Vivo fare siyatik sinir modeli Perineural işgali

Özet

Biz bir vivo içinde fare modeli perineural işgalinin siyatik sinir syngeneic pankreas kanseri hücreleri enjekte edilerek tanımlamak. Model ölçüde sinir işgalinin miktar için sağlar ve araştırma perineural işgalinin hücresel ve moleküler mekanizmaları destekler.

Özet

Kanser hücrelerinin hangi kanser hücreleri çoğalırlar ve sinir microenvironment göç perineural işgali (PNI) olarak adlandırılan bir süreç sinirleri istila. İstila bu tür kanser türleri çeşitli tarafından sergilenen ve çok sık pankreas kanseri bulundu. Sinir lifleri fare pankreas içinde mikroskobik boyutunu PNI çalışmanın orthotopic fare modellerinde zor işler. Burada, nerede biz syngeneic pankreas kanseri hücre kültürünü Panc02-H7 fare siyatik sinir enjekte PNI, heterotopik vivo içinde modeli açıklar. Bu modelde, siyatik sinir imzalat farelerin maruz ve kanseri hücreleri enjekte. Kanser hücrelerinin sinirler omurilik enjeksiyon noktasından proksimale doğru istila. Baskına siyatik sinirleri sonra ayıklanır ve donmuş kesit için OCT ile işlenebilir. H & E ve bu bölümleri ayirt boyama işgali ve değişiklikleri her iki derece miktar protein ifadede izin verir. Bu model çok yönlü verilen PNI üzerinde çalışmalar çeşitli uygulanabilir. Farklı genetik değişiklikler ve/veya kanser hücrelerinin farklı türleri ile fare kullanarak PNI hücresel ve moleküler mekanizmaları incelenmesi ve farklı kanser türleri sağlar. Ayrıca, tedavi edici ajanların etkileri sinir işgali üzerinde bu farelerde tedavi uygulayarak okudu.

Giriş

Sinirleri uyarır kanser büyüme ve geçiş^1,2,3belirli tümör microenvironment oluştururlar. Perineural işgali (PNI) içinde ve çevresinde sinirler hangi kanser hücreleri istila işlemidir. Sinirler boyunca kökenli siteleri uzak kanseri istila genişletir beri metastaz benzersiz bir yol olarak düşünülebilir. PNI % 22'i % 100^1,2' ye kadar değişen bir insidans ile pankreas, prostat, baş ve boyun, tükürük, servikal ve kolorektal kanserler gibi çeşitli kanser türleri bulunur. PNI ağrı ile ilişkili olan ve kötü prognoz ve kötü hayatta kalma oranları^1,2ile karşılıklı olarak ilişkilendirir.

Modelleri perineural işgalinin geliştirmeye, hücresel ve moleküler mekanizmaları bu sürecin aydınlatmak için ve aday terapötik ajanlar PNI azaltmak için test etmek esastır. Kanser hücrelerinin sinir explants⁴, dorsal kök ganglions^5,6,7veya belirli hücreleri ile ortak kültür vitro kanserleri ve sinirler arasındaki etkileşimler eğitim yöntemleri şunlardır sinir⁷microenvironment gibi Schwann hücreleri. Vivo yaklaşımlar, ancak, daha fizyolojik ilgili, hangi kanser indüklenen nakledilen veya kanser fare modelleri kullanımını içerir ve tüm sinir microenvironment için muhasebe avantajına sahip. Orthotopic pankreas veya Prostat Kanser, PNI modelleri bildirilen^8,9,10 olmuştur ve PNI insidansı kaydedilebilir, ancak bu organlar sinirler küçük boyutu nedeniyle, görmek zordur Tüm sinir ve bu nedenle PNI kapsamını ölçmek için. Biz burada tarif hangi kanser hücreleri-basit bir cerrahi prosedür¹¹farelerin siyatik sinir içine enjekte edilir PNI vivo içinde modelin modelidir. Heterotopik transplantasyon sinir omurilik doğru içinde işgal etti. Sinir işgali sitesinden enjeksiyon spinal kord uzunluğu, yanı sıra sinir içinde kanser hacmi ölçülecek. Önemlisi, baskına sinir deneyleri mikroskobik ve moleküler analizleri de dahil olmak üzere çeşitli için toplanabilir. Kanser hücrelerinin çeşitli test ve genetik olarak değiştirilmiş veya belirli bileşikler ile tedavi ana bilgisayar fare de kullanılabilir olur. Bu güçlü tahlil kanser hücreleri ve ana bilgisayar microenvironment için PNI mekanizmaları içine soruşturma için değişiklik yapılmasına izin verir.

Protokol

Tüm yordamları hayvan konuları ile kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi tarafından kabul edildi.

1. kanser hücrelerinin hazırlanması

1. Hasat alt Konfluent Panc02-H7 hücrelerle % 0.25 tripsin 37 ° C'de 5 min için 15 mL santrifüj tüpü hücrelerde toplamak.
   Not: Hücreleri yaklaşık 12 x %10 80 confluency ve 4 mL tripsin şişesi başına⁶ hücre içeren T-225 şişesi yetiştirilen / şişesi kullanılır.
2. Senaryo Özeti 5 dk. hücre resuspending tarafından hücreleri (yukarı ve aşağı iki kez pipetting tarafından) 1 mL PBS cips ve süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp buz üzerinde aktarım yıkama için 4 ° C'de 900 g x santrifüj kapasitesi.
3. Tekrar hücreleri 5 min için 4 ° C'de 900 g x santrifüj kapasitesi ve süpernatant Pelet bozmadan atın. Buzda pelleted hücreler enjeksiyon kadar tutmak.

2. fare ve cerrahi hazırlanması

Not: Bu çalışmada 8-hafta-yaşlı, erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanılır. Ameliyat koşulları kuruluşumuzun IACUC kuralları izler. Aletleri sterilize, cerrahi çalışma yüzeyi dezenfekte, hayvan dezenfekte ve cerrah steril eldiven giyer.

1. Ameliyattan önce gününde % 2 isoflurane kullanarak fare anestezi ve dorsal tarafta femur uzunluğu boyunca kürk ince bir jilet ya da kimyasal saç kaldırma aracı ile kaldır.
2. Ameliyat günü, %2 isofluorane bir indüksiyon odasında kullanarak fare anestezi. Anesthetization bir ayak çimdik uyarıcı ve yanıt alınamaması onaylayın.
3. Veteriner merhem göz kuruluğu anestezi altında önlemek için uygulayın.
4. Ventral yan imzalat fareyi getirin ve yavaşça her bacak bacak enjekte edilir hafif gerginlik yaratmak için hipoalerjenik bant ile güvenli. Anestezi hassas Buharlaştırıcı ve burun konisi yolu ile teslim isoflurane kullanılarak korunur.
5. Enjeksiyon yeri ile Betadine, sonra tekrar % 70 alkol ile temizleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Hiçbir gevşek saç cerrahi sahada kalır emin olun.
6. Küçük makas yaklaşık 2 mm aşağıda ve uyluk kemiği paralel ile 1 cm kesi yapmak. Cilt yanal kas altında ortaya çıkarmak için Forseps ile geri çek.
7. Siyatik sinir derin gluteus maximus ve pazı kemiği kasları çalıştırır. Bu iki kaslar Fasial uçağa boyunca küçük makasla ayırmak ve siyatik sinir altında bulaşmasına neden. Künt diseksiyon kullanarak çevresindeki kas sinir ücretsiz.
8. Kanser hücrelerinin (yaklaşık 50.000 hücreleri) 3 μL Pelet 10 μL enjektör çizin.
   Not: Alternatif olarak, bir denetim olarak PBS 3 μL çizin.
9. Destek için enjeksiyon noktasında sinir altında küçük bir metal spatula yerleştirin. Diseksiyon mikroskop ile görselleştirme altında sinir sinir üzerine ekleme mümkün olduğunca paralel olarak iğne tutarak metal üssüne iğne takın. Sinir arkadan ponksiyon vermemek dikkatli olun. Sinir bu süreci boyunca mümkün olduğu kadar kullanımı en aza indirmek.
10. Yavaş yavaş sinir üzerinde 5 enjekte s. Bir ampul enjeksiyon alanında bir oluşumu iyi bir enjeksiyon gösterir. Sonra yerde 3 için iğneyi bırak iğneyi yavaşça kaldırmadan önce s. İğne 3 için yerinde tutmak s geri dışarı sinir hücrelerinin en aza indirir.
    Not: Enjeksiyon distal sinir veya spinal kord doğru gerçekleştirilebilir. Deneyler bir dizi içinde tutarlı kalması önemlidir. Hücreleri dışında dökmek, hayvan deney analize dahil edilmemesini. Deneyim ile bu olaylar çok nadirdir.
11. Sinir özgün konumuna geri dönün. Üstteki kaslı sinir kapsar. Fareler uygun analjezi ile tedavi ve Cilt 5-0 naylon sütür ile kapatın.
12. Tam anesteziden uyanır kadar fare kurtarma sırasında gözlem için temiz bir kafeste tek başına koyun.
    Not: Tam kendine gelmek hayvan için 5-15 dakika sürer. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan katılımsız sol değil. Hayvan tamamen iyileşti kadar diğer hayvanlar şirkete döndürülür. Bundan sonra kurtarma en az bir kez her 24 saat 72 h için değerlendirin.

3. siyatik sinir çıkarma

1. Ameliyat günü #7, CO₂fareler ötenazi. Fare ventral onun yanına koyun ve iğne kullanarak distal ekstremitelerde stabilize.
2. Enjekte bacak ve gövde dorsal tarafta cilt kaldırın.
3. Künt diseksiyon kullanarak, siyatik sinir kas için derin ortaya çıkarmak.
4. Sinir kursları Ilium ve sakrum arasında. Sinir omurilik bölge erişimi için iki kemik ayırın. Siyatik sinir olduğu dar alanda kapalı makas yerleştir ve makas fareyi basılı tutarak açın. Hassas ve diseksiyonu sırasında siyatik sinir bütünlüğünü korumak.
5. Siyatik sinir klemple sonuna femur ve proksimale omurilik dikkatle incelemek.
6. Not: Son derece kırılgan ve gerilim altında bilgileri veya güçlü işleme eğilimli baskına sinirler vardır.
7. Sinir distal sonuna keserek hasat. Bitişik doku boşaltma sırasında sinir çýkýntýdan. Sonunda proksimal, omurga üzerinden onun çıkış için mümkün olduğunca yakın sinir kesti.
8. Kayıt sonra bir Vernier Kaliper kullanarak işgalinin brüt uzunluğu. Bu makroskopik tahmin sadece göstergesidir.

4. işlem ve miktar cesareti

1. Disseke sinir Ekim bileşik gömün. Yapmak emin sinirler boyuna yerleştirmek ve mümkün olduğunca kalıp alt gibi dümdüz.
2. Kasette mektup P ve ö. işaretleyerek sinir proksimal ve distal tarafı belirtmek
3. Hemen kesitli değil, gömülü sinirler kuru buz, üstüne koyun. Örnek-80 ° C'de birkaç hafta için korunmuş.
4. Cryostat microtome cam slaytlara 5 mikron kalınlık ve yer bölümleri de kullanarak bölümü örnekleri. Mümkünse, slayt 2 sinir bölüm uygun. Proksimal sinir tarafında gösterir.
5. H & E¹²boyama kullanarak slaytları leke.
6. Dijital olarak lekeli sinir bölümleri ile yüksek çözünürlüklü dijital verileri sağlayan bir slayt inceden inceden inceye gözden geçirmek.
7. Görüntüleme yazılımı kullanarak ölçmek işgalinin uzunluk ölçü mesafe düğmesini tıklatarak, işgal, ya da diğer parametreleri istenen. İstila uzunluğunu iyi bir tahmin için birden çok bölüm (2-4) aynı sinir kullanın.

Sonuçlar

Bu yöntem pankreas kanseri hücreleri cerrahi implantasyon ölçülebilir sinir işgalinin vivo içinde model oluşturmak için fare siyatik sinir içine açıklar. Siyatik sinir anatomik konumunu ve Enjeksiyon Makinası şekil 1 gösterir. Şekil 2 bir çıplak fare iki siyatik sinirleri gösterir. Damarına enjekte PBS (solda) MiaPaCa-2 kanser hücreleri (sağda) enjekte bir sinir ile karşılaştırıldığında. Ka...

Tartışmalar

Bu protokol için pankreas kanseri hücreleri tarafından siyatik sinir işgalinin miktar sağlar perineural işgalinin bir vivo içinde fare modeli açıklar. Bu model sinir işgalinin moleküler mekanizmaları çalışma sağlar. Bu tekniği kullanarak başarılı deneyler üç kritik adımı sürecinde dikkatli bir yaklaşım gerektirir: 1) enjeksiyon (Adım 2.7, 2.8), kanser hücrelerinin baskına sinirler (Adım 3.4) 2) çıkarımı ve 3) hasat sinirler (Adım 4.1) işlenmesi.

En...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1