JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم بروتوكولا للتحقيق الحديث المتبادل بين كربونات الكالسيوم المشع أشعة X-2 وخلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC). البروتوكول ويبدأ مع التشعيع كربونات الكالسيوم-2 وإنشاء ثقافة المشارك مع ببمك؛ فيما بعد، يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارية بانتظام خلال 48 وصمة عار ح والغربية أداؤها في كل من كربونات الكالسيوم-2 وببمك.

Abstract

البروتوكول الذي اعتمد في هذا العمل يهدف إلى كشف كيف الأشعة السينية التشويش عمل الحاجز المعوي، مع التركيز على التفاعل بين الخلايا السرطانية القولون والجهاز المناعي. سرطان القولون والمستقيم من النوع الأكثر شيوعاً من السرطان، وعادة ما تعالج بالجراحة والعلاج الكيميائي والعلاج بالأشعة. مزايا العلاج بالأشعة في استهداف الورم معروفة جيدا. ومع ذلك، محدودة حتى التعرض من الأنسجة السليمة تثير قلقا كبيرا، لا سيما فيما يتعلق بالآثار على جدار الأمعاء والجهاز المناعي. يسمح الإعداد المعتمدة لدراسة التفاعل بين اثنين من السكان خلية في حالة أشبه بواحد الفسيولوجية، عند مقارنتها بالثقافات الخلية العادية. لهذا الغرض، علينا اللجوء إلى تقنيات مختلفة واستخدمنا في المختبر ثقافة المشتركة نموذجا، تستند إلى خلايا كربونات الكالسيوم-2 متباينة كأحادي الطبقة وببمك، تقاسم المتوسطة الثقافة نفسها. وقد وضعت هذا البروتوكول إلى التركيز على حد سواء الآثار العيانية و أي خلية البقاء والمقاومة الكهربائية عبر الظهارية (طير)، وعن طريق لطخة غربية، التعديلات الجزيئية، أي تنشيط المسار التحريضية في الخلايا المناعية ومفرق ضيق التعبير البروتين في الخلايا من كربونات الكالسيوم-2. تقييم أولى لآثار الإشعاع على بقاء الخلية 2 كربونات قيمت عبر بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT) وفحوصات تريبان الأزرق، في حين تم قياس طير في فترات زمنية محددة من خلال الاومتر مصممة خصيصا لأنظمة الثقافة المشتركة. وبهذه الطريقة، يمكن البرهنة الآثار الناجمة عن الإشعاع، والوجود من طرفي الدم وحيدات النوى الخلايا (ببمك)، وفي نهاية المطاف على أثر التآزري،. من خلال هذه التقنيات التكميلية، لاحظنا إذاعة-مقاومة عالية من كربونات الكالسيوم-2 داخل نطاق غراي 2-10 "من الأشعة السينية" ونفاذيه أحادي الطبقة كربونات الكالسيوم-2 زيادة عندما أضيفت ببمكس. على وجه الخصوص، تبين وجود PBMC تترافق مع الاختلاف في تعبير البروتينات سقالة مفرق ضيق.

Introduction

المنهجية التي اعتمدت في هذا العمل يهدف إلى التحقيق في التفاعل بين خلايا سرطان القولون والمستقيم والنظام المناعي، واستغلال البنية أقرب إلى الحالة الفسيولوجية بالمقارنة مع الثقافات الخلية 2-الأبعاد العادية.

ويعتبر سرطان القولون والمستقيم (CRC) النوع الثالث الأكثر شيوعاً من السرطان، مع أكثر من 1 مليون حالات في جميع أنحاء العالم (المرصد السرطان العالمي، والوكالة الدولية لبحوث السرطان، "منظمة الصحة العالمية"، http://gco.iarc.fr). إدارة لجنة حقوق الطفل يتم بشكل روتيني من خلال أما الجراحة أو العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي1. بالمقارنة مع التقنيات الغازية مثل الجراحة أو العلاج الكيميائي، العلاج الإشعاعي إلى حد كبير يتجنب ردود الفعل الجهازية تضر نموذجي المستمدة من هذه الطرق السريرية، وبفضل المترجمة إيصال الجرعة الإشعاعية. ومع ذلك، يمكن أن تنشأ الآثار الجانبية في الأنسجة السليمة المحيطة بها، تسبب التهاب بالضرر المباشر للخلايا السليمة والأضرار بالآثار غير المستهدفة2،،من34وساطة. التركيز على الآثار السلبية بسبب الإشعاع أثناء علاج سرطان القولون والمستقيم، تحتاج إلى جانبين التحقيق فيها. أولاً، يمكن تغيير الآليات المسؤولة عن نفاذية الأمعاء بتسليم الإشعاع يسبب، بدوره، إمكانية الآثار الجانبية نظراً احتواء غيرت من سكان الجرثومي ومرور باراسيلولار الجزيئات والذوائب. ثانيا، وجود الأنسجة اللمفية المرتبطة بالقناة الهضمية (جالت) بمثابة متقدم في الجهاز المناعي، مع وظيفة التحكم في النمو البكتيري والتوسط في6،5،الاستجابة المناعية العامة7. للوفاء بهذه المهام، يتم الاحتفاظ نفاذية الأمعاء بسبب وظيفة مجمعات هالة بين أغشية الخلايا. لهذه الأسباب، تم التحقيق العواقب الضارة المستحث بسبب جرعات مختلفة من الأشعة السينية في الخلايا من كربونات الكالسيوم-2 وحدها وفي الثقافات المشتركة مع ببمك.

على الرغم من إجراء دراسات بشأن الثقافات الخلية هي سيتليني الأولى من التحقيق في البحوث الطبية الحيوية، الافتقار إلى معرفة تفصيلية لآليات القيادة التفاعلات خلية علم الأحياء والمعاملة بالمثل بين أنواع مختلفة من الخلايا قد تصبح حرجة عندما تقترب من دراسة علم وظائف الأعضاء للأجهزة والأنظمة والأجهزة التي لا يمكن إعادة إنشائها بسهولة في المختبر. ولذلك، قررنا أن تعتمد إنشاء ثقافة المشارك، مما يتيح دراسة الخلية الشعبين معا، وتشريح للجوانب المتصلة بالآليات بين الخلايا وخارج الخلية.

الثقافة المشتركة تقنية تستغل عند دراسة المهام الظهارية والتفاعل بين أنواع مختلفة من الخلايا. على وجه الخصوص، استخدام مثل هذا الأسلوب يصبح إلزامياً في حالتنا، لأن ابيثيليا تتكون من خلايا تتميز بالقطبية. وفي حالة الحاجز المعوي، انتيروسيتيس إظهار استقطاب محددة تحديداً جيدا، مع قمي واقطاب basolateral فصل عادة بسبب وجود جزيئات الالتصاق إنشاء تقاطع ضيق. هذا التقسيم المسبق لفسيولوجيا الأنسجة، تجنب باراسيلولار الاتجار بالأشخاص والسماح بمرور جزيئات محددة فقط. هذه الميزة بالطبع من المستحيل إعادة مع خلية عادي استزراع الإعداد. وعلاوة على ذلك، اعتماد إنشاء ثقافة المشارك يستنسخ وجود الخلايا المناعية فقط في السطح باسولاتيرال، بينما السطح قمي (المقابلة التجويف المعوي) ليست مباشرا على اتصال مع خلايا أخرى.

في الآونة الأخيرة، اكتسب كربونات الكالسيوم-2 خطوط الخلايا أكثر أهمية كنموذج في المختبر لجدار الأمعاء. رغم أن المستمدة من غدية القولون البشرية، الاحتفاظ بالقدرة على التمييز بين الخلايا كربونات الكالسيوم-2 وإنشاء أحادي الطبقة مستقطبة وظيفية8، الذي يسمح للتحقيق في خصائص غشاء الخلية عندما تزرع في إدراج ثقافة المشارك.

منذ استزراع 2 كربونات الكالسيوم في غشاء يسهل اختراقها نموذج راسخة في المختبر من أحادي الطبقة المعوية، تم تحسين ثقافة المشاركة بين كربونات الكالسيوم-2 والخلايا الأخرى. قد اعتمد هذا التشكيل غالباً إلى التدبير الحديث المتبادل بين مختلف الخلية أنواع9 ويمكن أن تستخدم لكشف كربونات الكالسيوم-2 قلق الاستجابة للمحفزات الخارجية عند في الثقافة المشتركة، فيما يتعلق بكربونات الكالسيوم-2 مثقف وحدها.

وتناولت العديد من الدراسات كربونات الكالسيوم-2 السلوك عند مثقف يشترك مع كلا من البكتيريا غير ممرضة والطرفية الدم الخلايا وحيدات النوى، وتوضيح وبخاصة الحديث المتبادل مع الجهاز المناعي10. بوزو-روبيو et al. 11 درس التعبير عن عدة السيتوكينات في ثقافة المشارك كربونات الكالسيوم-2/ببمك مع bifidobacteria حفز الخلايا كربونات الكالسيوم-2. وأبرز أعمالها تعديل جوهري لملامح التعبير سيتوكين تبعاً لتحفيز البكتيرية في وجود/عدم وجود ببمك. تؤدي نتائجها إلى الاستنتاج بأن وجود PBMC محسس كربونات الكالسيوم-2 إلى البيفيدوباكتريا.

وقد قسمت استجابات مختلفة من كربونات الكالسيوم-2 الخلايا للبكتيريا غير الممرضة والمسببة للأمراض بفرق بحثية مختلفة. بارليساك وآخرون. 12 أظهرت آثار كربونات الكالسيوم-2 الخلايا المثبطة للمناعة على الإشريكيّة القولونية-حفز ببمك. وعلاوة على ذلك، هالر et al. 13 دراسة استجابة الخلايا كربونات الكالسيوم-2 تحفز مع كلا lipopolysaccharide (لبس) من انتيروباثوجينيك كولاي spp. أو بكتيريا غير انتيروباثوجينيك i.e.E. القولونية spp.، تعزيز ملبنة spp.، حدس أن استجابة الخلايا كربونات الكالسيوم-2 صارما يعتمد على وجود الكريات البيضاء في إنشاء ثقافة المشارك.

عن طريق إجراء فحوصات المختبر مكملة مختلفة (مثل لطخة غربية، والمقاومة الكهربائية عبر الظهارية، MTT، إلخ)، بالإضافة إلى تحليل أنواع الخلايا المختلفة تزرع في ثقافة المشارك، وعود منهجية كاملة النتائج التي يمكن أن تعتبر أكثر تمثيلاً لحقيقة ما يحدث في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا التشكيل الفصل بين المقصورات الثقافة المشتركة المختلفة، مما يتيح دراسة أنواع الخلايا المعنية ليس فقط، بل أيضا الجزيئات بين الخلايا مما يشير إلى الإفراج في المقصورة العليا مقابل انخفاض أو في وجود مقابل غياب ثقافة المشاركة.

Protocol

ويشمل البروتوكول التالي سحب الدم البشري من المتطوعين صحية. وقدمت الجهات المانحة الخطية المستنيرة قبل التسجيل. ويتم هذا الإجراء وفقا "إعلان هلسنكي" وأجريت عمليات سحب الدم مساعد الرعاية الصحية مهنية.

1-الخلية الثقافة وإنشاء ثقافة المشارك

  1. أسبوع واحد قبل التشعيع، إعداد تعليق خلية كربونات الكالسيوم-2 التي تحتوي على5 2.5 × 10 خلايا/مل في جديدة RPMI1640 المتوسطة وتستكمل مع 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين والبنسلين يو/مليلتر 100، 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ومم 2 لتر-الجلوتامين.
  2. البذور 2 مل تعليق خلية في قطر المسام ميكرومتر 1 العقيمة خلية ثقافة إدراج لوحات 6-جيدا ووضع الإدراج في لوحة 6-جيدا.
    ملاحظة: قد يلزم إدراج ثقافة الخلية تفعيلها بالحضانة مع معقمة متوسطة كاملة قبل البذر الخلية. في هذه الحالة، ينبغي تجاهل وسائل الإعلام الثقافة واستبداله بوسائل الإعلام في تعليق خلية.
  3. أضف 3 مل من الطازجة RPMI1640 المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS، مم 2 لتر-الجلوتامين و 100 وحدة دولية/مل البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل في كل حجرة أسفل، وثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مع الغلاف الجوي هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
  4. في نفس اليوم من كربونات الكالسيوم-2 خلية التشعيع، جمع الدم كله البشرية في أنابيب 6 مل المتاحة تجارياً الهيبارين ليثيوم المغلفة (أنبوب حجم: 13 × 100 ملم).
  5. وفي وقت لاحق، عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (PBMC) باستخدام التدرج فيكول. لفصل ببمك، ووضع 25 مل فيكل في أنبوب 50 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي، وطبقة بتساوي حجم الدم كله المخفف 1:1 مع RPMI1640 على سطح فيكل.
    ملاحظة: قد مانحا صحية طبيعية عادة حوالي 4-10 × 106 ببمك/mL.
  6. الطرد المركزي أنابيب 50 مل في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. بلطف جمع ببمك في الواجهة بين فيكل والبلازما بتطلع مع ماصة باستور ووضعها في أنبوب مخروطي 15 مل.
  8. أغسل ببمك مرتين بإضافة 10 مل من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة (PBS) وسينتريفوجينج ببمك في ز 250 x لمدة 10 دقائق.
  9. الثقافة ببمك لمدة أقصاها 3-5 ح في T25 سم2 قوارير في إكمال RPMI1640 وسائل الإعلام، كما هو موضح من قبل، في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
    ملاحظة: جمع ببمك في يوم التجربة والبذور 2 × 106 خلايا/حسنا، علقت في 3 مل متوسطة RPMI1640 كاملة، في حجرة أسفل ثقافة المشارك. يتم نقل إدراج مع كربونات الكالسيوم-2 الخلايا في الآبار التي تحتوي على ببمك 30 دقيقة بعد التشعيع بهم. ببمك التي تم جمعها من الدم كله لا يمكن أن تكون المحافظة في الثقافة لأكثر من حوالي 72 ح، أن لم يكن حفزت مع مثال. phytohaemagglutinin (فا)، بعد ذلك صلاحية الخلايا يتم فقدان.
    تنبيه: ويجب ضمان جودة وسلامة جميع من الدم ومنتجات الدم طوال العملية برمتها.

2-التشعيع الإعداد

ملاحظة: أجرى تشعيع الخلايا كربونات الكالسيوم-2 في قسم العلاج الإشعاعي Istituto دي ريكوفيرو ه Cura ماوجيري س. كاراتيري العلمية (إيرككس) (بافيا، إيطاليا) مع معجل خطي استخدامها بشكل روتيني لعلاج أنواع مختلفة من السرطان.

  1. تعيين فوتون الأشعة السينية الطاقة إلى 6 MV الذروة. معجل خطي يعمل بنظام النبض (الوقت بين هما البقول على التوالي ما يقرب من 4 مللي ثانية؛ ومعدل مدة نبضة واحدة حول المايكروثانيه 5 مع جرعة تصل إلى 1 × 10-3 غراي/p).
  2. ضع 6-جيدا لوحات تتضمن إدراج مع كربونات الكالسيوم-2 على مسار الأشعة السينية على 1.4 سم سميكة زجاجي ورقة (المقابلة لمسافة أكبر قليلاً من تراكم الإشعاع المستخدمة) في 100 سم من مصدر الإشعاع.
  3. مكان بولس 0.5 سم سميكة على كل عينة قبل حدوث التشعيع لضمان عنصر الإشعاع المستطار والتوازن الجسيمات المشحونة.
  4. تشعيع الخلايا (جرعات تتراوح 2-10 غراي) مع شقة ومتماثل (± 2%) حقل الإشعاع2 20 × 20 سم ومعدل جرعة من 3 غراي في الدقيقة.
    ملاحظة: التحكم في "الشام"-الخلايا المشع خضع لنفس الشروط الإجرائية منها المشع، دون أن يدخل الغرفة التشعيع (الجرعة المتلقاة: 0 غراي).
    تنبيه: يجب استخدام الأجهزة المنتجة للإشعاع المؤين إلا عن طريق موظفين متخصصين.

3-خلية صلاحية الفحص (فحص MTT)

ملاحظة: تم تقييم كربونات الكالسيوم-2 النشاط الأيضي في الخلية عن طريق فحص بروميد 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium (MTT)14.

  1. البذور 2 × 105 2 كربونات الكالسيوم في صفيحة 24-بئر ح 24 قبل التشعيع في 1.25 مل من المتوسطة كاملة.
  2. تشعيع الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.4 ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
  3. إضافة 100 ميليلتر من حل MTT 5 ملغ/مل ح 21 بعد التشعيع، وإبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2 لح 3.
  4. تجاهل المادة طافية وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  5. تذوب بلورات فورمازان بإضافة 500 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) في كل بئر وتقييم امتصاص مع قارئ لوحة متعددة جيدا في λ = 570 نانومتر.
  6. كرر الخطوة 3.3-3.4-3.5-3.6 في ح 45 بعد التشعيع.
    ملاحظة: يتم إظهار النتائج كما اضطراب من شرط الشام المقابلة، الذي هو تطبيع إلى 100%.
    تنبيه: [دمس] عامل قابلة للاشتعال وتهيّج الجلد والعينين والجهاز التنفسي (GHS07، GHS08). في حالة ملامسة العينين، يغسل فورا بالمياه الوفيرة والتماس المشورة الطبية. MTT عامل المهيجة للجلد والعينين والجهاز التنفسي (GHS07، GHS08). في حالة ملامسة العينين، شطف فورا مع الكثير من الماء والتماس المشورة الطبية.

4-النسبة المئوية لتحديد خلايا قابلة للحياة (مقايسة الاستبعاد صبغ تريبان الأزرق)

ملاحظة: تم تقييم النسبة المئوية لخلايا قابلة للحياة بمقايسة "تريبان الأزرق صبغ الاستبعاد".

  1. البذور 2 × 105 كربونات الكالسيوم-2 في لوحة 24-بئر ح 24 قبل التشعيع في 1.25 مل من المتوسطة كاملة.
  2. تشعيع الخلايا مع الجرعات في النطاق 0-10 غراي (انظر الخطوات 2.1-2.4) ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2 لح 24-48.
  3. بعد الوقت المختار هما النقاط، تغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، تخلص منه، ثم إضافة 100 ميليلتر من حل حمض (يدتا) التربسين-الإيثيلين. وضع الخلايا في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2 لمدة 2 دقيقة ثم يضاف المتوسطة كاملة للقبض على رد فعل الانزيمية.
  4. جمع الخلايا في أنبوب 1.5 مل والطرد المركزي الأنبوب في ز 500 x لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وتعليق إعادة الخلايا في 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني.
  5. مزيج من تعليق خلية مع 50 ميليلتر من حل صبغ تريبان الأزرق واحتضان هذا الخليط لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. عد الملون (غير قابل للحياة) والخلايا (صالحة) بدائرة Bürker أونستاينيد.

5-عبر الظهارية المقاومة الكهربائية (طير)

  1. البذور 5 × 105 2 كربونات الخلايا الثقافة أسبوع واحد قبل التشعيع في لوحة 6-كذلك شارك إدراجات (البولي ايثلين (PET)، 2 x 106 المسام/سم2).
  2. ح 1 قبل التشعيع، قياس طير مع الفولتميتر/اومتر.
  3. تشعيع الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.4.
  4. احتضان خلايا كربونات الكالسيوم-2 في وجود/عدم وجود ثقافة المشارك مع ببمك في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
  5. لأول بضع ساعات بعد التشعيع، قياس طير كل ساعة، وبعد ذلك كل 3 ساعات تصل إلى 48 ساعة.

6-الغربية لطخة تحليل كلودين-1، أوككلودين، أفادين، وزوى--1، وزوى--2، NF-كيلو بايت، وشياب

  1. إدراج (الحيوانات الأليفة، 2 × 106 المسام/سم2) خلايا البذور 5 × 105 1 أسبوع قبل التعرض للأشعة السينية في ثقافة المشارك لوحة 6-جيدا وتشعيع الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.4.
  2. احتضان خلايا كربونات الكالسيوم-2 في وجود/عدم وجود ثقافة المشارك مع ببمك في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5% CO2.
  3. ح 48 بعد التشعيع، إعداد كربونات الكالسيوم-2 والمخزن المؤقت ببمك خلية ليساتيس بعلاج الخلايا مع تحلل الخلية وتخزين عينات من-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  4. قياس كمية البروتين الكلي بطريقة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  5. خلط مقادير متساوية من مجموع البروتينات مع "لايملي عينة العازلة" أضيف مع β-mercaptoethanol (التركيز النهائي لبيتا-mercaptoethanol هو 5%)، الحرارة في العينات من 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتدور لهم في 10,000 س ز.
  6. تحميل عينات في 4-20 ٪ الجاهزة جل وإجراء التفريد في 120 V حاء 1 نقل البروتينات في غشاء بوليفينيلديني فلوريد (PVDF).
  7. حظر مواقع الربط غير محددة بحضانة الغشاء PVDF في درجة حرارة الغرفة مع 5% غير الدسم الحليب الجاف (نفدم) في برنامج تلفزيوني أضيف مع 0.2% 20 توين (PBT). يغسل الغشاء ثلاث مرات مع 10 مل من 0.2% PBT لمدة 5 دقائق.
  8. احتضان الغشاء مع الانفعالات لطيف ح 1 في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية التالية: مكافحة-كلودين-1 المضادة-زوي-1، مكافحة--زوي-2، مكافحة--أفادين، أوككلودين المضادة، المضادة-NF-ك. بايت، شياب مكافحة واكتين المضادة. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع 10 مل من 0.2% PBT لمدة 5 دقائق.
  9. احتضان الأغشية مع الفجل البيروكسيديز HRP مترافق الأجسام المضادة الثانوية ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع الانفعالات لطيف. يغسل الغشاء ثلاث مرات مع 10 مل من 0.2% PBT لمدة 5 دقائق.
  10. في درجة حرارة الغرفة، وضع الأفلام الفوتوغرافية التي تفرخ الأغشية مع طقم الكيماوي الإنارة المحسنة.
  11. الحصول على أفلام التصوير باستخدام نظام مسح والتحديد الكمي للعصابات التي تم الحصول عليها بصورة مناسبة تحليل البرمجيات.
    ملاحظة: يتم تقييم كلودين-1، أوككلودين، أفادين، وزوى--1، وزوى--2 في الخلايا من كربونات الكالسيوم-2. يتم إجراء تقييم NF-كيلو بايت وشياب في ببمك.
    تنبيه: β-mercaptoethanol السامة (GHS05، GHS06، GHS08، GHS09). لا تتنفس الأبخرة وتجنب إطلاقها في البيئة، وارتداء أجهزة حماية الفرد وحماية الجهاز التنفسي. إذا ابتلع، أطلب فورا للحصول على المشورة الطبية.

7-إحصائية تحليل

  1. لتحديد سواء التعرض للإشعاع وثقافة المشارك الحث اضطراب يعتد به إحصائيا، إجراء اختبار تحليل تباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) مع مقارنات متعددة للقياسات المتكررة (مع بونفيروني المخصص بعد الاختبارات لمقارنة ويعني تكرار).
  2. إذا لا خلاف ذلك، حساب الدلالة الإحصائية (p) باختبار t-التائي. كل قيمة هي متوسط إيه ثري التجارب المستقلة ± الخطأ القياسي لتعنى (SEM).

النتائج

أسبوع واحد قبل التجربة، زرعت على الغشاء المسامية للإدراج الخلايا ويسمح لينمو خلال الأيام التالية. يمكن التحقق من مستوى الالتقاء أما باستخدام مجهر مقلوب أو عن طريق قياس القيم طير. وفي الواقع، أثناء مرحلة النمو، يحتفظ زيادة طير حتى غطى جميع مسامية الغشاء بالخلايا، وأنها تشكل أحادي الطبقة خلية متمايزة. إذا كانت الخلايا تتكاثر أسرع/أبطأ، يمكن أن تبدأ هذه التجربة في نقاط زمنية سابقة/لاحقة بعد يجري المصنف. عند التقاء، من الخلايا، ثم أمام مرفق التشعيع، تقليل الإجهاد البيئي المهلة (درجة الحرارة أو درجة الحموضة)، قبل البدء بثقافة المشارك مع أو بدون ببمك، المصنفة في حجرة أسفل (الشكل 1أ)، أو تقييم انتشار الخلايا كربونات الكالسيوم-2. نظراً لكثافة البذر الأولية، في يوم 0 الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء 100% وخلق أحادي الطبقة متباينة من الخلايا الظهارية، الذي يمكن ملاحظته من الهضبة في طير هو مبين في الشكل 1ب. حالما تصل الخلايا إلى مثل هذه الحالة، يتم الاحتفاظ قيمة طير ثابتة نسبيا على مدى الأسبوع التالي، ما دامت المتوسطة الثقافة القديمة يتم استبداله متوسطة جديدة، على الأقل مرة واحدة في أسبوع (الشكل 1ب). فحص MTT كما هو مبين في الشكل 1ج، لا تظهر أي تغيير يعتد به إحصائيا لحالة كربونات الكالسيوم-2 الخلايا التكاثري في 24 ساعة ولا في ح 48، صرف النظر عن الجرعة التي وردت (ما يصل إلى 10 غراي).

وقد لوحظ نتيجة مختلفة فيما يتعلق بالوفيات القصيرة الأجل من كربونات الكالسيوم-2 الخلايا. عند كل من النقاط الزمنية، تلطيخ تريبان الأزرق تظهر زيادة الجرعة في وفيات الخلية. هذه النتائج تظهر أثرا واضحا من التعرض للإشعاع، على الرغم من أن النسبة المئوية للخلايا الميتة تكون منخفضة جداً، ولا سيما عند النظر في أن يسلم أعلى جرعة (10 غراي) تنتج فقط حوالي 20% موت الخلية (الشكل 1د) على ما يبدو.

وكانت عينات مثقف يشترك مع أو بدون ببمك في حجرة أقل. نظراً لأن ببمك لم يحصل على أي حافز خارجي تتكاثر، اعتبرت تجربة ح 48 مثالية لتجنب التحيز التي أدخلها PBMC بدأت تموت. ولذلك، من مباشرة قبل التشعيع، طير كان بانتظام قياس ح 48، لتعقب آثار عابرة المحتملة الناجمة عن البروتوكول التشعيع. كما هو مبين في الشكل 1 ﻫ-F، تعرض قيم طير إبراز الاختلافات النسبية فيما يتعلق بحالة ما قبل المعالجة (التي كانت تناهز 1200-1500 Ω·cm2) بصورة أفضل اضطراب الناجم عن إشعاع الأشعة السينية و أو بالوجود/عدم وجود ببمك في ثقافة المشارك. في كلتا الحالتين، ذروة عابرة أولية يمكن رؤيتها بوضوح في النقطة الزمنية الأولى بعد التعرض للإشعاع، التي يمكن أن تعزى إلى الإجراء التشعيع.

عند لا في ثقافة المشارك مع ببمك (الشكل 1ﻫ)، طير قيم ثابتة تقريبا تصل إلى 48 ساعة، في حين بعد 10 غراي للأشعة السينية، الخلايا تظهر انخفاضا مطول في طير ابتداء من 3 ح بعد التشعيع. وجود ببمكس تماما تعديل ديناميات طير الزمانية (الشكل 1و). لكل جرعة، تخفيض طير من الواضح يمكن ملاحظته من ح 3 تصل إلى حوالي 30 ح تشعيع بعد، عندما يظهر طير لتستقر عند قيمة ثابتة (الشكل 1و).

مستويات التعبير مجمعات مفرق ضيق وتم التحقيق في كربونات الكالسيوم-2 الخلايا ليساتيس من خلال تحليل لطخة غربية. كربونات الكالسيوم-2 الخلايا المعرضة للإشعاع المؤين (بجرعات من 0, 2, و 10 غراي) وبعد ذلك نمت وحدها أو في ثقافة التعاون مع ببمكس في حجرة أسفل ح 48 (كما هو موضح في الشكل 2A-F). كلودين-1 وأوككلودين (الشكل 2أ، 2) تبين أن لم تتغير إلى حد كبير بالأشعة السينية و/أو الثقافة المشتركة مع ببمك. بدلاً من ذلك لوحظت تقلبات كبيرة في البروتينات سقالة زوي-1 وزوى--2 أفادين (الشكل 2ج، 2D، 2E). على وجه الخصوص، يلاحظ انخفاضا في مستويات التعبير زوي-2 الفعل بعد 2 غراي عندما في ثقافة التعاون مع ببمك فقط في 10 غراي عندما كانت تنمو كربونات الكالسيوم-2 وحدها. بدلاً من ذلك أن مستويات التعبير أفادين تتأثر إلا بعد 10 غراي للأشعة السينية، مع إجراء تخفيض إضافي عندما تكون كربونات الكالسيوم-2 مثقف يشترك مع ببمكس.

حللت ببمكس مثقف يشترك مع كربونات الكالسيوم-2 فيما يتعلق بالدولة التحريضية، وعلى وجه الخصوص، قد حقق kB "النووية عامل النسخ" (NF-kB) ومثبطات X ترتبط مستويات البروتين (شياب) المبرمج (الشكل 2 ز--أنا). لا تتأثر NF-كيلو بايت إجمالي المبلغ ثقافة المشارك مع كربونات الكالسيوم-2 تعرض لجرعات الإشعاع المختلفة (الشكل 2ز). على العكس من ذلك، كانت مستويات إكسياب 4-fold حتى ينظم في غراي 2 و 10 غراي المشارك الثقافات، على الرغم من الاختلافات الكبيرة تتطلب عدد أكبر من العينات التي تم تحليلها للحد من هذه التقلبات واكتساب قوة إحصائية أفضل.

كما هو مبين في الشكل 2و و 2 طاء، قد تظهر بعض الفرق غير محددة بجوار الوزن الجزيئي المتوقعة من بروتين الفائدة. ما لم يكن الفرق الحقيقي وغير محددة يمكن تمييزها بسهولة، ينبغي النظر في جسم مختلفة و/أو تركيزات جيش صرب البوسنة أو نفدم.

figure-results-5349
الشكل 1 . الإعداد التجريبية عموما والعيانية آثار التعرض للإشعاع و/أو الثقافة المشتركة ببمك. A) التخطيطي تصوير من طراز ثقافة المشارك. ب) قياس القيم طير يوميا من بذور الخلايا كربونات الكالسيوم-2 لتقييم حالة نمو وتمايز السليم أحادي الطبقة الأولى. بقاء الخلية ج) ود) معدل الوفيات في كربونات الكالسيوم-2 تتعرض للأشعة السينية (0، 2 و 5، و 10 غراي). المشع القياسات طير ه) في الخلايا من كربونات الكالسيوم-2 مع 0, 2, و 10 غراي للأشعة السينية مثقف دون أو F) مع ببمكس. كل قيمة هي متوسط إيه ثري التجارب المستقلة ± sem. * ف-val < 0.05؛ * * فخامسا ل < 0.01؛ فال ف < 0.001. الرسومات البيانية مقتبس من موريني وآخرون. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-6321
الرقم 2. "لطخة الغربية" نتائج ليساتيس كربونات الكالسيوم-2 وببمك- مستوى التعبير من البروتينات مفرق ضيق (كلودين-1 (أ) وأوككلودين (ب)، ZO-1 (C)، وزوى-2 (د) وأفادين (ه)) في كربونات الكالسيوم-2 بعد 0، 2 و 10 "غراي للأشعة السينية"، وفي وجود/عدم وجود ببمك في ثقافة المشارك. يتم تطبيع القيم على مستوى أكتين. أفلام توضيحية لكل بروتين مفرق ضيق وشروط مبينة في لوحة (و). مستوى التعبير NF-κB (ز) وشياب (ح) في ببمكس مثقف يشترك مع كربونات الكالسيوم-2 الخلايا. يتم عرض أفلام الممثل NF-كيلو بايت وشياب أكتين في الفريق. كل قيمة هي متوسط إيه ثري التجارب المستقلة ± "sem. الرسوم البيانية" مقتبس من موريني وآخرون. 15- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

سرطان القولون والمستقيم، مع حدوث ارتفاع في البلدان المتقدمة النمو، واحد الأسباب الأكثر شيوعاً للإصابة بالأمراض والوفيات بين السكان. يدار عادة بالجراحة والعلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي1. في إطار العلاجات العلاج بالأشعة، ويجب إيلاء اهتمام خاص لآثار التعرض للأنسجة السليمة4؛ وعلاوة على ذلك، دراسات منهجية في العلاقة بين التعرض للإشعاع والجهاز المناعي أساسية بالنسبة لوضع نهج للعلاج المناعي راديو3.

وقد صممت المنهجية التي اعتمدناها في هذا العمل إلى التحقيق من كربونات الكالسيوم-2 الخلايا وببمك الحديث المتبادل. وركزنا على أثر التعرض للأشعة السينية للخلايا السرطانية، ولكن البروتوكول نفسه يمكن تكييفها للدراسات مع وكلاء الدوائية. ويجري توثيق الظروف الفسيولوجية فيما يتعلق باستزراع الخلايا القياسية، قوية وميزة هذا الأسلوب هو إمكانية تشريح كامل لنظام معقد، نظراً لإمكانية تحليل كل من أنواع مختلفة من الخلايا والإفراج عن جزيئات إشارة إلى المقصورات اثنين من ثقافة المشارك نفسه. وبهذه الطريقة، يمكن أن تساعد الأساليب البيولوجية التطبيقية بشكل روتيني فهم الخلوية تفاعل الآليات ذات الصلة.

وصف الآثار الناجمة عن أشعة X على كربونات الكالسيوم-2 الخلايا الأولية تستند إلى قياسات مكملة اثنين، أي اختبار مقايسة اللونية MTT واستبعاد صبغة زرقاء تريبان. ويمكن تفسير النتائج غير متناسقة على ما يبدو بتركيز مختلف من هذه الاختبارات اثنين. MTT يقيم نشاط الإنزيمات أوكسيدوريدوكتاز، بينما تريبان صبغة زرقاء يستند إليه صبغ استبعاد الخلايا الحية.

يتطلب التحقيق في تفاعل كربونات الكالسيوم-2-PBMC إنشاء أحادي الطبقة الظهارية قادرة على أن تؤدي إلى فصل كامل بين المقصورات اثنين من ثقافة المشارك. يتيح إمكانية البذر كربونات الكالسيوم-2 الخلايا في إدراج ثقافة المشارك تشعيع سكان هذه الخلية فقط. حيث يبدأ ثقافة المشارك بعد التشعيع، هناك أي تحيز بسبب أي التعرض العرضي ببمك. هذا التشكيل يحتاج إلى معالجتها بعناية لتجنب الأضرار (أو التلوث) لأحادي الطبقة الخلوية أثناء حركات الإدراج من لوحة 6-بئر واحدة إلى أخرى. عند القيام بعناية، قياسات طير طريقة بسيطة وغير الغازية للتحقيق نفاذية أحادي الطبقة. هذا الفحص الدقيق تتصل بإنشاء ثقافة المشارك، وأنها ليست الخيار الوحيد لتحقيق نفاذية أحادي الطبقة. أنها تسمح إمكانية تكرار نتائج جيدة من تدابير مرة واحدة هي مدروسة جيدا مع المتوسطة كاملة جديدة. فحوصات مشتركة تركز على نشر الأصباغ الكيميائية من المقصورة "قمي" أعلى إلى أسفل "باسولاتيرال" واحد (مثل fluorescein isothiocyanate (فيتك)-مقايسة ديكستران)16. ومع ذلك، منذ ببمك موجودة في حجرة باسولاتيرال في هذه الدراسة، قررنا تجنب إدخال الكواشف الكيميائية في التجارب.

من بين التقنيات المختلفة التي اعتمدتها في هذا العمل، هو قياس طير الوحيد الذي يتطلب17،إنشاء ثقافة المشارك18. ومع ذلك، توفر التقنيات المختبرية الشائعة الأخرى نتائج مفيدة أكثر عند تطبيقها على الخلايا في الثقافة المشتركة، كما أنها تسمح التحقيق في ظروف أقرب إلى الفسيولوجية الإعداد والبيانات لها أهمية بيولوجية أقوى. من ناحية أخرى، تجدر الإشارة إلى أن استخدام الخلايا التي نمت على دعم مسامية يمكن أن يؤدي إلى بعض الصعوبات في العمليات اللازمة لإعداد العينات، مثل تحلل الخلية لإعداد مقتطفات الخلوية التي يتم تحليلها من خلال النشاف الغربية.

النظام المعتمد في هذه الدراسة، يمكن أن تكون زيادة تحسين، مثلاً مع تطبيق المواد قادرة على إعادة الوسط المصفوفة خارج الخلية. بيد أن هذا سيؤدي أيضا زيادة تعقيد النظام، وتشريح كامل لطريقة إعداد سيكون أكثر صعوبة في تحقيقه.

التأكيد على الأجهزة لخلية ثقافة المشارك تمثل أداة قوية للنهوض بالبحوث في المختبر ، وفهم النظم المعقدة. هذا الأسلوب ينطوي على إمكانية زيادة المعارف بشأن الآليات الأساسية، توفير مدخلات جديدة للبحوث الأساسية والدراسات حول الإشارات الجزيئية، ومع التطبيقات الممكنة لتحوير النشاط المناعي في إطار إدارة المريض الأورام السريري.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgements

المعهد الإيطالي "الفيزياء النووية" (إينفن) تمول جزئيا هذا العمل من خلال مشروع إينفن--ميريديان. الكتاب يعترف البروفيسور إدواردو ميلوتي (قسم الفيزياء، جامعة تريستا، إيطاليا) لتنسيق المشاريع ميريديان إينفن؛ الدكتور روبرتو تشيجنولا (إدارة التكنولوجيا الحيوية، جامعة فيرونا، إيطاليا) لتوفير خلايا كربونات الكالسيوم-2، الاومتر، وله قيمة المساعدة والتدريب. كما نعترف بفندق Agnese سولاري للمساعدة التقنية.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates		Greiner Bio-one657610Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well Greiner Bio-one657160Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well Greiner Bio-one662160Plastic
RPMI 1640 without L-GlutamineLonza12-167FReagents
Foetal Bovine SerumLonzaDE14-801Reagents
L-Glutamine 200 mMLonza17-605CReagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10KLonza17-602EReagents
CO2 IncubatorHeal ForceHF240Equipment
Ficoll Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical BottomGreiner Bio-one227261Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical BottomGreiner Bio-one188261Plastic
CentrifugeThermoScientificCL31REquipment
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichP3813Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PSGreiner Bio-one690175Plastic
Clinac 2100 Linear AcceleratorVarianCLINAC 2100C/DEquipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)Sigma-AldrichM5655Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Reagents
Multiwell Plate ReaderGDVDV990BV6Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 % AmrescoK940Reagents
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrichT4049Reagents
1.5 mL tubesEppendorf0030125150Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeterMilliporeMERS 00001Equipment
Cell Lysis Buffer (10x)Cell Signalling Technology#9803Reagents
Bürker HemocytometerSigma-AldrichBR719520Equipment
BCA Protein Quantification KitAbcamab102536Reagents
2x Laemmli Sample Buffer BioRad#1610737Reagents
2-Mercaptoethanol BioRad#1610710Reagents
Accublock Digital Dry BathLabnet International Inc.D1100Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µLBioRad#4568093 Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gelBioRad#1658004Equipment
PowerPac HC High-Current Power SupplyBioRad#1645052 Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting StandardsBioRad#1610385 Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running BufferBioRad#1610732 Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PacksBioRad#1704156Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBioRad#1704150Equipment
Blotting-Grade Blocker BioRad#1706404Reagents
Tween-20Sigma-Aldrich93773Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb Cell Signalling Technology#13255Reagents
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA7906Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb Cell Signalling Technology#8193Reagents
ZO-2 Antibody Cell Signalling Technology#2847Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAbCell Signalling Technology #13531Reagents
Anti-Occludin AntibodyMilliporeABT146Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379]Abcamab32536Reagents
Anti-XIAP antibody Abcamab21278Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)GE Healthcare Life SciencesNA931VReagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)GE Healthcare Life SciencesNA934VReagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mLBioRad#1705060 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisherSigma-AldrichP7042Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisherSigma-AldrichP7167Reagents
Carestream Kodak BioMax light filmSigma-AldrichZ370401Reagents
Gel Doc EZ SystemBioRad#1708270 Equipment

References

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved