神经入侵的体内小鼠坐骨神经模型

摘要

我们描述了一个体内小鼠神经入侵的模型, 注射自体胰腺癌细胞进入坐骨神经。该模型允许定量的神经入侵程度, 并支持调查的细胞和分子机制的神经入侵。

摘要

癌细胞通过称为神经侵袭 (PNI) 的过程侵入神经, 癌细胞在神经微环境中增殖和迁移。这种类型的入侵是由多种类型的癌症所表现出来的, 而且在胰腺癌中也经常出现。小鼠胰腺内神经纤维的显微大小使 PNI 在原位鼠模型中的研究更加困难。在这里, 我们描述一个异位的在体内模型的 PNI, 我们注射自体胰腺癌细胞系 Panc02-H7 到小鼠坐骨神经。在该模型中, 麻醉小鼠的坐骨神经被暴露并注入癌细胞。癌细胞从注射点到脊髓的神经向下部侵袭。侵入的坐骨神经, 然后提取和处理与 OCT 的冰冻切片。H & E 和免疫荧光染色这些部分允许量化的入侵程度和变化的蛋白质表达。该模型可应用于 PNI 的多种研究, 考虑了其通用性。使用不同基因修饰的小鼠和/或不同类型的癌细胞, 可以调查 PNI 和不同癌症类型的细胞和分子机制。此外, 治疗药物对神经侵袭的影响可以通过对这些小鼠的治疗来研究。

引言

神经形成特定的肿瘤微环境, 刺激癌症的生长和迁移^1,2,3。神经入侵 (PNI) 是癌细胞在神经和周围侵袭的过程。它可能被认为是一种独特的转移途径, 因为癌症入侵从起源的地方沿神经。PNI 有多种癌症类型, 包括胰腺、前列腺、头 & 颈部、唾液腺、宫颈癌和结直肠癌, 发病率从22% 到 100%^1,2不等。PNI 与疼痛相关, 预后较差, 存活率更差^1,2。

神经入侵的发展模式对于阐明这一过程的细胞和分子机制, 以及检测候选治疗剂以减少 PNI 是至关重要的。体外方法研究癌症和神经之间的相互作用, 包括与神经外植体的癌细胞共培养⁴, 背根脊神经^5,6,7, 或特定细胞从神经微环境例如雪旺细胞⁷。然而,体内方法在生理上是相关的, 包括使用癌症小鼠模型, 在这种模式中, 癌症已经被诱导或移植, 并具有占整个神经微环境的优势。在胰腺或前列腺癌的原位模型中, PNI 报告了^8,9,10 , PNI 的发病率可能会被记录下来, 但是由于这些器官神经的体积小, 很难看到整个神经, 因此量化 PNI 的程度。我们在这里描述的模型是一个在体内模型中的 PNI, 其中癌细胞通过一个简单的手术程序¹¹注入到小鼠的坐骨神经中。异位移植在神经内侵袭脊髓。从注射部位到脊髓的神经侵入的长度可以测量, 以及神经内的肿瘤体积。重要的是, 侵入神经也可以收集各种化验, 包括显微, 分子分析。可以对多种癌细胞进行检测, 并使用特定化合物进行基因修饰或治疗的宿主老鼠。这一强有力的化验允许肿瘤细胞和宿主微环境被修改, 以调查的机制, PNI。

研究方案

所有的程序与动物的对象是批准的机构动物护理和使用委员会在纪念斯隆凯特林癌症中心。

1. 肿瘤细胞的制备

1. 收获亚汇合 Panc02-H7 细胞与0.25% 胰蛋白酶为5分钟在37°c。收集15毫升离心管中的细胞。
   注: 细胞生长在 T-225 烧瓶中, 它包含大约 12 x 10⁶细胞每瓶在80% 融合和4毫升胰蛋白酶/烧瓶使用。
2. 离心机在900克的细胞在 4°c 5 分钟, 通过 resuspending 细胞颗粒在1毫升的 PBS (由吹打上下两次), 并转移悬浮到1.5 毫升离心管冰。
3. 再次离心细胞在900克在 4°c 5 分钟, 并放弃上清, 不干扰颗粒。把颗粒细胞放在冰上直到注射。

2. 小鼠的制备与手术

注: 本研究使用8周大、雄性和雌性 C57BL/6J 小鼠。手术条件遵循本机构的 IACUC 规则。器械消毒, 手术工作表面消毒, 动物消毒, 外科医生佩戴无菌手套。

1. 在手术前一天, 麻醉老鼠使用2% 异氟醚, 然后用一把薄剃刀或化学脱毛剂将皮毛沿着股骨的长度移除。
2. 在手术当天, 麻醉在诱导腔内使用 2% isofluorane 的老鼠。通过脚趾捏刺激和缺乏反应来确认麻醉。
3. 在眼部应用兽医软膏, 防止麻醉时的干燥。
4. 将麻醉的老鼠放在腹侧, 用低过敏的胶带轻轻地固定每一个肢体, 使其在肢体中产生轻度的张力。麻醉是维持使用异氟醚提供通过一个精确的蒸发器和鼻锥。
5. 用 Betadine 清洁注射部位, 再用70% 酒精。重复此过程两次。确保没有松动的头发留在手术领域。
6. 做一个1厘米切口与小剪刀约2毫米以下和平行的股骨。在侧面用镊子缩回皮肤, 露出下面的肌肉。
7. 坐骨神经向臀大肌和股二头肌肌肉深部延伸。用小剪刀将这两块肌肉沿筋膜平面分开, 露出坐骨神经下面。用钝夹层释放周围肌肉的神经。
8. 绘制 3 ul 的癌细胞 (约5万细胞) 从颗粒成 10 ul 注射器。
   注: 另一种做法是, 将 PBS 的 3 ul 作为控件绘制。
9. 将一个小金属铲下的神经在注射点的支持。在可视化的解剖显微镜下, 将针插入神经对金属底座, 使针与神经平行, 在插入时尽可能。小心不要刺穿神经的背部。在整个过程中尽量减少对神经的处理。
10. 在5秒内慢慢注入神经。在注射区形成灯泡表明注射良好。然后把针放在原地3秒, 然后轻轻地取出针。保持针到位为 3 s 最小化细胞回流的神经。
    注: 可对远端神经或脊髓进行注射。在一组实验中保持一致是很重要的。如果细胞外泄, 动物不应纳入实验分析。有经验, 这些事件是非常罕见的。
11. 把神经放回原来的位置。用上覆的肌肉遮住神经。用适当的镇痛治疗小鼠, 然后用5-0 尼龙缝线闭合皮肤。
12. 在恢复期间, 将鼠标单独放在干净的笼子里观察, 直到它完全从麻醉中苏醒。
    注意: 动物恢复全意识需要5-15 分钟。动物没有被留在无人看管, 直到它恢复了足够的意识, 以维持胸骨卧床。在完全恢复之前, 动物不会返回到其他动物的公司。此后, 每24小时至少评估一次恢复72小时。

3. 坐骨神经提取

1. 在术后女人天 #7, 弄死与_CO2 的鼠标。将鼠标放在腹侧, 用别针稳定远端四肢。
2. 去除注射肢体和躯干背面的皮肤。
3. 使用钝夹层, 将坐骨神经深深暴露在肌肉上。
4. 髂骨和骶骨之间的神经路线。要获得脊髓区的神经, 请将两根骨头分开。首先在坐骨神经所在的狭窄区域插入闭合剪刀, 然后在按住鼠标的同时打开剪刀。在解剖过程中保持坐骨神经的完整性和细腻。
5. 仔细解剖坐骨神经远端到股骨端, 下部到脊髓。
6. 注意: 侵入神经非常脆弱, 容易在紧张或强力处理下折断。
7. 先割下它的远端, 才能收获神经。小心抬起神经, 同时从相邻的组织中释放它。切断神经在近端, 尽可能接近其退出从脊柱。
8. 用游标卡尺记录下入侵的总长度。这种宏观估计只是指示性的。

4. 神经处理和量化

1. 将解剖神经嵌入 OCT 化合物中。确保将神经纵向和尽可能平坦的模具底部。
2. 通过标记字母 P 和 D, 在卡带上显示神经的近端和远端。
3. 如果不立即切片, 将嵌入的神经放在干冰的顶端。样品可以保存在摄氏-80 摄氏度几个星期。
4. 部分样品使用恒温器切片在5微米厚度和地方部分在玻璃幻灯片。如有可能, 每张幻灯片应符合2神经节。表示神经的近端。
5. 使用 H & E 染色着色幻灯片¹²。
6. 用可提供高分辨率数字数据的滑动扫描仪对染色的神经部分进行数字扫描。
7. 使用成像软件, 通过单击测量距离按钮、入侵区域或其他所需参数来量化入侵的长度。为了很好地估计入侵的长度, 使用同一神经的多节 (2 到 4)。

结果

该方法描述了胰腺癌细胞移植到小鼠坐骨神经中的外科植入, 以建立一个可量化的神经入侵的体内模型。图 1说明了坐骨神经和注射部位的解剖位置。图 2显示了裸鼠的两个坐骨神经。PBS 注入神经 (左) 可与 MiaPaCa-2 癌细胞 (右) 注入的神经进行比较。癌细胞注入的神经被肿瘤浸润, 比用 PBS 注入的神经更厚、更暗。

讨论

在本协议中, 我们描述了一个在体内小鼠神经入侵模型, 它允许量化的坐骨神经侵袭的胰腺癌细胞。该模型能够研究神经入侵的分子机制。成功的实验使用这项技术需要谨慎的方法, 在三关键步骤的过程中: 1) 注射癌细胞 (步骤 2.7, 2.8), 2) 提取的侵入神经 (步骤 3.4) 和 3) 处理收获的神经 (步骤 4.1)。

注射应该非常小心, 以避免刺穿神经后壁, 导致癌细胞的损失。一旦针到位, ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse			Number and age variable depending on experimental needs
Cell culture media (PBS, Trypsin, and DMEM+10% FBS)	Any		Steps 1.1, 1.2, 1.3.
Conical centrifuge tube, 50 mL	Falcon	352098	Step 1.1
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Axygen	MCT-150-C-S	Step 1.2
Electric razor	WAHL	9962	Step 2.1. Can be substituted with commercial hair removal agent
Isoflurane, 250 mL	Baxter	1001936060	Step 2.2
Hypoallergenic surgical tape	3M Blenderm	70200419342	Step 2.3
Betadine Swapsticks	PDI	SKU 41350	Step 2.4
Webcol Alcohol Preps	Covidien	5110	Step 2.4
Sterile surgical tools (scissors and forceps)			Steps 2.4, 2.5, 3.3, 3.4, 3.5
10 μL Hamilton syringe	Hamilton	80308	Steps 2.7, 2.8
Steel Micro spatula	Fisher Scientific	S50823	Step 2.7
Dissecting microscope			Step 2.7
Bupivacine, 1 g	Enzo Life Sciences	BML-NA139-0001	Step 2.9. Reconstitute to 0.5%
5-0 Nylon suture	Ethicon	698H	Step 2.9
Tissue-Tek O.C.T. Compound	VWR	25608-930	Step 4.1
Tissue-Tek Cryomold Molds	VWR	25608-916	Step 4.1