神経周囲浸潤のIn Vivoマウスの坐骨神経モデル

要約

坐骨神経に同系膵癌細胞を注入することによって浸潤の体内マウス モデルについて述べる。モデル神経浸潤の程度の定量化と浸潤細胞および分子メカニズムの調査をサポートしています。

要約

癌細胞浸潤 (PNI)、がん細胞が増殖し、神経の微小環境の移行と呼ばれるプロセスを介して神経に侵入します。このタイプの侵略は様々 な癌の種類は、展示し、膵臓癌の発見は非常に頻繁。マウスの膵臓の神経線維の微細なサイズは、直交異方性マウスモデルで難しい PNI の研究をレンダリングします。ここでは、マウスの坐骨神経に同系膵癌細胞株 Panc02 H7 を注入我々 PNI の生体内異所性モデルについて述べる.このモデルでは、麻酔下マウスの坐骨神経を公開され、がん細胞を注入します。挿入ポイントから脊髄に向かって近位の神経の癌細胞に侵入します。侵略の坐骨神経は抽出し、10 月冷凍区分のため処理します。H & E と以下の免疫蛍光染色は、蛋白質の表現の侵略の度に変化の定量化を許可します。このモデルは、その汎用性を与え PNI に関する研究各種に適用できます。PNI の細胞および分子メカニズムの調査のため、別のがんの種類によりさまざまな遺伝的変更および/または異なったタイプの癌細胞とマウスを使用します。さらに、これらのマウスに治療を適用することによって神経浸潤に対する治療薬の効果を学ぶことができます。

概要

神経は、がんの成長と移行^1,2,3を刺激する特定の腫瘍微小環境を形成します。浸潤 (PNI) は、神経周辺を介して、がん細胞に侵入するプロセスです。それは、癌の浸潤が神経に沿って元のサイトから延びてので転移のユニークなルートとして考慮されるかもしれない。PNI は 22% から 100^1,2に至るまで発生率と膵臓、前立腺、頭と首、唾液、子宮頚部、大腸癌を含むいくつかのがんの種類で発見されます。PNI 痛みに関連付けられ、予後不良と悪い生存率^1,2と相関します。

神経周囲浸潤のモデルの開発は、このプロセスの細胞および分子メカニズムを明らかにし、梗数を減らす治療剤の候補物質をテストするのには不可欠です。癌と神経間相互作用を勉強の in vitro方法があります神経外植片⁴後根罹^5,6、7、または特定のセル癌細胞の共培養神経からシュワンなど微小細胞⁷をです。生体内でのアプローチは、ただし、もっと生理学的に関連して、癌マウスモデルでがんが誘発または移植の使用を含む、会計全体の神経の微小環境の利点があります。同所性同種膵や前立腺癌、PNI のモデルはずっと報告された^8,9,10 PNI の発生率が記録される可能性がありますがこれら器官の神経のサイズが小さいため参照してくださいすることは困難です。全体の神経とそのため梗数の程度を定量化します。ここで述べるモデルは単純な手術¹¹を介してマウスの坐骨神経に注入される細胞の癌 PNI の体内モデルです。異所性移植は、脊髄へ神経内に侵入します。脊髄注射のサイトから神経の侵略の長さ測定される、神経中の癌のボリュームだけでなく。重要なは、侵略の神経は様々 なアッセイを顕微鏡、分子解析などのも収集できます。様々 な癌細胞をテストことができますと遺伝的に変更または特定化合物処理ホスト マウスを使用することもことがあります。この強力なアッセイとは、がん細胞とホスト微小環境 PNI のメカニズムを調査用に変更します。

プロトコル

すべての動物の主題のプロシージャは機関動物ケア、メモリアルスローンケタ リング癌センターで利用委員会によって承認されました。

1. がん細胞の調製

1. 37 ° C で 5 分間 0.25% トリプシン サブ合流する Panc02 H7 セルを収穫します。15 mL 遠心管の細胞を収集します。
   注: セルは、80% の confluency と 4 mL のトリプシンでフラスコあたり約 12 × 10⁶セル T-225 フラスコで育つ/フラスコを使用します。
2. 5 分洗って再細胞による細胞 (でピペッティングを上下 2 回)、1 mL の PBS でペレット、氷の懸濁液を 1.5 mL 遠心チューブに転送のための 4 ° C で 900 g x で細胞を遠心します。
3. 4 ° C、5 分で 900 g x で再び細胞を遠心し、ペレットを乱すことがなく上澄みを廃棄します。注射まで氷の上小球形にされた細胞を保ちます。

2. マウスや手術の準備

メモ: この研究では 8 週齢、男性と女性の c57bl/6 j マウス使用します。手術条件当院の IACUC 規則に従います。器具を滅菌、手術の作業面の消毒、動物の消毒、外科医は、滅菌手袋を着用します。

1. 手術前に日に 2% イソフルランを使用してマウスを麻酔、薄いかみそりまたは化学毛の除去剤で背側の大腿骨の長さに沿う毛皮を取り外します。
2. 手術の日、部屋に誘導 2 %isofluorane を用いたマウスを麻酔します。つま先ピンチ刺激と応答の欠如によって anesthetization を確認します。
3. 麻酔下での乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用します。
4. 腹側に麻酔下のマウスを置き、ゆっくり注入するのには、手足に軽い張力を作成する低刺激性のテープで各のリムを保護します。麻酔はイソフルレン ノーズコーンと精度気化器を介して配信を使用して維持されます。
5. その後、再び 70% アルコールで Betadine で注射部位をきれい。さらに 2 回繰り返します。手術野の緩い毛が残っていないことを確認します。
6. 小さなハサミと大腿骨平行に下約 2 mm で 1 cm の切開を確認します。下にある筋肉を公開するために横方向にピンセットで皮膚を撤回します。
7. 坐骨神経は、大殿筋と大腿二頭筋の筋への深い実行されます。小さなハサミで筋膜平面に沿ってこれらの 2 つの筋肉を分離し、下に坐骨神経を公開します。鈍的切離を使用して周囲の筋肉から神経を解放します。
8. 10 μ L のシリンジにペレットから癌細胞 (約 50,000 細胞) の 3 μ L を描画します。
   注: 別の方法として、コントロールとして 3 μ L の PBS を描画します。
9. サポートのために注射の時点で神経の下に小さな金属のヘラを配置します。解剖顕微鏡で観察、下で挿入時に可能な限り神経を並列として針を維持する、金属ベースに対して神経に針を挿入します。神経の背面を穿刺しないように注意します。このプロセス全体を通じて、できるだけ神経の処理を最小限に抑えます。
10. 神経 5 以上にゆっくりと注入 s。噴射領域での球根の形成は良い注入を示します。3 のための場所で針を残してそっと針を削除する前に s。3 のための場所で針を維持する s 神経から細胞の逆流を最小限に抑えます。
    注: 末梢神経や脊髄に向かって注入が行えます。実験のセット内で一貫性を維持することが重要です。場合は、細胞は、外流出、実験における動物を含めない。経験と、これらのイベントは非常にまれです。
11. 神経を元の位置に戻ります。覆っている筋肉と神経をカバーします。適切な鎮痛を持つマウスを治療し、5-0 ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
12. それは完全に麻酔から覚醒するまで、復旧中に観察のためきれいなケージで一人でマウスを配置します。
    注: それは完全な意識を取り戻すために動物のための 5-15 分かかります。それは胸骨の横臥を維持するために十分な意識を取り戻したまで動物は放置しません。動物は他の動物を完全に回復するまでの会社に返されません。その後、少なくとも 72 時間のすべての 24 h の回復を評価します。

3. 坐骨神経抽出

1. Postop 日 #7、CO₂を持つマウスを安楽死させます。腹側にマウスを置き、ピンを使用して遠位四肢を安定します。
2. 注入された手足と胴体の背側の皮膚を削除します。
3. 鈍的切離を使用、深い筋肉に坐骨神経を公開します。
4. 腸骨と仙骨の間の神経のコース。脊髄領域における神経へのアクセスを持っている、2 つの骨を区切ります。まず坐骨神経がある狭い領域で閉じたハサミを挿入し、マウスを押しながらはさみを開きます。繊細し、解剖中坐骨神経の整合性を維持します。
5. 慎重に、大腿骨骨端を遠位と近位脊髄に坐骨神経を解剖します。
6. 注: 侵略の神経は非常に壊れやすく、引張り破断や強制的な処理になりやすいです。
7. 最初の遠位端を切断することによって神経を収穫します。隣接組織から解放しながら神経を慎重に持ち上げます。近位端、脊柱から出口にできるだけ近くで神経を切る。
8. 記録し、ノギスを使用して侵入の総長さ。このマクロ的推定は示しています。

4. 神経処理と定量

1. 10 月化合物に切り裂かれた神経を埋め込みます。神経を縦に配置することを確認して、できるだけモールドの底部の平らを確認します。
2. カセットの P と D の文字をマークすることによって神経の近位および遠位側を示す
3. 彼らはすぐに区分がない場合は、ドライの氷の上に埋め込まれた神経を配置します。サンプルは、数週間-80 ° C で保存可能性があります。
4. クライオスタット ミクロトームを使用してスライド ガラスに 5 μ m の厚さと場所セクションでセクションのサンプル。可能であれば、合わせて 2 神経セクションごとにスライド。神経の近位側を示します。
5. H & E 染色¹²を使用してスライドを染色します。
6. デジタル高解像度デジタル データを提供するスライド スキャナーで汚された神経のセクションをスキャンします。
7. 測定距離ボタンをクリックして侵略の長さを定量化するイメージング ソフトウェアを使用して、侵入、または他の領域はパラメーターを希望します。侵略の長さの良い推定、同じ神経の複数のセクション (2、4) を使用します。

結果

このメソッドは、定量化可能な神経浸潤の生体内でモデルを作成するマウスの坐骨神経に膵臓癌細胞の外科的移植について説明します。図 1は、坐骨神経の解剖学的位置と注射部位を示しています。図 2は、裸のマウスの 2 つの坐骨神経を示しています。(右) MiaPaCa 2 がん細胞を注入した神経に注入 PBS 神経 (左) が比?...

ディスカッション

このプロトコルでは膵臓癌細胞による坐骨神経浸潤の定量化は、浸潤の体内マウス モデルをについて説明します。このモデルにより、神経浸潤の分子メカニズムの研究です。この技術を用いた実験の成功プロセスで 3 つの重要な手順に慎重なアプローチが必要: 2) 侵略神経 (ステップ 3.4) の抽出と収穫された神経 (手順 4.1) の処理 3) 癌細胞 (手順 2.7、2.8) の 1) の注入。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1