Vivo에서 Murine 좌 골 신경의 모델 Perineural 내 습

요약

좌 골 신경으로 syngeneic 췌장암 세포를 주입 하 여는 vivo에서 murine 모델 perineural 내 습의 설명 합니다. 모델 신경 내 습의 넓이의 부 량과 perineural 내 습의 세포 및 분자 메커니즘의 조사를 지원 합니다.

초록

암 세포 나 perineural 내 습 (PNI)는 암에서 세포 증식 및 신경 microenvironment에서 마이그레이션 프로세스를 통해 신경 침공. 이 침공의 다양 한 암 종류에 의해 전시 유형과 매우 자주 췌장암에서 발견 된다. 마우스 췌 장 내 신경 섬유의 미세한 크기 orthotopic murine 모델에 어려운 PNI의 연구를 렌더링합니다. 여기, 우리가 PNI, 어디 우리가 주입 syngeneic 췌장암 세포 라인 Panc02 H7 murine 좌 골 신경의 모델 heterotopic vivo에서 설명 합니다. 이 모델에서 좌 골 신경 마 취 쥐의 노출 하 고 암 세포를 주입. 암 세포 주입의 지점에서 척수를 향해 proximally 신경에 침입 한다. 침공된 좌 골 신경 다음 추출 하 고 10 월 냉동 단면에 대 한 처리. H & E와이 섹션의 면역 형광 염색 단백질 표정에 침입과 변경의 두 학위의 정량화를 허용 합니다. PNI 주어진 그 다양성에 대 한 연구의 다양 한에이 모델을 적용할 수 있습니다. 다른 유전 수정 또는 다른 종류의 암 세포를 마우스를 사용 하 여 다른 암 종류 및 PNI의 세포 및 분자 메커니즘의 조사에 대 한 수 있습니다. 또한, 신경 침공에 대 한 치료제의 효과이 쥐를 치료를 적용 하 여 공부 될 수 있다.

서문

신경 자극 암 성장 및 마이그레이션^1,2,3특정 종양 microenvironment를 형성 한다. Perineural 내 습 (PNI)는 암 통해 세포 및 신경 주위에 침략 하는 과정입니다. 그것은 신경 따라 원본 사이트에서 확장 암 침공 이후 전이의 유일한 노선으로 고려할 수 있습니다. PNI는 발생률이 22%에서 100^1,2에 이르기까지 췌 장, 전립선, 머리 및 목, 침, 자 궁, 대 장 암 등 여러 암 종류에서 발견 된다. PNI 통증 연관 이며 더 생존 요금^1,2, 빈약한 예 지와 연관 시킵니다.

Perineural 내 습의 모델 개발이 과정의 세포 및 분자 메커니즘을 명료 하 고 후보 치료제 PNI를 감소 테스트에 필수적 이다. 암과 신경 사이 상호 작용을 공부 방법은 시험관에 암 세포 신경 explants⁴, 느 루트 절^5,6,7, 또는 특정 셀의 공동 문화를 포함 신경에서 microenvironment 같은 Schwann 세포⁷. 그러나 Vivo에서 접근,, 더 순수 관련, 암 마우스 모델에서 암 유발 되거나 이식의 사용을 포함 되며 전체 신경 microenvironment에 대 한 회계의 이점이 있다. Orthotopic에서 췌 장 또는 전립선 암, PNI 모델 보고^8,,910 고 PNI의 발생률, 기록 될 수 있습니다 되었지만 그 기관에서 신경의 작은 크기 때문에 그것은 어려운 볼 수 전체 신경 따라서 PNI의 정도 계량 하기. 우리는 여기에 설명 하는 모델 PNI는 암 세포는¹¹간단한 수술 통해 쥐의 좌 골 신경에 주입의 비보에 모델이입니다. Heterotopic 이식으로 척수 신경 내의 침공. 척수 주사의 사이트에서 신경 침공의 길이 신경 내 암의 볼륨 뿐만 아니라, 측정 될 수 있습니다. 중요 한 것은, 침략된 신경 분석 현미경, 분자 분석을 포함 한 다양 한도 수집할 수 있습니다. 암 세포의 다양 한 시험 될 수 있다, 그리고 호스트 쥐 유전자 수정 되거나 특정 화합물으로 치료도 사용 될 수 있습니다. 이 강력한 분석 결과 암 세포 및 호스트 microenvironment PNI의 메커니즘에 조사에 대 한 수정할 수 있습니다.

프로토콜

동물 주제와 절차의 모든 기관 동물 관리 및 사용 위원회 기념 슬로 안 Kettering 암 센터에 의해 승인 되었다.

1입니다. 암 세포의 준비

1. 37 ° c.에 5 분 동안 0.25 %trypsin 수확 하위 confluent Panc02 h 7 셀 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포를 수집 합니다.
   참고: 셀에서에서 재배 되 고 T-225 플라스 크, 포함 약 12 x 10 80 %confluency 및 4 mL trypsin에 플라스 크 당⁶ 셀/플라스 크를 사용 합니다.
2. 5 분 세척 resuspending 셀에 의해 셀 펠 렛의 1 mL의 PBS에 pipetting 아래로 두 번), (여 고 전송 현 탁 액 1.5 mL microcentrifuge 튜브 얼음에 4 ° C에서 900 g x에서 셀 원심
3. 5 분 동안 4 ° C에 900 g x에서 다시 셀 원심 고는 펠 렛을 방해 하지 않고는 상쾌한 삭제. 사출까지 얼음에 수송과 셀을 계속.

2입니다. 마우스 및 수술 준비

참고: 8 주 오래 된, 남성 및 여성 C57BL/6J 쥐가이 연구에 사용 됩니다. 수술 조건 우리의 기관의 IACUC 규칙을 따릅니다. 악기 소독, 수술 작업 표면 소독 동물 소독 하 고 외과 의사 멸 균 장갑 착용.

1. 수술 전날에 2 %isoflurane 사용 하 여 마우스를 anesthetize 하 고 얇은 면도칼 또는 화학 머리 제거 에이전트 등 쪽 측에 대 퇴 골의 길이 따라 모피를 제거 합니다.
2. 수술 당일, 유도 실에서 2 %isofluorane 사용 하 여 마우스를 anesthetize. 발가락 꼬집어 자극과 응답의 부족에 의해 anesthetization를 확인 합니다.
3. 수 의사 연 고 마 취 건조를 방지 하기 위해 눈에 적용 됩니다.
4. 그것의 복 부 측에 마 취 마우스를 놓고 부드럽게 주입을 다리에 가벼운 긴장을 만들 저자 극성 테이프와 각 다리를 확보 합니다. 마 취 isoflurane 정밀 기화와 원뿔 통해 전달 사용 하 여 유지 됩니다.
5. 70% 알코올로 Betadine, 사출 사이트를 다시 청소 하십시오. 이 프로세스를 두 번 더 반복 합니다. 느슨한 머리카락 수술 필드에 남아 있는지 확인 합니다.
6. 작은 위 아래 및 대 퇴 골에 병렬 약 2 m m 1 cm 절 개를 확인 합니다. 피부 아래 근육을 노출 하는 옆 집게와 철회.
7. 좌 골 신경은 대 둔 근과 팔 뚝 femoris 근육에 깊은 실행 됩니다. 작은 위 fascial 비행기에 따라이 두 근육을 분리 하 고 노출 아래 좌 골 신경. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여 주변 근육에서 신경 무료.
8. 10 μ 주사기로 펠 릿에서 암 세포 (약 5만 셀)의 3 μ를 그립니다.
   참고: 컨트롤 또는 PBS의 3 μ를 그립니다.
9. 지원에 대 한 주입 시점에서 신경 아래 작은 금속 주걱을 놓습니다. 해 현미경으로 시각화, 아래 바늘 삽입 시 가능한 신경에 평행으로 유지 하는 금속 베이스에 대 한 신경에 바늘을 삽입 합니다. 신경의 뒷면을 통해 펑크를 주의 해야 합니다. 이 과정을 통해 가능한 한 많은 신경의 처리를 최소화 합니다.
10. 이상 5 신경으로를 천천히 주입 s. 주입 영역에서 전구 형성 좋은 주사를 나타냅니다. 다음 3 자리에 바늘을 두고 바늘을 부드럽게 제거 하기 전에 s. 3 장소에 바늘을 유지에서 신경 세포의 역류를 최소화 하는 s.
    참고: 주입은 말 초 신경이 나 척수 쪽으로 수행할 수 있습니다. 그것은 실험의 집합 내에서 일관성을 유지 해야 합니다. 세포 밖으로 유출, 동물 실험의 분석에 포함 되지 해야 합니다. 경험, 이러한 이벤트는 매우 드문.
11. 신경을 원래 위치로 돌아갑니다. 커버 overlying 근육 신경. 적절 한 진통으로 쥐를 처리 한 다음 5-0 나일론 봉합 피부를 닫습니다.
12. 그것은 완전히 마 취에서 깨어난다 때까지 마우스를 복구 하는 동안 관찰에 대 한 깨끗 한 장에 혼자 놓습니다.
    참고: 그것은 완전 한 의식 회복을 동물에 대 한 5-15 분 걸립니다. 동물 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 때까지 무인 왼쪽입니다. 동물 다른 동물을 완벽 하 게 복구 될 때까지 회사에 반환 되지 않습니다. 그 후, 복구 적어도 한 번 모든 24 h 72 h에 대 한 평가.

3. 좌 골 신경 추출

1. Postop 날 #7, CO₂마우스를 안락사. 그것의 복 부 측에 마우스를 놓고 핀을 사용 하 여 원심 사지를 안정화 합니다.
2. 주입 된 사지 및 몸통의 등 쪽 측에 피부를 제거 합니다.
3. 무뚝뚝한 절 개를 사용 하 여, 좌 골 신경은 근육에 깊은 노출.
4. 장 골과 천 골 사이 신경 과정. 척수 영역에서 신경에 액세스 하려면, 두 개의 뼈를 구분 합니다. 좌 골 신경은 좁은 지역에 폐쇄가 위를 먼저 삽입 한 다음 마우스를 잡고가 위를 엽니다. 섬세 한 수 고 해 부 동안 좌 골 신경의 무결성을 유지 합니다.
5. 조심 스럽게 좌 골 신경 distally, 대 퇴 골의 끝을 proximally 척수 해 부.
6. 참고: 침공된 신경은 매우 연 약하고 긴장 아래 속보 또는 강력한 처리 하는 경향이 있다.
7. 신경의 선단부를 절단 하 여 수확. 인접 한 조직에서 그것을 해방 하는 동안 신경을 조심 스럽게 들어올립니다. 척추에서 그것의 출구에 최대한 가깝게 인접 끝에 신경을 잘라.
8. 기록 후 버 니 어 캘리퍼스를 사용 하 여 침략의 총 길이. 이 거시적인 추정만 나타내는 것입니다.

4. 신경 처리 및 정량화

1. 10 월 복합에 해 부 신경을 포함 합니다. 경도 신경을 확실 하 고 가능한 몰드의 바닥에 평평.
2. 편지 P 및 d.를 표시 하 여 신경의 근 위 및 원심 측 카세트에 표시
3. 그들은 하지 즉시 sectioned 하는 경우 드라이 아이스, 위에 포함 된 신경을 배치 합니다. 샘플 몇 주 동안-80 ° C에서 보존 될 수 있습니다.
4. 섹션 샘플 Cryostat 톰을 사용 하 여 유리 슬라이드에 5 μ m 두께 장소 섹션에서. 만약에 가능 하다 면, 슬라이드 당 2 신경 섹션 적합. 신경의 근 위 쪽을 나타냅니다.
5. H & E¹²얼룩을 사용 하 여 슬라이드를 얼룩.
6. 디지털 고해상도 디지털 데이터를 제공 하는 슬라이드 스캐너로 얼룩진된 신경 섹션을 검색 합니다.
7. 측정 거리 버튼을 클릭 하 여 침략의 길이 계량 이미징 소프트웨어를 사용 하 여, 침입, 또는 다른 영역 매개 변수를 원하는. 침략의 길이의 좋은 의견에 대 한 동일한 신경의 여러 부분 (2 ~ 4)를 사용 합니다.

결과

이 방법은 같지는 신경의 비보에 모델을 만드는 murine 좌 골 신경으로 췌장암 세포의 외과 이식을 설명 합니다. 그림 1 좌 골 신경의 해 부 위치 및 주사의 사이트를 보여 줍니다. 그림 2 는 누드 마우스의 두 좌 골 신경. 주입 하는 PBS 신경 (왼쪽) MiaPaCa-2 암 세포 (오른쪽)와 함께 주입 하는 신경에 비교 될 수 있습니다. 암 ?...

토론

이 프로토콜에서 우리는 vivo에서 murine 모델 췌장암 세포에 의해 좌 골 신경의 정량화에 대 한 있도록 perineural 내 습의 기술. 이 모델에는 신경의 분자 메커니즘의 연구 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 성공적인 실험 과정에서 3 개의 중요 한 단계에 대 한 신중 접근 필요: 1)의 주입 암 세포 (2.7, 2.8), 단계 2) 침공된 신경 (3.4 단계)의 추출 및 수확된 신경 (4.1 단계)의 3) 처리.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1