نموذج عصب الوركي مورين في فيفو غزو Perineural

Summary

يصف لنا في فيفو مورين نموذجا لغزو perineural عن طريق حقن خلايا سرطان البنكرياس سينجينيك في العصب الوركي. النموذج يسمح للقياس الكمي لمدى غزو العصب، ويدعم تحقيق الآليات الخلوية والجزيئية لغزو perineural.

Abstract

الخلايا السرطانية غزو الأعصاب من خلال عملية تسمى غزو perineural (الدكتور)، هي السرطان في الخلايا تتكاثر وتهاجر في المكروية العصب. هذا النوع من الغزو هو معروض بمجموعة متنوعة من أنواع السرطان، وكثيراً جداً ما يتم العثور على الإصابة بسرطان البنكرياس. الحجم المجهري للألياف العصبية داخل البنكرياس الماوس صعوبة دراسة الدكتور في نماذج موريني أورثوتوبيك. وهنا يصف لنا نموذج هيتيروتوبيك في فيفو للدكتور، حيث أننا ضخ خط خلية سرطان البنكرياس سينجينيك Panc02-H7 في العصب الوركي مورين. في هذا النموذج، تتعرض الأعصاب الوركي تخديره من الفئران وحقن بالخلايا السرطانية. غزو الخلايا السرطانية في الأعصاب بروكسيمالي نحو النخاع الشوكي من نقطة الحقن. ثم تستخرج الأعصاب الوركي غزت وتجهيزها مع أكتوبر لتقطيع المجمدة. ح & ه وتلطيخ الفلورة هذه الأقسام تسمح التحديد الكمي لكل درجة من غزو والتغييرات في التعبير البروتين. يمكن تطبيق هذا النموذج على مجموعة متنوعة من الدراسات على الدكتور نظراً براعة. يسمح استخدام الفئران مع التعديلات الوراثية المختلفة و/أو أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية لتحقيق الآليات الخلوية والجزيئية للدكتور وأنواع مختلفة من السرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة آثار العوامل العلاجية على غزو العصب بتطبيق العلاج على هذه الفئران.

Introduction

وتشكل الأعصاب محددة وورم المكروية التي تحفز السرطان النمو والهجرة^1،،من²³. غزو Perineural (الدكتور) هو العملية من خلال السرطان التي تغزو الخلايا في وحول الأعصاب. فإنه يمكن اعتبار طريقا فريداً لورم خبيث منذ غزو السرطان يمتد بعيداً عن المواقع الأصلية على طول الأعصاب. تم العثور على الدكتور في العديد من أنواع السرطان، بما في ذلك رأس البنكرياس، والبروستاتا، والرقبة، اللعابية، وسرطان عنق الرحم، وسرطان القولون والمستقيم نسبة تتراوح بين 22% إلى 100%^1،2. الدكتور يرتبط مع الألم ويرتبط بسوء التشخيص، والأسوأ من ذلك بقاء معدلات^1،2.

وضع نماذج لغزو perineural ضروري توضيح الآليات الخلوية والجزيئية لهذه العملية، واختبار العوامل العلاجية المرشح إنقاص الدكتور. وتشمل أساليب في المختبر دراسة التفاعلات بين أنواع السرطان والأعصاب ثقافة المشارك من الخلايا السرطانية مع العصب explants⁴أو الجذرية الظهرية جانجليونس^5،6،7، أو مع الخلايا المحددة من العصبية الخلايا المكروية مثل شوان⁷. في فيفو النهج، ولكن ذات الصلة أكثر من الناحية الفسيولوجية وتشمل استخدام نماذج الماوس السرطان الذي تم الناجمة عن السرطان أو زرع وتتميز بالمحاسبة المكروية العصب الكامل. في أورثوتوبيك نماذج سرطان البنكرياس أو البروستاتا، الدكتور تم الإبلاغ عنها^8،،من⁹¹⁰ وقد سجلت حالات الإصابة بالدكتور، ولكن بسبب الحجم الصغير للأعصاب في تلك الأجهزة، فإنه من الصعب أن نرى العصب الكامل وذلك تقدير مدى الدكتور. النموذج الذي يصف لنا هنا هو نموذج في فيفو للدكتور في السرطان الذي يتم حقن الخلايا في العصب الوركي من الفئران من خلال إجراء العمليات جراحية بسيطة¹¹. زرع هيتيروتوبيك يغزو داخل العصب نحو النخاع الشوكي. ويمكن قياس طول العصب غزو من الموقع الحقن في النخاع الشوكي، فضلا عن حجم السرطان داخل العصب. الأهم من ذلك، يمكن أيضا جمع العصب غزت لمجموعة متنوعة من الاختبارات بما في ذلك التحليلات المجهرية، والجزيئية. ويمكن اختبار مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية، والفئران المضيف التي تم تعديلها وراثيا أو تعامل مع مركبات معينة يمكن استخدامها كذلك. هذا التحليل قوية يسمح للخلايا السرطانية والمكرويه المضيفة إلى أن يتم تعديل للتحقيق في الآليات للدكتور.

Protocol

كافة الإجراءات مع مواضيع الحيوان أقرتها لجنة الاستخدام في مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان ورعاية الحيوان المؤسسية.

1-إعداد الخلايا السرطانية

1. حصاد الخلايا Panc02-H7 الفرعي المتلاقية مع التربسين 0.25% لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. جمع الخلايا في أنبوب الطرد مركزي 15 مل.
   ملاحظة: الخلايا وتزرع في قارورة T-225، الذي يحتوي على حوالي 12 × 10⁶ خلايا كل قارورة في 80% كونفلوينسي والتربسين مل 4/يستخدم قارورة.
2. الطرد المركزي في الخلايا × 900 غ في 4 درجات مئوية للحد الأدنى 5 غسل الخلايا بالخلية ريسوسبيندينج بيليه في 1 مل من برنامج تلفزيوني (من بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرتين)، ونقل التعليق إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل على الجليد.
3. الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في × 900 غ عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه. تبقى الخلايا الأعلاف على الجليد حتى الحقن.

2-إعداد الفئران وجراحة

ملاحظة: يتم استخدام الفئران C57BL/6J عمرها 8 أسبوع والذكور والإناث في هذه الدراسة. شروط الجراحة يتبع القواعد IACUC لمؤسستنا. يتم تعقيم الأدوات وهو تطهير سطح العمل الجراحي، وهو تطهير الحيوان والجراح ترتدي القفازات المعقمة.

1. في اليوم قبل الجراحة، تخدير isoflurane 2% باستخدام الماوس ثم قم بإزالة الفراء على طول عظم الفخذ في الجهة الظهرية مع شفرة حلاقة رقيقة أو عامل إزالة شعر كيميائية.
2. في يوم الجراحة، تخدير الفئران باستخدام إيسوفلوراني 2% في دائرة التعريفي. تأكيد أنيسثيتيزيشن بحافز قرصه أخمص القدمين وعدم الاستجابة.
3. تطبيق مرهم البيطرية في العيون لمنع جفاف تحت التخدير.
4. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على الجانب البطني، وتأمين كل أطرافه مع الشريط هيبوالرجينيك خلق توتر خفيف في أطرافهم بالحقن بلطف. التخدير هو الاحتفاظ باستخدام isoflurane تسليمها عبر المبخر الدقة ومخروط الآنف.
5. تنظيف مكان الحقن مع تدين، ثم مرة أخرى مع الكحول 70%. كرر هذه العملية مرتين أخريين. تأكد من أن لا الشعر فضفاضة لا يزال في مجال الجراحة.
6. جعل شق 1 سم مع مقص صغير حوالي 2 مم أدناه وموازية لعظم الفخذ. سحب الجلد مع الملقط جانبياً لفضح العضلات تحتها.
7. يعمل العصب الوركي العميق للعضلات عضلة مكسيموس والعضلة ذات الرأسين الفخذية. فصل هذه العضلات اثنين على طول طائرة اللفافي مع مقص صغير وفضح العصب الوركي تحت. مجاناً على العصب من العضلات المحيطة استخدام تشريح كليلة.
8. رسم 3 ميكروليتر من الخلايا السرطانية (خلايا حوالي 50,000) من بيليه في محقن 10 ميكروليتر.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، رسم ميكروليتر 3 من برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم.
9. ضع ملعقة معدنية صغيرة تحت العصب عند نقطة الحقن للدعم. إطار التصور مع مجهر تشريح، أدخل الإبرة في العصب ضد قاعدة معدنية، إبقاء الإبرة كمواز للعصب قدر الإمكان عند الإدراج. كن حذراً لا للثقب عن طريق الجزء الخلفي للعصب. تقليل التعامل مع العصبية قدر الإمكان طوال هذه العملية.
10. ببطء بحقن العصب أكثر من 5 s. ويشير إلى تشكيل لمبة في منطقة الحقن حقنه جيدة. ثم اترك الإبرة في مكان ل 3 s قبل إزالة الإبرة برفق. حفظ الإبرة في مكان ل 3 s يقلل الدفق الخلايا خارج العصب.
    ملاحظة: يمكن إجراء حقن نحو القاصي العصب أو الحبل الشوكي. من المهم أن تظل متسقة ضمن مجموعة من التجارب. إذا تسرب الخلايا خارج، ينبغي عدم إدراج الحيوان في تحليل هذه التجربة. مع التجربة، هذه الأحداث نادرة جداً.
11. إعادة العصب إلى موضعه الأصلي. تغطية الأعصاب مع العضلات السطحية. علاج الفئران مع التسكين الصحيحة، ثم قم بإغلاق الجلد بخيوط النايلون 5-0.
12. ضع الماوس وحدها في قفص نظيف للمراقبة أثناء عملية الاسترداد، حتى أنها توقظ تماما من التخدير.
    ملاحظة: يستغرق 5-15 دقيقة للحيوان أن يستعيد وعيه الكامل. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. لم يتم إرجاع الحيوان إلى شركة الحيوانات الأخرى حتى شُفي تماما. وبعد ذلك، تقييم الانتعاش مرة واحدة على الأقل كل 24 ساعة في حالة ح 72.

3-العصب الوركي الاستخراج

1. في يوم بوستوب #7، euthanize الفئران مع CO₂. ضع الماوس على الجانب البطني، وتحقيق الاستقرار في أطرافه البعيدة باستخدام دبابيس.
2. قم بإزالة الجلد في الجهة الظهرية لحقن أطرافهم والجذع.
3. استخدام تشريح كليلة، تعرض العصب الوركي العميق في العضلات.
4. دورات العصب بين الحرقفه وأن عجز. للوصول إلى العصب في منطقة الحبل الشوكي، فصل اثنين من العظام. أولاً إدراج مقص مغلق في منطقة ضيقة حيث يوجد العصب الوركي، ثم قم بفتح المقص أثناء الضغط على الماوس. أن تكون حساسة والحفاظ على سلامة العصب الوركي أثناء التشريح.
5. عناية تشريح العصب الوركي ديستالي إلى نهاية عظم الفخذ، وبروكسيمالي إلى النخاع الشوكي.
6. ملاحظة: الأعصاب غزت هشة للغاية وعرضه للانهيار تحت التوتر أو معالجة قوية.
7. حصاد العصب بأول قطع نهايته البعيدة. رفع العصب بعناية أثناء تخليصه من النسيج المجاور. قطع العصب في النهاية الدانية، أقرب ما يمكن الخروج به من العمود الفقري.
8. سجل ثم الطول الإجمالي للغزو قدمه ذات الورنيّة الورنيّة باستخدام. هذا التقدير العيانية إرشادية فقط.

4-العصب التجهيز والتقدير الكمي

1. تضمين في تشريح العصب في أكتوبر مجمع. جعل التأكد من مكان الأعصاب طوليا ومسطحة كما في الجزء السفلي من العفن قدر الإمكان.
2. تشير على الكاسيت الجانب الدانية والبعيدة للعصب بوسم الحرف P و D.
3. مكان الأعصاب مضمن على رأس الجليد الجاف، وإذا كانوا هم لا مقطوع فورا. ويمكن الحفاظ على نموذج في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع.
4. قسم العينات باستخدام مبضع كريوستات في 5 ميكرومترات سمك ومكان المقاطع على الشرائح الزجاجية. إذا كان ذلك ممكناً، تناسب فروع العصب 2 كل شريحة. وتشير إلى الجانب الدانية للعصب.
5. وصمة عار على الشرائح باستخدام ح & ه تلطيخ¹².
6. رقمياً المسح الضوئي الملون فروع العصب مع شريحة-الماسح ضوئي الذي يوفر البيانات الرقمية ذات الدقة العالية.
7. استخدام برامج التصوير، قياس طول الغزو بالنقر على زر المسافة التدبير، المجال للغزو، أو أخرى المطلوب معلمات. لإجراء تقدير جيد لطول غزو، استخدام مقاطع متعددة (2 إلى 4) العصب نفسه.

النتائج

يصف هذا الأسلوب الجراحي زرع خلايا سرطان البنكرياس في العصب الوركي مورين لإنشاء نموذج في فيفو غزو العصب قابلة للقياس الكمي. ويبين الشكل 1 موقع العصب الوركي التشريحية وفي موقع الحقن. ويبين الشكل 2 الأعصاب الوركي اثنين من الماوس عارية. ي...

Discussion

في هذا البروتوكول يصف لنا في فيفو مورين نموذجا لغزو perineural التي تسمح للتقدير الكمي لغزو العصب الوركي بخلايا سرطان البنكرياس. ويتيح هذا النموذج دراسة الآليات الجزيئية لغزو العصب. تجارب ناجحة باستخدام هذه التقنية تتطلب نهجاً حذراً لثلاث خطوات حاسمة في العملية: 1) حقن الخلايا السرطانية (?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1