة، ولكن محرك الأقراص التفريق بين النخاع الشوكي المتكفل². وعلاوة على ذلك، توجد فئة فرعية من الشخصيات التي ملء forebrain النامية ويسهم إلى حد كبير إلى التوسع في قشرة الدماغ¹ من³هيندبرين والحبل الشوكي. عكسيا، فمن المتصور أن الحبل الشوكي و hindbrain تحتوي على أنواع فرعية للمجلس الوطني البديلة ليست موجودة في القشرة.

Hindbrain الجنين الماوس هو منطقة أقدم التطوري الدماغ الثدييات وينشئ المخيخ وجذع الدماغ. وعلى الرغم من المحافظة عليه عبر الأنواع، المعروف قليل نسبيا حول الخلايا هيندبراين، بما في ذلك الأنواع الفرعية لمجلس الشعب أو تنظيمها. معظم البحوث هيندبرين في الماوس ركز على عملية تجزئة الأنسجة، يقودها Hox الجينات⁴، والزخرفة من الخلايا العصبية الانقسامية بعد⁵. وبالإضافة إلى ذلك، قد استخدمت في هيندبرين كنموذج لدراسة آليات إنمائية تولد الأوعية⁶.

على النقيض من hindbrain الماوس، استخدمت على نطاق واسع hindbrain الزرد متابعة نواب التمايز والنسب التدرج في كائن نموذج فقاريات (مثلاً،^،من⁷⁸). كما استخدمت hindbrain الفرخ لدراسة الخلايا أثناء تطوير الفقارية (مثلاً،^،من⁹¹⁰). مماثلة إلى hindbrain الزرد¹¹، hindbrain فرخ يمكن أن يعيش تصويرها لدراسة سلوك نواب واللائحة على مدى الساعة¹². المراقبة طولية شبيهة بتصوير مباشر من غير الممكن حاليا في الكائنات الثديية، نظراً لأنها تضع في الرحم. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب من خلال تقنيات مثل يمكن تطبيقها انهانسر سهولة الزرد الشرانق الأجنة أو الفرخ الأجنة في ovo (مثلاً،¹³)، ولكن هذه التقنيات أيضا أكثر صعوبة في الرحم.

ومع ذلك، هيندبراين الجنين الماوس رائع مناسبة لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم الخلايا. أولاً، تحليل hindbrain الماوس سيتم، في كثير من الحالات، توفر معلومات أكثر صلة بتطورات البشر من التي تم الحصول عليها من خلال دراسة الفقاريات أقل. وعلاوة على ذلك، تتوفر عدد ضخم من السلالات المعدلة وراثيا الماوس أنه يمكن أما استخدام لمصير تعيين مورين الشخصيات أو لتغيير آليات تنظيمية مع الآليلات الطور التأسيسي أو الشرطي الجينات ذات الصلة. وأخيراً، مؤخرا وقد ثبت أن microinjection hindbrain البطين موروث السابقين فيفو يسمح على الأقل دراسة موجزة ل hindbrain نواب حركية¹⁴. ومع ذلك، في الوقت الحاضر، هو يعرف إلا القليل جداً عن المنظمة الزمانية المكانية والسلوك من الشخصيات هيندبرين في سياق جهاز كله.

هنا، علينا أن نظهر طريقة بسيطة وسريعة لاستخدام في هيندبرين كنموذج قوية لتحليل سلوك نواب الثدييات في أقسام الأنسجة والاستعدادات ووليماونت. نقدم كذلك البروتوكولات ﻻستخدام إيمونولابيلينج لدراسة معلمات مختلفة من الخلايا وعملية hindbrain عينات أخرى للتطبيقات الجزيئية المصب مثل الكمية عكس المنتسخة (قرة)-بكر.

Protocol

وكان تنفذ جميع الأعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية المحلية و "وزارة الداخلية في المملكة المتحدة".

1-موجز للخطوات وتوقيت

1. أداء ماتينجس توقيت الفئران الكبار من سلالة مناسبة للإجابة على السؤال البيولوجية قيد التحقيق للحصول على الحمل 9.5 e13.5 يوم الجنينية (ه)؛ يتطلب 12-15 يوما.
2. بشكل اختياري، إعداد 5-برومو-2-ديوكسيوريديني (بردو)/الحل 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) والقيام بالحقن (بروتوكول القسم 2)؛ يتطلب ~ ح 1 في اليوم السابق أو اليوم لعزل الأجنة، اعتماداً على الطول المطلوب لوسم إيدو/بردو.
3. إجراء تشريح الجنين العزلة و hindbrain (بروتوكول القسم 3)؛ يتطلب ~ 10 دقيقة/الجنين.
4. أداء الفلورة ووليماونت العلامات (المادة 4 من البروتوكول)؛ يتطلب 3 أيام.
5. المقطع استخدام فيبرتوم وأداء العائمة الفلورة قسم العلامات (المادة 4 من البروتوكول): يتطلب 2 يوما.
6. الفرع كريوستات باستخدام وأداء الفلورة وسم من كريوسيكشنز (بروتوكول القسم 5)؛ يتطلب 2 يوما.

2-حقن الفأر الأنثى الحامل بردو أو إيدو (اختياري)

1. حل بردو أو إيدو في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) بتركيزات من 10 ملغ/مل و 1 ملغ/مل، على التوالي.
   تنبيه: بردو إيدو والسامة؛ ملابس الحماية المناسبة.
2. وزن الحامل الماوس وحساب حجم الحل بردو أو إيدو الذي ينبغي أن تدار لتصل إلى 100 مغ/كغ بردو أو 5 ملغ/كغ إيدو.
3. حقن بردو أو إيدو الحل من خلال الطريق داخل أما اليوم ح أو 1 1 قبل جمع الأجنة، اعتماداً على الطول المطلوب لوضع العلامات.
   ملاحظة: وضع العلامات على ح 1 يتصور hindbrain الخلايا في مرحلة ثانية. وضع العلامات لمدة يوم واحد يتصور ذرية hindbrain الشخصيات.

3-تشريح هيندبراينس من e9.5-e13.5 "الماوس الأجنة"

1. Euthanize ماوس الإناث حوامل توقيت استخدام إجراء أخلاقيا معتمدة في مرحلة الحمل المطلوبة (مثلاً، التفكك عنق الرحم). باستخدام مقص حاد، قص فتح التجويف الصفاقى والمكوس الرحم بعناية. ضع الرحم قصت تحتوي على الأجنة في طبق بلاستيك 60 ملم يحتوي على 20 مل المثلج برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: الأسلوب العقيم غير مطلوب.
2. أداء جميع تشريح مواصلة استخدام مجهر تشريح. استخدام الملقط عدد 5 الساعاتي، تمزق الجدار عضلة الرحم الكشف عن الأجنة والإفراج عن كل الأجنة قبل قطع الحبل السري وإزالة كيس ألمح.
3. استخدام ماصة باستور معقمة مع واسعة-تتحمل فتح، نقل كل الأجنة في طبق بلاستيك نظيفة مع برنامج تلفزيوني المثلج.
4. استخدام الملقط الساعاتي رقم 55، قطع الرأس (الشكل 1E).
5. بشكل اختياري، الاحتفاظ بقطعة صغيرة من الأنسجة (مثلاً، ربع من كيس ألمح أو حوالي 2 مم ذيل تلميح) لعزل الحمض النووي الجينومي والتنميط اللاحقة.
6. استخدام الملقط الساعاتي رقم 55، المكوس الأنسجة التي تحتوي على هيندبراين الموازية وفورا دون نيوروبيثيليوم هيندبراين لفصلها من أنسجة الوجه وفوريبراين (الشكل 1F).
7. ضع هيندبرين والجانب الظهرية والذيلية أنسجة الرأس حتى وتحديد البطين^ال 4، التي تغطيها طبقة رقيقة من أنسجة (لوحة السقف). بيرس لوحة سقف استخدام الملقط الساعاتي رقم 55 (الشكل 1) وقشر الأنسجة الزائدة بعيداً مع الملقط، تحريك روسترالي على طول خط الوسط midbrain، بعناية ومن ثم كودالي على هيندبرين الخلفي والحبل الشوكي (الرقم 1 ); هيندبراين ينبغي أن تتعرض الآن إعداد كتاب مفتوح (الشكل 1 ح).
8. إعداد هيندبرينس ووليماونت إيمونولابيلينج (الخيار 1).
   1. استخدام الساعاتي الملقط رقم 55، بعناية ندف بعيداً المتبقية mesenchyme الرأس والسحايا أي المرفقة إلى جانب بيل هيندبرين استخدام الملقط (1I الشكل). إزالة midbrain وأنسجة النخاع الشوكي (الشكل 1J) ترك أنسجة hindbrain فقط (الشكل 1 K).
      ملاحظة: هذه الخطوة من الإجراء ينبغي عدم اتباعها في e9.5 أو e10.5، لمحاولة القيام بذلك سوف تلحق الضرر المحتمل نيوروبيثيليوم هيندبراين؛ وعلاوة على ذلك، إزالة السحايا أنه ليس أساسيا نيوروبيثيليوم hindbrain رقيقة بشكل كاف في هذه المرحلة للسماح بتغلغل كفاءة من الأجسام المضادة إيمونولابيلينج. هذه الخطوة غير أنه ينبغي أن يتبع من e11.5 فصاعدا، عندما توحد الأنسجة سحائي، تعزيز اختراق جسم نيوروبيثيليوم هيندبرين. تشريح أسهل عند إجراء عملية في برنامج تلفزيوني المثلج (PBS الاستخدام النظيف لكل hindbrain).
9. إعداد هيندبراينس فيبرتوم وكريوسيكتيونينج (الخيار 2)
   1. استخدام الملقط الساعاتي رقم 55، إزالة midbrain وأنسجة النخاع الشوكي (1J الشكل).
      ملاحظة: ليس من الضروري إزالة mesenchyme والسحايا هيندبراينس مخصصة لتقطيع (كما هو موضح في الشكل 1I).
10. نقل هيندبرينس من الطبق البلاستيك إلى أنابيب مستديرة القاع 2 مل باستخدام ماصة باستور ونضح كل برنامج تلفزيوني والإصلاح لح 2 في 4 درجات مئوية مع الانفعالات لطيف في المذابة طازجة 4% w/v فورمالدهايد حله في برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: الفورمالدهيد السامة؛ ملابس الحماية المناسبة.
11. أشطف هيندبرينس 3 x مرات مع برنامج تلفزيوني. تخزين في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني إذا إيمونولابيلينج سوف تبدأ في غضون 2-3 أيام أو استبدال برنامج تلفزيوني بنسبة 50% methanol/50% برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق قبل نقل إلى 100 ٪ الميثانول لتخزين أطول في-20^{درجة مئوية.}

4-ووليماونت الفلورة

1. إذا لزم الأمر، ترطيب هيندبراينس التسلسل التنازلي تخفيف ميثانول في برنامج تلفزيوني (مثلاً، 75% ميثانول، الميثانول 50%، 25% ميثانول) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق ومن ثم نقل إلى برنامج تلفزيوني.
   ملاحظة: مطلوب سلسلة متدرجة من الميثانول بلطف ترطيب هيندبرينس وضمان الحفاظ على الأنسجة السليمة.
2. بيرميبيليزي هيندبراينس لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1% Triton X-100 (PBT) مع الانفعالات لطيف.
3. احتضان هيندبرينس ح 1 في 4 درجات مئوية في PBT المحتوية على مصل الماعز إبطال الحرارة 10% مع الانفعالات لطيف.
   ملاحظة: استخدم المصل من الأنواع المضيفة التي أثارتها الأجسام المضادة الثانوية. للأجسام المضادة الرئيسية التي أثيرت في الماعز، احتضان في المصل خالية كتلة البروتين، على سبيل المثال ألبومين المصل البقري 5% في برنامج تلفزيوني أو بديل تجاري مناسب (انظر الجدول للمواد). وهذا سوف يقلل غير محددة تلطيخ كثيرا ما لوحظ عند استخدام الأجسام المضادة الرئيسية التي أثيرت في الماعز.
4. احتضان هيندبرينس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في PBT الذي يحتوي على 1% مصل إبطال الحرارة والأجسام المضادة الأولية مع الانفعالات لطيف (مثلاً، الأرنب والرمات مكافحة هيستون H3 [pHH3] المخفف 1: 400).
   ملاحظة: للأجسام المضادة الرئيسية المثارة في الماعز، استخدام PBT دون المصل.
5. تغسل في هيندبراينس عند 4 درجة مئوية 5 x مع PBT ل 1 ح.
6. احتضان هيندبرينس بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في PBT تتضمن المناسبة مترافق fluorophore الثانوي الأجسام المضادة (مثلاً، الماعز الأرنب المضادة أليكسا فلور 488) في 1: 200 في PBT الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. إبقاء هيندبرينس في الظلام من هنا على حماية فلوروفوريس من فوتوبليتشينج.
   ملاحظة: للأجسام المضادة الرئيسية المثارة في الماعز، استخدام شظايا الماعز المضادة القوات المسلحة البوروندية من الأجسام المضادة الثانوية للحد من تلطيخ غير محددة.
7. تغسل في هيندبراينس عند 4 درجة مئوية 5 x مع PBT ل 1 ح.
8. هيندبراينس في 4% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة على RT للحفاظ على المدى الطويل ربط جسم postfix. باختصار شطف مرتين في برنامج تلفزيوني.
9. تغطية شريحة مجهر زجاج مع اثنين من طبقات من شريط أسود الكهربائية والمكوس مربع صغير من الشريط الطبقات لإنشاء جيب كبير بما يكفي لاحتواء hindbrain واحد.
10. نقل كل هيندبراين في جيب مع ماصة باستور وإزالة السائل الزائد وإضافة كاشف أنتيفادي مناسبة للجيب قبل تغطية ذلك ببطء مع ساترة زجاجية لتجنب فقاعات الهواء الملائمة تحت ساترة. ختم ساترة وإلصاق أن الشريحة مع طبقة رقيقة من طلاء الأظافر. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى الحصول على الصور (المادة 7 من البروتوكول).

5-فيبرتوم تمزيقها والعائمة الفلورة القسم

1. إذا لزم الأمر، ترطيب هيندبرينس من الميثانول كما هو موضح في الخطوة 4، 1.
2. تضمين هيندبرينس في المنصهرة 3% w/v [اغروس] أعدت في الماء المقطر.
   ملاحظة: تسمح المنصهر [اغروس] لتبرد لحوالي 55 درجة مئوية بإيجاز قبل التضمين لمنع وقوع أضرار الحرارة هيندبرين.
3. قطع المقاطع hindbrain عرضية بسمك 70 ميكرومتر استخدام فيبرتوم. نقل كل مقطع قطع طازجة مع الرسام في بئر واحدة من صفيحة 24-كذلك يتضمن برنامج تلفزيوني المثلج.
4. تسمية الأقسام العائمة كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.7، ولكن تعديل الخطوات على النحو التالي: أغسل العائمة المقاطع عند 4 درجة مئوية x 3 مع PBT لمدة كل منها 15 دقيقة إنقاص وقت الحضانة للأجسام المضادة الثانوية إلى 2 حاء، واحتضان في جسم الثانوية في الرايت
5. بشكل اختياري، بعد وضع العلامات مع الأجسام المضادة لأخرى [ابيتوبس] كما هو موضح في الخطوة 5، 4، الكشف عن نويات إيدو⁺ استخدام إيدو وصفها كيت وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. احتضان الأقسام العائمة في رد فعل كوكتيل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام. أغسل هيندبرين الأقسام عند 4 درجة مئوية x 3 مع PBT لمدة 15 دقيقة.
6. بشكل اختياري، بعد وضع العلامات لأخرى [ابيتوبس] كما هو موضح في الخطوة 5، 4، كشف نويات بردو⁺ كما يلي.
   1. احتضان الأقسام العائمة في حمض الهيدروكلوريك ن 2 في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
   2. احتضان الأقسام العائمة في م 0.1 بورات الصوديوم العازلة pH 8.5 مرتين لمدة 5 دقائق كل في RT في الظلام لتحييد حمض الهيدروكلوريك.
   3. أغسل أقسام عائمة 3 x بإيجاز في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.
   4. أداء الفلورة وسم بردو كما هو موضح في الخطوة 5، 4.
7. احتضان الفروع عائم لمدة 2 دقيقة في الرايت في 10 ميكروغرام/مل 4 '، هيدروكلوريد 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في برنامج تلفزيوني كونتيرستاين نواة الخلية.
8. Postfix المقاطع عائمة في 4% فورمالدهايد لمدة 15 دقيقة في الرايت
9. تغسل الأجزاء العائمة بإيجاز في برنامج تلفزيوني. بعناية نقل أقسام عائمة على شريحة مجهر زجاج باستخدام الرسام. التخلص من برنامج تلفزيوني الزائدة حول المقطع باستخدام ورق نشاف أو الأنسجة.
10. جبل المقاطع استخدام والغليسيرول 80% في برنامج تلفزيوني والغطاء ببطء مع ساترة زجاجية لتجنب فقاعات الهواء الملائمة. تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى الحصول على الصور (الخطوة 7).

6-كريوستات تمزيقها والفلوره كريوسيكشن وسم

1. إذا لزم الأمر، ترطيب هيندبرينس من الميثانول كما هو موضح في الخطوة 4، 1.
2. احتضان هيندبرينس في السكروز 30% w/v في برنامج تلفزيوني إلى هيندبرينس كريوبروتيكت قبل التجميد.
   ملاحظة: هيندبراينس مستعدون لتجميد عندما قد غرقت إلى أسفل الأنبوب، الذي عادة ما يأخذ ≤ 2 ح هيندبراينس e9.5-10.5 وح 3-6 ل e11.5 13.5 هيندبراينس.
3. تغرق هيندبراينس في درجة حرارة القطع الضوئية المركبة (OCT) وتجمد بسرعة بنقل قوالب التي تحتوي على هيندبراينس في أكتوبر إلى إيسوبينتاني تبريد لبين-40 درجة مئوية و-50 درجة مئوية في الثلج الجاف.
   ملاحظة: يمكن تخزين هيندبراينس المجمدة، جزءا لا يتجزأ في-20 درجة مئوية قصيرة الأجل وطويلة الأجل-80 درجة مئوية حتى تمزيقها.
4. قطع المقاطع hindbrain عرضية بسمك 10 ميكرون باستخدام كريوستات ونقل إلى شرائح المجهر لاصقة الكهربية الاستاتية.
   ملاحظة: يمكن تخزين كريوسيكتيونس هيندبراين في-20 درجة مئوية قصيرة الأجل وطويلة الأجل-80 درجة مئوية حتى وضع العلامات.
5. احتضان الشرائح في RT لمدة 15 دقيقة لتجفيف الأقسام على الشرائح. أغسل كريوسيكشنز مع برنامج تلفزيوني لحل OCT ومارك حاجزاً مسعور حول استخدام قلم PAP كريوسيكشنز. كرر الخطوات من 5.4-5.8.
6. كرر الخطوة 5.10 استخدام وسيلة تركيب القائم على الكحول البولي فينيل بدلاً من الجلسرين.

7. الحصول على الصور

1. صورة العينات باستخدام ابيفلوريسسينت أو [كنفوكل] مجهر مسح ليزر مجهزة بعدسات مناسبة للشرائح المائية تحميل الوسائط والمرشحات الضوئية مناسبة ل fluorophores المستخدمة إيمونولابيلينج.
2. لصورة هيندبراين كاملة أو مقطع هيندبراين، استخدم عدسة للتكبير x 10 (مثلاً، الشكل 2)؛ لتصور المناطق هيندبرينس للقياس الكمي، استخدم 40 × التكبير (مثلاً، الشكل 2D) وتصور خلايا فردية، واستخدام عدسة تكبير 63 x (مثلاً، الشكل 2).

8. أساليب بديلة

1. في أعقاب خطوة 3.8، مجانسة هيندبرينس غير المثبتة لإنتاج تعليق خلية مفردة قياس تدفق الطلبات¹⁵.
2. في أعقاب خطوة 3.8، مجانسة هيندبراينس غير المثبتة لاستخراج الحمض النووي الريبي من تعليق خلية مفردة RT-قبكر (مثلاً، ¹⁶).
   ملاحظة: تأكد من جميع الكواشف ومعدات يتم الاحتفاظ عقيمة وخالية رناسي في جميع أنحاء لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي.
3. في أعقاب خطوة 3.8، مجانسة هيندبرينس غير المثبتة لعزل الشخصيات ونشر لهم في المختبر نيوروسفيريس لتحليل سلوك نواب هيندبرين¹⁷.
   ملاحظة: تأكد من جميع الكواشف ومعدات يتم الاحتفاظ عقيمة لمنع التلوث الجرثومي/الفطرية للثقافات نيوروسفيري.

النتائج

ويوضح هذا القسم أمثلة على النتائج التي يمكن الحصول عليها عند دراسة الخلايا في هيندبراين الجنينية الماوس من خلال تحليل المقطع ووليمونت والأنسجة.

نظهر أن إيمونولابيلينج ووليماونت من هيندبرين ميكروديسيكتيد مع جسم مضاد يتصور pHH3 ماركر الانقسامية تقسيم الشخصيات في VZ (الشكل 2B – د). نعرض pHH3⁺ الشخصيات في تكبير عالية لتسليط الضوء على مراحل مختلفة من الانقسام (الشكل 2). ونحن قد يتضح أن هذا الأسلوب وضع العلامات المناسبة التي يتعين القيام بها عبر عدة مراحل متتالية من التنمية هيندبرين مراقبة مسار الوقت الانقسام الوطني في هذا الجهاز (الشكل 2D).

نظهر أن التصوير إيمونولابيليد عرضية فيبرتوم أبواب hindbrain ح 1 بعد حقن إيدو، يتصور اتجاه الانقسام والشخصيات الانقسامية (الشكل 3B)، نمط الهجرة النووية بسيودوستراتيفيد، إينتيركينيتيك من ركوب الدراجات موروث¹⁸ (الشكل 3، د)، والهيكل العام VZ (الشكل 3B – د). لاحظ أن pHH3 الانقسامية⁺ الشخصيات موجودة فقط في سطح البطين وليس أكثر بأسالي (الشكل 3)، التي يتناقض نمط الشخصيات أكثر التزاما في forebrain¹⁹شعبة القاعدية.

نحن أيضا لتوضيح كيف يمكن المسمى ركوب الدراجات الشخصيات وذرياتهم متباينة مع بردو أو إيدو لتقييم تطور نسب نواب (الشكل 4). إيمونولابيلينج كريوسيكتيونس عرضية من الماوس hindbrain يوم 1 بعد حقن بردو بردو و Ki67يوضح العدد وتحديد المواقع للدراجات الشخصيات في نيوروبيثيليوم (الشكل 4 أ، ب)، حيث أن عدد الذاتي تجديد الشخصيات يمكن تعريفها بواسطة حساب النسبة مئوية Ki67 الخلايا بردو^{+ +} بين جميع الخلايا بردو⁺ (الشكل 4 أ، ج).

أخيرا، نحن إظهار مثال على إيمونولابيلينج أقسام فيبرتوم hindbrain RC2، مستضد في الشعيرة المتوسطة الخاصة بالعصبية نيستين، وضع تصور لنواب الشعب الصيني اندفيت (الشكل 5B) والعمليات (الشكل 5). أقسام فيبرتوم، بدلاً من كريوسيكتيونس رقيقة، السماح بالمراقبة المحسنة الشخصيات العالية تشعبت وأيضا الهيكل العام نيوروبيثيليال.

الشكل 1 : الخطوات الرئيسية في التشريح هيندبرين من جنين الفأر e11.5. (أ – د) تصوير ميكروديسيكتيون هيندبراين التخطيطي. (أ) الأنسجة الرأس والذيلية تتم إزالتها من قبل قطع على طول أحمر منقط. (ب) لوحة سقف اخترقت وثم مزقت بعيداً في اتجاهات كل من روسترال ووالذيليه على طول خط الوسط (الخطوط الحمراء الرأسية) ومن ثم أفقياً للكشف عن نيوروبيثيليوم هيندبرين. (ج) نيوروبيثيليوم هو تبتعد عن السحايا بعد إدراج الملقط بين كل الهياكل، وتتم إزالة الأنسجة midbrain والحبل الشوكي بقطع الأنسجة بالملقط على طول أحمر منقط. (د) هذا الإجراء غلة هيندبراين الأرض. (ﻫ–ك) التقاط الصور من المراحل الرئيسية في الإجراء ميكروديسيكشن هيندبرين. (ﻫ) الجنين هو مقطوعة الرأس بجب على طول الخط المنقط. (و) hindbrain 4^th البطين، المحاطة بلوحة السقف، اقتطعت ومفصولة من الرأس بجب على طول الخطوط المنقطة. (ز) البطين^ال 4 الموجه صعودا قبل الرصاصات ثقب صغير في سقف لوحة (العلامة النجمية). هو اتسع الثقب تقشير الأنسجة بدقة كل روسترالي وكاودالي على طول خط الوسط (الأسهم) للكشف هيندبراين. هيندبرين هو الجانب بيل متوضعة أسفل واليسار إلى إضعاف بها في إعداد كتاب مفتوح (ح؛ والأسود يشير رأس السهم إلى الأنسجة العصبية hindbrain). إذا كان مطلوباً هيندبراين في إيمونولابيلينج ووليمونت، تتم إزالة الغشاء بيال من المتطفلين بلطف نيوروبيثيليوم هيندبراين من الأغشية السحائي المحيطة باستخدام الملقط (أنا). الزائدة midbrain (ميغابايت) والحبل الشوكي (sc) الأنسجة هو إزالة (الخطوط المنقطة في J) لعزل hindbrain (K). مقياس بار: 500 ميكرومتر (E)، 300 ميكرون (و – ك). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 : إيمونولابيلينج ووليمونت يمكن استخدامها لقياس ميتوسيس المجلس الوطني عبر هيندبراين- توضح التصوير تواجه أون من الشخصيات الانقسامية في طبقة البطين hindbrain التخطيطي (A). الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب) بلاط [كنفوكل] مسح z كومة من هيندبرين e10.5 بعد إيمونولابيلينج ووليماونت على pHH3 ماركر الانقسامية (أحمر). المربع الأبيض يشير إلى منطقة سيظهر في أعلى التكبير في الفريق الثاني في (د). (ج) ما قبل طور الصعود (السهم الأبيض) والأرقام الانقسامية طور الصعود (السهم الأسود) يمكن تمييزها ضمن الفوج مجموع الانقسامية طبعا الشخصيات-(د) وقت من pHH3 ووليماونت وسم من e9.5 13.5. تغيير حجم أشرطة: 500 ميكرومتر في (ب)؛ 20 ميكرومتر (C)؛ 100 ميكرومتر (د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : الشخصيات ركوب الدراجات داخل منطقة جيرمنال الخاصة بهم في هيندبرين روسترال. (أ) التخطيطي يصور موقف الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (الأحمر) على سطح البطين هيندبرين وفي منطقة المحيط بالبطينات، على التوالي. يتم عرض شريحة افتراضية من خلال هيندبرين التكبير أعلى على اليمين. السهم الأسود يشير إلى اتجاه هجرة ذرية للمجلس الوطني أن إنهاء دورة الخلية نحو منطقة التمايز. (ب) z [كنفوكل] كومة من مقطع هيندبرين e11.0 العائمة من جنين التي تلقي ح 1 نبض إيدو؛ واستخدمت إيمونولابيلينج pHH3 وايدو تصور الانقسامية (الأخضر) والشخصيات S-المرحلة (أحمر)، على التوالي. تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبرين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب hindbrain بيال. ويرد في المنطقة المشار إليها بمربع أبيض في أعلى التكبير في الداخلي؛ تشير الأسهم إلى الطائرة الانقسام في مجلس الشعب في طور الصعود، بالنسبة إلى سطح البطين. (ج) قناة واحدة تعرض pHH3 إيمونولابيلينج فقط. يتم الإشارة إلى الشخصيات الانقسامية برؤوس الأسهم السماوي؛ هو أشارت إلى نقص الشعب القاعدية Δ-(د) قناة واحدة تعرض إيدو العلامات فقط. إيدو⁺ الشخصيات تعتمد على توزيع بسيودوستراتيفيد بسبب هجرتهم النووية إينتيركينيتيك. ويمكن قياس المسافة التي تهاجر الشخصيات بعيداً عن سطح البطين، كما هو مبين بخط برتقالي ممثل. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر في (ب -د)؛ 10 ميكرومتر في اقحم في (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : بردو الجمع بين مع Ki67 وضع العلامات لتحديد القدرات الذاتي تجديد المجلس الوطني هيندبراين- (أ) ض [كنفوكل] كومة من كريوسيكشن هيندبرين e10.5 بعد وضع العلامات Ki67 (الأخضر) ونبض بردو (أحمر) بعد يوم 1 بردو. الخلايا إيجابية مزدوجة في منطقة البطين هي الشخصيات التي أدرجت بردو ولا تزال تتحرك من خلال دورة الخلية، كما ورد وصفها Ki67. نسبة الخلايا المسماة مزدوج بين مجموع السكان بردو⁺ يمثل النسبة المئوية لتجديد ذاتي الشخصيات. (ب، ج) واحد قنوات عرض Ki67 (ب) وإيمونولابيلينج بردو (ج) فقط. يتم الإشارة إلى خلية بردو⁺ التي تفتقر إلى Ki67 وقد خرجت ولذلك يرجح أن دورة الخلية على رأس سهم سماوي في (ألف،ج). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. شريط الحجم: 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 5 : إيمونولابيلينج نيستين يتصور عمليات المجلس الوطني واندفيت- (أ – ج) ويوضح الفلورة ل RC2، الذي يعترف حانمه على خيوط متوسطة العصبية نيستين، مورفولوجيا المجلس الوطني عبر نيوروبيثيليوم هيندبرين. (أ) ض [كنفوكل] كومة من مقطع عائمة من هيندبرين e11.5 عقب إيمونولابيلينج RC2؛ المناطق محاصر تظهر في أعلى التكبير في (ب، ب؛ المنطقة قمي/البطين) و (ج، ج '؛ والقاعدية المنطقة). تتم الإشارة إلى الأسطح هيندبراين بخطوط منقطة؛ الخامس، الجانب hindbrain البطين؛ ف، الجانب هيندبرين بيل. (ب، ج) مكدسات z [كنفوكل] مناطق محاصر في (أ)؛ وتظهر المقاطع بصري واحد في (ب، ج ')، على التوالي. يشار مجلس الشعب اندفوت قمي ترتكز على سطح البطين سهم في (ب). يتم الإشارة إلى عمليات المجلس الوطني واحد وفاسسيكولاتيد برؤوس بيضاء وسوداء في (ج ')، على التوالي. تغيير حجم أشرطة: 100 ميكرومتر، (A)؛ 25 ميكرومتر (ب، ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام hindbrain الجنينية الماوس كنموذج لدراسة آليات الخلايا التنموية. استخدام مجموعة متنوعة من أساليب إيمونولابيلينج مختلفة، يمكن تصور hindbrain الشخصيات وعددها كمياً في أقسام الأنسجة أو عبر جهاز ووليمونتس. ويضمن سهولة التشريح والتشريح شقة أن يمكن تصويرها في هيندبرين في إعداد 'كتاب مفتوح' لجمع المعلومات عن أنماط الخلايا على مستوى الجهاز.

نعرض كذلك أن مورفولوجيا المجلس الوطني والمتصلة بدوره الخلية لمجلس الشعب لتحديد المواقع يمكن تصور على سهولة في العائمة-أو كريوسيكشنز هيندبرين. يمكن أن تستغل كل السلوكيات لتعريف السكان الجدد السلف، كما قد أجريت سابقا في الثدييات تيلينسيفالون²⁰. على سبيل المثال، أوائل تشكيل نيوروبيثيليا Sox2⁺ وإطلاق شعاعي قمي Pax6⁺ موجودة في^21،هيندبرين²²، ولكن hindbrain يفتقر إلى فروعه القاعدية Tbr2^{+ 3} .

البروتوكول هو موضح هنا أيضا يمكن تكييفها لمراقبة سلوك الفئات السكانية الفرعية للمجلس الوطني محددة بوصفها الفلورسنت للتصوير الحي و/أو تتبع النسب في الأنسجة الثابتة. يمكن أن يتحقق هذا، على سبيل المثال، بدراسة هيندبراينس من الفئران تحمل التحوير Sox1-iCreERT2 تاموكسيفين إيندوسيبلي و مراسل Rosa26^{تدتوماتو 23}.

بالإضافة إلى تعزيز المعرفة بالخلايا مورين، الذين يدرسون في هيندبرين قد توضيح الآليات العصبية ذات الصلة على نطاق واسع التي تمت مشاركتها عبر الأنواع، لأنه هيندبرين وهي منطقة الدماغ العالية مصانة التي من المتوقع أن يكون أكثر مماثلة بين الأنواع الفقارية مما forebrain.

كما hindbrain الخلايا يحدث خلال إطار زمني أقصر نسبيا من الخلايا فوريبرين²³، من المهم النظر في الحاجة إلى مقارنة كافية نظموا الأجنة. تبعاً لذلك، هو تجنب التحيز التجريبية عد وتسجيل عدد أزواج سميط في جنين قبل عزل به هيندبرين. الأنسجة هيندبراين نفسها لا يزال هشا وينبغي لذلك أن تعالج الملقط بعناية عند فصل الأنسجة هيندبراين عن ميسينتشيمي الرأس والسحايا؛ زوجين من 'تشغيل الممارسة' قد يكون ولذا من المستصوب قبل محاولة تشريح الأجنة قيمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تنقل هيندبرينس من أنبوب واحد إلى آخر باستخدام ماصة باستور تحمل على نطاق بدلاً من الملقط لتجنب الأضرار (يمكن توسيع فتح ماصة بقطع رأس مع مقص نظيف). وأخيراً، على الرغم من غير المألوف، مدى إدماج إيدو/بردو الشخصيات S-المرحلة قد يكون المتغير، خاصة خلال نبضات قصيرة (أي، ح 1). لتحسين وضع العلامات، ضمان أن إيدو/بردو هو حل بشكل صحيح قبل تحميل الحل في المحاقن وحقن بعناية في التجويف الصفاقى. سوف يؤدي إلى فقدان أو محاصرة الحل إيدو/بردو حقن الفقراء، مثل تلك التي تحت الجلد عن طريق الصدفة، ومنعه من الدخول إلى الدورة الدموية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock)	VWR	211-2120	Also available from other commercial suppliers
Plastic cell culture dish, 60 mm	Thermo Fisher	150288	Also available from other commercial suppliers
Cell culture plates, 12-well	Thermo Fisher	150628	Also available from other commercial suppliers
Pasteur pipettes	Copan	200C	Also available from other commercial suppliers
Dumont Watchmaker forceps, no. 5	FST	91150-20
Dumont Watchmaker forceps, no. 55	FST	11295-51
29G needle/syringe	BD	BD Micro-Fine +1ml
Anti-phospho-histone H3 primary antibody	Millipore	06-570	Goat, dilution 1:400
Anti-BrdU primary antibody	Abcam	ab6326	Rat, dilution 1:400
Anti-Ki67 primary antibody	BD Biosciences	550609	Mouse, dilution 1:400
Anti-RC2 primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	RC2	Mouse (IgM), dilution 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody	Thermo Fisher	A11029	Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody	Thermo Fisher	A11037	Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody	Thermo Fisher	A21042	Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody	Thermo Fisher	A11001	Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody	Thermo Fisher	A11007	Dilution 1:200
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	Sigma	D9542	Use at 10 μg per mL
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU)	Sigma	900584
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU)	Sigma	B5002
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit	Thermo Fisher	C10086
Heat-inactivated goat serum	Sigma	G9023
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
DAKO protein-block serum free	Agilent	X0909
Triton X-100	Sigma	T8787	Also available from other commercial suppliers
Phosphate buffer saline	Sigma	P4417	Also available from other commercial suppliers
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Also available from other commercial suppliers
Sodium tetraborate	Sigma	B9876	Also available from other commercial suppliers
Sucrose	Sigma	S0389	Also available from other commercial suppliers
Agarose	Sigma	A9539	Also available from other commercial suppliers
Super PAP pen liquid blocker	Ted Pella, Inc.	22309
SlowFade Antifade Kit	Thermo Fisher	S-2828
Glycerol	Fisher Scientific	10337700
Mowiol	Millipore	475904
OCT	Scigen	4583	Also available from other commercial suppliers
Isopentane	Sigma	M32631	Also available from other commercial suppliers
Methanol	Thermo Fisher	10675112	Also available from other commercial suppliers
Hydrochloric acid	Thermo Fisher	10316380	Also available from other commercial suppliers
Microscope slides	VWR	631-0912
Superfrost microscope slides	VWR	631-0108
Thermometer	VWR	620-0858
Cover glass	VWR	631-0137
Stereo Microscope, Leica MZ16	Leica	not applicable
Confocal laser scanning microscope  LSM710	Zeiss	not applicable