В естественных условиях мышиных седалищного нерва модель рассасывании вторжения

Резюме

Мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения путем введения сингенных поджелудочных клеток рака в седалищный нерв. Модель позволяет для количественной оценки степени нерва вторжения и поддерживает исследование молекулярных и клеточных механизмов рассасывании вторжения.

Аннотация

Раковые клетки вторгнуться нервов через процесс называется рассасывании вторжения (Пни), в котором рака клетки размножаются и мигрируют в нерв микроокружения. Этот тип вторжения выставляется различных типов рака и очень часто встречается в рак поджелудочной железы. В ортотопическая мышиных моделях микроскопических размеров нервных волокон внутри мыши поджелудочной железы затрудняет изучение PNI. Здесь мы описываем модель heterotopic в vivo пни, где мы вводим сингенных поджелудочный рак клеток линии Panc02-H7 в мышиных седалищного нерва. В этой модели седалищного нервов наркотизированных мышей подвергаются и вводят с раковых клеток. Раковые клетки вторгнуться в нервы проксимально к спинного мозга от точки инъекции. Вторглись седалищного нервов затем извлекаются и обрабатываются с октября для замороженных секционирование. H & E и иммунофлюоресценции пятнать этих разделов позволяют количественной оценки степени вторжения и изменения экспрессии белков. Эта модель может применяться для различных исследований на пни, учитывая его универсальность. С помощью мыши с различных генетических модификаций и/или различных типов раковых клеток позволяет для расследования молекулярных и клеточных механизмов пни и рака различных типов. Кроме того воздействие терапевтических агентов на нерв вторжения могут быть изучены путем применения лечения этих мышей.

Введение

Нервы образуют конкретную опухоль микроокружения, который стимулирует рак роста и миграции^1,2,3. Рассасывании вторжения (Пни) — это процесс, через который раковых клеток вторгнуться в и вокруг нервы. Он может быть рассматриваться как уникальный маршрут метастазов рака вторжения простирается от места происхождения по нервам. PNI встречается в нескольких типов рака, включая поджелудочной железы, предстательной железы, головы и шеи, слюнных, шейки матки и колоректального рака, заболеваемость, начиная от 22% до^1,100%². PNI связано с болью и коррелирует с плохим прогнозом и хуже выживание ставки^1,2.

Разработка моделей рассасывании вторжения имеет важное значение для выяснения молекулярных и клеточных механизмов этого процесса и кандидат терапевтических агентов тестирования для уменьшения PNI. В vitro методы изучения взаимодействия между раком и нервы включают в себя совместное культура раковых клеток с нерва эксплантов⁴, Спинной корень ганглиев^5,6,7или с конкретных ячеек от нерва микроокружения например Шванновские клетки⁷. В естественных условиях подходы, однако, являются более физиологически соответствующие, включают использование моделей мыши рака в которых рак индуцированных или пересадить и имеют преимущество приходится всего нерва микроокружения. В ортотопическая модели рака поджелудочной железы и простаты, PNI был сообщил^8,9,10 и заболеваемости PNI могут быть записаны, но из-за небольшого размера нервы в этих органах, трудно увидеть весь нерв и поэтому для количественной оценки степени PNI. Модель, которую мы опишем здесь является модель в vivo пни, в котором рака клетки вводят в седалищный нерв мышей через простой хирургическая процедура¹¹. Heterotopic трансплантация вторгается в сторону спинного нерва. Длина нерва вторжения с сайта инъекции для спинного мозга могут быть измерены, а также объем рака в течение нерва. Важно отметить, что вторглись нерва также могут быть собраны для различных анализов, включая микроскопические и молекулярного анализа. Целый ряд раковых клеток может быть проверена, и принимающей мышей, которые были генетически изменены или с конкретных соединений могут быть использованы также. Этот мощный assay раковые клетки и микроокружения хост позволяет быть модифицированы для расследования механизмы PNI.

протокол

Все процедуры с животных темы были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на Мемориал Слоун Kettering Рак центр.

1. Подготовка раковых клеток

1. Урожай югу вырожденная Panc02-H7 клетки с трипсин 0.25% 5 минут при 37 ° C. Соберите клетки в пластиковых пробирок 15мл.
   Настой используется / Примечание: Клетки растут в T-225 колбу, который содержит около 12 х 10⁶ клеток на колбу на 80% confluency и 4 мл трипсина.
2. Центрифуга клетки на x 900 g при 4° C для 5 минут вымыть клетки, resuspending клетки пеллет в 1 мл PBS (по закупорить вверх и вниз дважды) и передать пробки microcentrifuge 1,5 мл подвеска на льду.
3. Центрифуга клетки снова на x 900 g при 4° C за 5 мин и отбросить супернатант не нарушая гранулы. Держите гранулированных клетки на льду до инъекции.

2. Подготовка мышей и хирургии

Примечание: в этом исследовании используются 8-недельных, мужские и женские мышей C57BL/6J. IACUC хирургии условий правилам нашего учреждения. Инструменты стерилизуются, дезинфекция хирургические рабочей поверхности, вылечить животное и хирург носит стерильные перчатки.

1. За день до операции анестезировать мыши, с помощью изофлюрановая 2%, а затем удалить мех по длине бедра на спинной стороне с тонкой бритвой или химической волос удаления агента.
2. В день операции анестезировать мышей с использованием 2% isofluorane в камере индукции. Подтвердите анестезии мыс щепотку стимулом и отсутствием реакции.
3. Примените мазь ветеринар на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
4. Поместите наркотизированных мыши на вентральной стороне и осторожно закрепите каждой конечности с гипоаллергенные ленты, чтобы создать мягкий напряженность в конечности, чтобы быть введены. Анестезия поддерживается с помощью изофлюрановая, доставлено через испаритель точность и носовой конус.
5. Очистите место инъекции с Betadine, затем снова с 70% спирта. Повторите эту процедуру еще два раза. Убедитесь, что не распущенные волосы остается на операционном поле.
6. Сделайте разрез 1 см с небольшой ножницами около 2 мм ниже и параллельно к бедренной кости. Убрать кожи пинцетом боково подвергать мышц под.
7. Седалищный нерв проходит глубоких мышц ягодичной и двуглавой мышцы бедра. Разделить эти две мышцы вдоль фасциальных плоскости с маленькие ножницы и разоблачить седалищного нерва под. Бесплатный нерв от окружающих мышц с помощью тупого рассечение.
8. Сделать 3 мкл раковых клеток (около 50 000 клетки) из гранул в шприц 10 мкл.
   Примечание: в качестве альтернативы, нарисуйте 3 мкл PBS как элемент управления.
9. Место небольшой металлической лопаткой под нерва точке впрыска для поддержки. При визуализации с микроскопом рассечения Вставьте иглу в нерв против металла базы, ведение иглы параллельно нерва как можно скорее после вставки. Будьте осторожны, чтобы не проколоть через заднюю часть нерва. Свести к минимуму обработку нерва, насколько это возможно, на протяжении всего этого процесса.
10. Медленно вдохнуть в нерва более 5 s. Формирование шарик в области инъекции показывает хороший инъекции. Затем оставьте иглу в место для 3 s перед удалением иглу осторожно. Сохраняя иглу в место для 3 s минимизирует обратного потока из нервных клеток.
    Примечание: Инъекции могут выполняться к дистальной нервов или спинного мозга. Важно, чтобы оставаться неизменными в течение ряда экспериментов. Если клетки разлива снаружи, животное не должны включаться в анализ эксперимента. С опытом работы эти события очень редки.
11. Возвращение нерва в исходное положение. Обложка нерва с вышележащих мышц. Лечить мышей с надлежащей анальгезии, а затем закройте кожи с 5-0 нейлон швы.
12. Поместите курсор мыши только в чистой клетке для наблюдения во время восстановления, до тех пор, пока он полностью пробуждается от анестезии.
    Примечание: Это занимает 5-15 мин для животного, чтобы восстановить полное сознание. До тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency животное не присмотра. Животное не возвращается в компании других животных до тех пор, пока полностью выздоровел. После этого оценки восстановления по крайней мере один раз каждые 24 часа за 72 ч.

3. седалищного нерва добыча

1. На postop день #7 усыпить мышей с CO₂. Поместите курсор мыши на его вентральной стороне и стабилизировать Дистальная конечностей с помощью булавки.
2. Удалите кожу на спинной стороне вводят конечностей и туловища.
3. Использование тупой рассечение, разоблачить седалищного нерва глубоких мышц.
4. Курсы нерва между подвздошной кости и крестце. Чтобы иметь доступ к нерва в области спинного мозга, отдельные две кости. Сначала вставьте закрытые ножницы в узкой области, где находится седалищного нерва, а затем откройте Ножницы удерживая мышь. Быть деликатной и поддерживать целостность седалищного нерва при вскрытие.
5. Тщательно анализировать седалищного нерва дистально конца бедренной кости и проксимально спинного мозга.
6. Примечание: Вторглись нервы чрезвычайно хрупка и подвержена разрыва при растяжении или насильственное обращение.
7. Урожай нерв от первой резки его дистального конца. Аккуратно поднимите нерва, освобождая его от прилегающих тканей. Вырежьте нерва в проксимальном конце, как можно ближе к его выхода из позвоночника.
8. Запись, а затем полная длина вторжения с помощью штангенциркуль. Это макроскопических оценка носит лишь ориентировочный характер.

4. нерва обработки и количественная оценка

1. Внедрите расчлененных нерва в октября соединения. Убедитесь убедитесь разместить нервы продольно и как плоские в нижней части формы как можно скорее.
2. Указывают на кассету в проксимальном и дистальном части нерва, отметив письмо Р и D.
3. Место встраиваемых нервы на вершине сухой лед, если они не являются секционного немедленно. Образец может быть сохранены-80 ° c в течение нескольких недель.
4. В разделе образцы используя микротом криостата на 5 мкм толщина и место секций на стеклянных вставках. Если возможно Установите 2 нерва секции на слайд. Укажите проксимальной части нерва.
5. Пятно слайды с помощью H & E пятнать¹².
6. Сканировать разделы окрашенных нерва с слайд сканер, который обеспечивает высоким разрешением цифровые данные.
7. С помощью изображений программное обеспечение, подсчитать длину вторжения, нажав на кнопку измерение расстояния, площадь вторжения, или других желаемых параметров. Для хорошей оценки длины вторжения используйте несколько разделов (2-4) же нерва.

Результаты

Этот метод описывает хирургической имплантации поджелудочных клеток рака в мышиных седалищного нерва для создания модели в vivo количественной нерва вторжения. Рисунок 1 иллюстрирует анатомического расположения седалищного нерва и месте инъекци...

Обсуждение

В этом протоколе мы описываем в vivo мышиных модель рассасывании вторжения, который позволяет для количественной оценки седалищного нерва вторжения поджелудочных клеток рака. Эта модель позволяет изучение молекулярных механизмов нерва вторжения. Успешные эксперименты с использо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1