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요약

우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

초록

프로토콜 채택에이 작품을 어떻게 엑스레이 교란 장 장벽의 기능 대 장 종양 세포와 면역계 사이의 상호 작용에 초점을 맞추고 탈피 목표로. 대 장 암 암, 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료에 의해 일반적으로 처리의 가장 일반적인 유형 중 하나입니다. 타겟팅 종양에 방사선 치료의 장점은 잘 알려져 있습니다. 그러나, 건강 한 조직의 제한 노출 장의 장벽 및 면역 체계에 미치는 영향에 대해 특히 큰 관심사입니다. 일반 세포 배양에 비해 더 생리 적인 것과 유사한 조건에서 두 셀 인구 사이 상호 작용을 공부 하 채택된 설치 수 있습니다. 이 위해 우리가 다른 기술에 리조트와 우리는 생체 외에서 공동 문화 모델 사용, 단층과 같은 문화 매체를 공유 PBMC 분화 Caco-2 셀에 따라. 이 프로토콜에 염증 통로의 활성화 그리고, 서쪽 오 점, 분자 변경, 즉 거시적인 효과, 즉 세포 생존 능력 및 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)에 초점을 개발 되었습니다. 면역 세포와 Caco-2 셀에 꽉 접합 단백질 표정. Caco-2 세포 생존 능력에 방사선 효과의 초기 평가 동안 TEER는 ohmmeter를 통해 고정된 시간 간격 측정 되었다 Trypan 블루 분석 실험, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT)를 통해 평가 되었다 특히 공동 문화 시스템을 위해 설계 되었습니다. 이 방법에서는, 방사선, 존재의 주변 혈액 단 세포 (PBMC), 그리고 결국 그들의 시너지 효과 인해 효과 설명할 수 있습니다. 이러한 상호 보완적인 기술을 통해 PBMCs 추가 된 때 높은 라디오-저항 Caco-2의 2-10 Gy의 x-레이 및 증가 Caco-2 단층 침투성의 범위 내에서 관찰 합니다. 특히, PBMC 존재 관련 꽉 접합 비 계 단백질 식에서 변형 된 것으로 밝혀졌다.

서문

이 작품에서 채택 하는 방법론은 대 장 암 세포와 면역 체계를 이용 하는 일반 2 차원 세포 배양에 비해 생리 적 조건에 가깝게 설정 간의 상호 작용을 조사 하도록 설계 되었습니다.

대 장 암 (CRC) 세 번째 가장 빈번한 유형의 (글로벌 암 전망대, 암, 세계 보건 기구, http://gco.iarc.fr에 대 한 연구를 위한 국제 기관)의 경우 전세계 1 백만 이상으로 암으로 간주 됩니다. CRC의 관리는 수술, 화학요법 또는 방사선 치료1통해 정기적으로 수행 됩니다. 수술 또는 화학요법 같은 침략 적 기법에 비해, 방사선 치료는 크게 일반적인 해로운 조직의 반응 방사선 복용량의 지역화 된 배달 덕분에 이러한 임상 접근에서 파생 방지 합니다. 그러나, 부작용은 건강 한 세포에 직접적인 피해와 피해 대상 비 효과2,,34중재 염증 트리거링 주변의 건강 한 조직에 발생할 수 있습니다. 대 장 암 치료 중 방사선 조사로 인해 불리 한 효과에 초점을 맞추고, 두 가지 측면 조사 될 필요가 있다. 첫째, 장 불 침투성의 책임 메커니즘 방사선 전달 일으키는, 차례 차례로, 세균성 인구 변경된 포함 및 paracellular 통로 분자와 용액의 부작용의 가능성에 의해 변경 될 수 있습니다. 둘째, 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)의 존재 세균성 성장을 통제 하 고 일반적인 면역 반응5,,67중재의 기능을 가진 면역 시스템의 전초 역할을 합니다. 이러한 기능을 수행 하기 위해 장 불 침투성 세포의 세포 막 사이 접합 단지의 기능 때문에 유지 됩니다. 이러한 이유로, 엑스레이의 다른 복용량 인해 유발된 해로운 결과 혼자 및 공동 문화 PBMC Caco-2 셀에 조사 되었다.

생물 의학 연구에 조사의 첫번째 setline는 세포 배양에 대 한 연구를 실시, 운전 하는 다른 세포 유형 사이 세포 생물학과 상호 상호 작용 하는 메커니즘의 상세한 지식이 부족 될 수 있습니다 중요 한 때 기관, 시스템, 그리고 실험실에서 쉽게 다시 만들 수 없는 기구의 생리학의 학문에 접근. 따라서, 우리 두 셀 인구 함께의 연구와 세포와 extracellular 메커니즘에 관련 된 측면의 해 부를 수 있도록 공동 문화 체제를 채택 하기로.

공동 문화 상피 기능과 다른 세포 유형 사이 상호 작용을 공부 하는 때 악용 하는 기법 이다. 특히, 이러한 기술의 사용 epithelia 셀 특징 극성으로 구성 되어 있기 때문에 우리의 경우, 필수 됩니다. 장 배리어의 경우 enterocytes 표시 꼭대기와 잘 정의 된 분극 하 고 basolateral 극 일반적으로 꽉 교차점을 만드는 접착 분자의 존재로 인해 분리 합니다. 이 구획은 paracellular 인신 매매와 결정된 분자만 통과 허용 피하 조직 생리학에 대 한 필요 합니다. 이 기능은 물론 설정 배양 정상 세포와 함께 재현 가능한 되지 않습니다. 또한, 공동 문화 체제의 채택 꼭대기 표면 (창 자 루멘에 해당)은 다른 세포와 직접 접촉 하는 동안만 basolateral 표면에에서 면역 세포의 존재를 재현 합니다.

최근, Caco-2 셀 라인 장 방 벽의 생체 외에서 모델로 더 많은 중요성을 얻었다. 인간 결 장 선 암에서 파생, Caco-2 세포 분화 능력을 유지 하 고 기능 편광된 단층8, 공동 문화 삽입에서 성장 될 때 세포 막 속성의 조사 수 있는 만듭니다.

Caco-2 다공성 막에 경작 장 단층의 잘 설립 된 생체 외에서 모델 이후 개선 Caco-2와 다른 세포 사이 공동 문화 되었습니다. 이 설치는 빈번 하 게 채택 되었다 측정 다른 사이 누화 종류9 셀 Caco-2를 해명 하는 데 사용 수 불안정 Caco-2 혼자 경작에 관하여 공동 문화에서 외 인 자극에 응답.

많은 연구 Caco-2 해결 동작 때 모두 비 병원 성 박테리아와 공동 경작 하 고 주변 혈액 단 세포, 특히 면역 시스템10와 혼선을 명료 하 게. 포-루비 오 외. 11 공부 Caco-2/PBMC 공동 문화에 여러 가지 cytokines의 표정을 Caco-2 세포를 자극 하는 bifidobacteria. 그들의 작품에 cytokine 식 프로필 PBMC의 존재/부재에서 세균성 자극에 따라 상당한 수정 강조 표시 됩니다. 그들의 결과 PBMC 존재 bifidobacteria에 Caco-2 sensitizes 결론으로 이어질.

비 병원 성 및 병원 성 박테리아 Caco-2 셀의 다른 응답 다른 연구 팀에 의해 평가 되어 있다. Parlesak 외. 12 대장균에 Caco-2 셀의 면역 억제 효과 입증-PBMC를 자극. 또한, 할 러 외. 13 enteropathogenic 대장균 종 또는 비 enteropathogenic 박테리아 i.e.E. 대장균 종, Caco-2 셀 두 lipopolysaccharide (LPS)와 자극된의 응답 공부 균 종, 강화는 Caco-2 세포의 응답 공동 문화 설정에 백혈구의 존재에 엄격 하 게 따라 하는 추측.

다른 상호 보완적인 실험실 분석을 수행 하 여 (예: 서쪽 오 점, 트랜스 상피 전기 저항, MTT, 등), 공동 문화에서 성장 하는 다른 세포 유형의 분석 뿐만 아니라 전체 방법론 약속 더 많은 대표에 비보를 정말 어떻게 간주 될 수 있는 결과. 또한,이 설정 관련된 셀 형식의 연구 뿐만 아니라 위 대 더 낮은 구획에 또는 존재 에서에서 발표 하는 세포 신호 분자를 수 있도록 다른 공동 문화 구획의 분리 수 있습니다. 대 공동 문화의 부재.

프로토콜

다음 프로토콜 건강 한 지원자에서 인간의 피 철수를 포함 한다. 기증자 등록 사전 서 면된 동의 제공합니다. 이 절차는 헬싱키 선언에 따라 그리고 혈액 인출 전문 의료 조 수에 의해 수행 되었다.

1. 세포 문화 및 공동 문화 설정

  1. 1 주일 전에 방사선, 2.5 × 105 셀/mL와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체에 포함 된 Caco-2 셀 서 스 펜 션 준비.
  2. 종자의 살 균 1 µ m 기 공 직경 세포 배양에서 세포 현 탁 액 2 mL 6 잘 플레이트에 대 한 삽입 하 고 삽입 6 잘 플레이트에 넣어.
    참고: 셀 문화 삽입 셀 뿌리기 전에 메 마른 완전 한 매체를 가진 외피에 의해 활성화 해야 합니다. 이 경우에, 문화 미디어 삭제 하 고 셀 서 스 펜 션 미디어로 대체 되어야 한다.
  3. 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 및 각 바닥 구획, 100 µ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체의 3 mL를 추가 하 고 습도 분위기 5% CO2를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화.
  4. Caco-2 셀 방사선의 같은 날, 상용 리튬-헤 파 린 코팅 6 mL 튜브에 인간의 전체 혈액 수집 (튜브 크기: 13 x 100 m m).
  5. 그 후, Ficoll 기울기를 사용 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 격리 합니다. PBMC를 분리, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 및 레이어 전체 혈액의 동일 볼륨 Ficoll 25 mL를 넣어 Ficoll 표면에 RPMI1640와 함께 1:1 희석.
    참고: 정상적인 건강 한 기증자는 일반적으로 약 4-10 × 106 PBMC/mL 있다.
  6. 실 온에서 30 분 400 x g에서 50 mL 튜브 원심
  7. 부드럽게 파스퇴르 피 펫과 포부에 의해 Ficoll와 플라즈마 사이의 인터페이스에서 PBMC를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 넣어.
  8. 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 10 mL를 추가 하 여 10 분 동안 250 x g에서 PBMC centrifuging에서 PBMC를 씻어.
  9. 문화 PBMC T25 h 조 3-5의 최대 c m2 플라스 크에서 완료 하기 전에, 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 설명한 대로 RPMI1640 미디어.
    참고: 실험 당일 PBMC를 수집 하 고 2 × 106 셀/글쎄, 공동 문화의 아래쪽 구획에서 완전 한 RPMI1640 매체의 3 mL에 씨앗. Caco-2 셀 삽입 PBMC 포함 된 웰 스 30 분 그들의 방사선 조사 후 전송 됩니다. PBMC 전체 혈액에서 수집 수 없습니다 수 이상 약 72 h에 대 한 문화에서 유지 아니라면 예를 들어와 자극. phytohaemagglutinin (PHA), 세포의 생존 후 손실 됩니다.
    주의: 모든 혈액과 혈액 제품의 안전과 품질 전체 과정을 통해 보장 되어야 한다.

2. 방사선 설정

참고: Caco-2 세포의 방사선은 정기적으로 다양 한 유형의 암 치료에 사용 되는 선형 가속기 Istituto 디 Ricovero e Cura Carattere Scientifico (IRCCS) 미 됩니다 (파 비아, 이탈리아)의 방사선 치료 부서에서 수행 되었다.

  1. 6 MV 피크를 광자 엑스레이 에너지를 설정 합니다. 선형 가속기 pulsing 정권에서 작동 한다 (대략 4 ms의 2 연속 펄스 사이의 시간; 5 µs 복용량에 대 한 단일 펄스의 지속 시간 최대 1 × 10-3 Gy/p 비율).
  2. Caco-2 장에 1.4 cm 두께 유리 야 (사용 된 방사선의 보다 약간 더 큰 거리에 해당) 방사선의 소스에서 100 cm에서 엑스레이의 궤도에 삽입을 포함 하는 6-잘 접시를 놓습니다.
  3. 방사선 backscattered 방사선 구성 요소 및 입자 평형 발생 하기 전에 각 샘플에 0.5 cm 두께 bolus를 놓습니다.
  4. 셀을 비추는 (2-10 Gy 사이의 복용량) 아파트와 대칭 (± 2%) 20 x 20 cm2 방사선 분야 그리고 분당 3 Gy의 복용량 비율.
    참고: "가짜" 제어-비친된 셀 받았다 방사선 룸을 입력 하지 않고 비친된 그들의 동일한 절차 조건 (받은 복용량: 0 Gy).
    주의: 이온화 방사선 생산 장치 전문된 인력에 의해서만 사용 되어야 한다.

3. 세포 생존 능력 분석 실험 (MTT 분석 결과)

참고: Caco-2 세포 대사 활동143-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 통해 평가 했다.

  1. 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.
  2. 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는 다음 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
  3. 방사선 조사, 후 21 h 5 mg/mL MTT 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 포함 된 5% CO2 3 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 셀을 계속.
  4. 삭제는 상쾌한 고 1 mL의 PBS로 세포를 씻어.
  5. 각 잘에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 500 µ L을 추가 하 여 formazan 결정을 녹이 고 λ에서 다 잘 플레이트 리더 흡 광도 평가 = 570 nm.
  6. 방사선 조사 후 단계 3.3-3.4-3.5-3.6에서 45 h를 반복 합니다.
    참고: 결과 100%로 표준화 해당 가짜 상태에서 섭 동으로 표시 됩니다.
    주의: DMSO는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 가연성 및 자극 에이전트입니다. 눈 접촉, 풍부한 물으로 즉시 세척 하 고 의료 조언을 추구 합니다. MTT는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 자극 에이전트. 눈 접촉, 물로 하 고 의료 조언을 추구 합니다.

4. 가능한 셀 결정 (Trypan Blue 염료 배제 분석 결과)의 비율

참고: 실행 가능한 세포의 백분율 Trypan Blue 염료 배제 분석 결과 의해 평가 되었다.

  1. 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.
  2. 셀 범위 0에에서 복용량을 비추는-10 Gy (2.1-2.4 단계 참조) 다음 24-48 h에 대 한 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
  3. 2 선택한 시간 포인트, PBS로 세포 세척, 후, 삭제 다음 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 넣어 다음 완전 한 매체 효소 반응 체포를 추가 합니다.
  4. 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 원심 5 분 삭제에 대 한 500 x g에 튜브는 상쾌한 다시 PBS의 50 µ L에서 세포를 일시 중지.
  5. Trypan Blue 염료 솔루션의 50 µ L로 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 3 분을 위한 혼합물을 품 어.
  6. 스테인드 계산 (비 가능한) 및 (가능한) 셀 Bürker 챔버와 흠 없는.

5. 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)

  1. 씨앗 5 × 105 Caco-2 셀 6 잘 플레이트에 조사 이전 1 주일 공동 삽입 (폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물), 2 x 106 모/cm2) 문화.
  2. 1 시간 전에 방사선, 전압계/ohmmeter와 TEER를 측정 합니다.
  3. 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.
  4. Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.
  5. 처음 몇 시간 후 방사선에 대 한 측정 TEER 매 시간, 그리고 이후에 모든 3 h 48 h까지.

6. 서쪽 오 점 분석 Claudin-1, Occludin, Afadin, 조 1, ZO-2, NF-kB, 및 XIAP

  1. 씨앗 5 × 105 셀 6 잘 플레이트 공동 문화에 엑스레이 노출 하기 전에 1 주 (애완 동물, 2 x 106 모/cm2)를 삽입 하 고 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.
  2. Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.
  3. Caco-2를 준비 하는 방사선 조사, 후 48 h 및 PBMC 세포 lysates 셀 세포와 세포를 치료 하 여 버퍼-20 ° c.에 샘플 저장
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  4. Bicinchoninic 산 (BCA) 메서드에서 총 단백질 양을 계량.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
  5. Laemli 샘플 버퍼 β-mercaptoethanol 추가 총 단백질의 동등한 양으로 혼합 (β-mercaptoethanol의 최종 농도 5%), 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열 고 10000 x g에서 그들을 회전.
  6. 부하 샘플 4-20%에서 젤 캐스트 및 polyvinildiene 불 소 (PVDF) 막에 1 h. 전송 단백질에 대 한 120 V에서 전기 영동을 수행.
  7. 잠복기 5% 비 지방 건조 우유 (NFDM) 0.2% 추가 PBS에 실 온에서 PVDF 막 여 비 특정 바인딩 사이트 차단 트윈-20 (PBT). 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
  8. 다음 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 배치 되 고 전에 실 온에서 1 h에 대 한 부드러운 동요와 막 품 어: 안티-claudin-1, 안티-ZO-1, 안티-ZO-2, 안티-afadin, 안티 occludin, 안티-NF-kB, 안티-XIAP와 안티 말라. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
  9. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용으로 막 품 어. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
  10. 실내 온도에, 향상 된 화학 발광 키트와 함께 막을 배양 하 여 사진 필름을 개발 합니다.
  11. 사진 필름 스캐닝 시스템으로 취득 하 고 적당 한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 얻은 밴드 계량.
    참고: Claudin 1, Occludin, Afadin, ZO-1, 그리고 조 2의 평가 Caco-2 셀에서 수행 됩니다. NF-kB와 XIAP의 평가 PBMC에서 수행 됩니다.
    주의: β-mercaptoethanol은 독성 (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). 하지 증기를 호흡, 환경에 릴리스를 방지 하 고 개인 보호 장치 및 호흡기 보호를 착용. 삼 키는 경우 즉시 의료 조언을 부탁 드립니다.

7. 통계 분석

  1. 방사선 노출 및 공동 문화는 통계적으로 중요 한 섭 동 유발 여부를 확인 하려면 테스트를 수행 양방향 분산 분석 (ANOVA) 여러 비교 반복 측정 (비교 Bonferroni 게시물 임시 테스트와 함께 복제) 의미합니다.
  2. 명시 하지 않으면, 양측 스튜던트 t-검정에 의해 통계적 유의 성 (p)를 계산 합니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± 표준 오차의 의미 (SEM)의 평균입니다.

결과

실험 전에 1 주 셀 삽입의 다공성 막에 뿌 렸 고 있으며 다음과 같은 일 동안 성장할 수 있습니다. 합류의 레벨도는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 확인할 수 있습니다 또는 TEER 값의 측정을 통해. 실제로, 성장 단계 TEER 모든 다공성 막 세포에 의해 덮여 있다 그리고 그들은 차별화 된 셀 단층을 형성 될 때까지 늘리면 유지 합니다. 세포 증식 빠른/느린, 실험 후 시드 되 고 이전/나중 지점에서 시작할 수 있습니다. 때에 합류, 세포는 다음 가져 방사선 조사 시설, imparted 환경 스트레스 (온도, pH)와 함께/없이 아래 칸 (그림 1A)에 시드 PBMC 공동 문화를 시작 하기 전에 최소화 또는 Caco-2 세포의 확산을 평가. 초기 시드 밀도 주어진 하루에 0 셀 한다 도달 100% 합류 하 고 고원 TEER 그림 1B에 의해 관찰 될 수 있는 상피 세포의 차별화 된 단층을 만듭니다. 셀 같은 상태에 도달, TEER 값으로 오래 된 문화 매체는 대체 신선한 매체와 적어도 일주일에 한 번 (그림 1B) 상대적으로 다음 주 일정 유지 됩니다. 그림 1C같이 24 시간에도 접수 (최대 10 Gy) 복용량 별도로 48 h에 MTT 분석 결과 어떤 통계적 Caco-2 세포의 증식 상태 변경을 표시 되지 않습니다.

다른 결과 Caco-2 셀의 단기 사망률에 관한 관찰 되었다. 두 시간 지점에서 셀 사망률에는 복용량-의존 증가 표시 Trypan 푸른 얼룩. 이 결과 죽은 세포의 백분율 높은 배달된 복용량 (10 Gy) 생산 세포 죽음 (그림 1D)의 20% 대략만 고려 하는 경우에 특히 매우 낮은 것으로 나타날 있지만 방사선 노출의 명확한 효과 보여 줍니다.

샘플 또는 더 낮은 구획에서 PBMC 없이 공동 경작 했다. PBMC에 어떤 외부 자극에는 영향을 받지 못한 사실을 감안할 때, 48 h 실험 PBMC 죽을 시작으로 도입 하는 바이어스를 피하기 위해 이상적인 여겨졌다. 따라서,에서 방사선, 직전 TEER 정기적으로 측정 했다 48 h에 대 한 조사 프로토콜에 의해 발생 가능한 일시적인 효과를 추적. 그림 1 E F같이 TEER 값 제시는 더 나은 (1200-1500 Ω·cm2순서의 있던) 미리 치료 조건에 관하여 상대 변형을 강조 x 선 방사선에 의해 유도 된 섭 동 및 존재/부재 PBMC의 공동 문화에 의해 또는. 두 경우 모두에서 초기 과도 피크 볼 수 있습니다 명확 하 게 첫 번째 시간이 시점에서 방사선 노출, 방사선 프로시저에 표시 될 수 있습니다.

하지에서 PBMC (그림 1E)와 함께 공동 문화, TEER 값은 48 h 동안,까지 거의 일정 한 엑스레이의 10 Gy 후, 셀 표시 TEER 장기간된 감소 3 h 방사선 조사 후에 시작. PBMCs의 존재는 완전히 TEER 임시 역학 (그림 1F)를 수정합니다. 모든 복용에 대 한 감소는 TEER 때 명확 하 게 약 30 h 방사선 조사 후, 최대 3 h에서 관찰 TEER 정착 상수 값 (그림 1F)에 나타납니다.

단단한 접속점 단지 식 수준 서쪽 오 점 분석 결과 통해 Caco-2 세포 lysates에서 조사 되었다. Caco-2 셀 (0, 2, 및 10 Gy의 복용량)과 이온화 방사선에 노출 되었고 이후에 성장 혼자 또는 공동 문화 48 h에 대 한 맨 아래 칸에 PBMCs ( 그림 2A-F에서 같이). Claudin-1와 Occludin (그림 22B) x 선 및/또는 공동 문화 PBMC 크게 변경 하지 것을 발견 했다. 큰 변동이 대신 ZO-1 조 2, Afadin (그림 2C, 2D, 2E) 비 계 단백질에서 관찰 되었다. 특히, ZO-2 식 수준에 있는 감소는 Caco-2 혼자 성장 하는 때 동안 10 Gy에서 PBMC와 공동 문화에 때 2 Gy 후 이미 관찰 됩니다. Afadin 식 수준 대신 영향을 받습니다 10 Gy 엑스레이의 직후 Caco-2는 PBMCs와 공동 경작 하는 때 추가 감소.

PBMCs 공동 Caco-2 교양 염증 상태에 관한 분석 했다, 특히 핵 전사 인자 kB (NF-kB)와 apoptosis 단백질 (XIAP) 레벨의 X 연결 된 억제 물 조사 되었습니다 (그림 2 G-난). NF-kB 총 금액은 영향을 받지는 공동 문화 Caco-2 다른 방사선 복용량 (그림 2G)에 노출. 그와 반대로, XIAP 레벨 4-fold 최대 2 Gy에 10 Gy 공동 문화, 규제 하지만 했다 큰 변화가 요구 같은 변동을 얻을 더 나은 통계적 인 힘 분석 샘플의 더 높은 번호.

같이 그림 2F 와 2I, 일부 일반적인 악대는 관심사의 단백질의 예상된 분자량 옆 나타날 수 있습니다. 사실과 일반적인 밴드 쉽게 구별할 수 있습니다, 하지 않는 한 다른 항 체 또는 BSA 또는 NFDM 농도 고려 되어야 한다.

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그림 1 . 전반적으로 실험적인 체제 및 방사선 노출 PBMC 공동 문화의 거시적인 효과. 공동 문화 모델의 A) 회로도 묘사. B) TEER 값은 단층의 적절 한 성장과 분화 상태를 평가 하기 위해 Caco-2 셀의 초기 씨앗에서 매일 측정. C) 세포 생존 능력 및 D) Caco-2 엑스레이 (0, 2, 5, 및 10 Gy)에 노출에 사망. Gy의 엑스레이 없이 교양 또는 F E) TEER 측정 Caco-2 셀에 0, 2, 및 10 반구) PBMCs와 함께. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM.의 평균 * p 발 < 0.05; * * p-버지니아 l < 0.01; p-발 < 0.001입니다. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응입니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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그림 2. 서쪽 오 점 결과 Caco-2와 PBMC lysates의. 꽉 접합 단백질 (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D), 및 Afadin (E)) 0, 2, 및 10 Gy의 엑스레이 후 Caco-2 및 공동 문화에서 PBMC의 존재/부재의 식 수준입니다. 값은 말라 수준에서 정규화 됩니다. 각 단단한 연결 단백질 및 조건에 대 한 설명을 영화 패널 (F)에 표시 됩니다. NF-κB (G) 및 XIAP (H) PBMCs 공동 Caco-2 세포와 배양의 식 수준입니다. NF-kB, XIAP, 그리고 걸에 대 한 대표적인 영화 패널에 표시 됩니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응의 의미입니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

선진국에서 그것의 높은 발생으로 대 장 암 사망률 및 인구에서 사망률의 가장 빈번한 원인 중 하나입니다. 그것은 일반적으로 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료1에 의해 관리 됩니다. 방사선 치료의 프레임 워크에서 특정 주의 건강 한 조직을 노출4;의 효과를 부여 해야 합니다. 또한, 방사선 노출 및 면역 체계의 관계에 대 한 체계적인 연구는 라디오 immunotherapy3의 접근을 개발 하기 위한 기본.

우리는이 작품에서 채택 하는 방법론 Caco-2 셀 및 PBMC 크로스 토크의 조사를 맞게 되었습니다. 우리는 종양 세포의 엑스레이 노출의 효과에 집중 하지만 동일한 프로토콜 약리 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 표준 세포 배양 관련 생리 적 조건에 가까이 되 고, 강한이 방법의 장점은 다른 세포 유형 및 자료의 분석의 가능성을 주어진 복잡 한 시스템의 완전 한 해 부의 가능성 공동 문화 자체의 두 구획으로 신호 분자. 이 방법에서는, 정기적으로 적용 된 생물 학적 방법 상호 관련된 메커니즘 휴대의 이해를 도울 수 있다.

Caco-2 셀에 X 레이 유도 효과의 초기 특성 두 보완 측정에 근거 했다, 즉 MTT 색도계 분석 결과 고 Trypan blue 염료 제외 테스트. 이러한 두 가지 분석 실험의 다른 초점에 의해 분명히 일관성 없는 결과 설명할 수 있었다. MTT은 Trypan 파랑 염료 생활 셀 제외 염료 메커니즘에 기반 하면서 oxidoreductase 효소 활동을 평가 합니다.

Caco-2-PBMC 상호 작용의 조사 공동 문화의 2 개의 구획 사이 완전 한 별거에 지도할 수 있는 상피 단층의 생성을 필요 합니다. Caco-2 셀 공동 문화 삽입에 뿌리기의 가능성이 셀 인구 조사 수 있습니다. 공동 문화 조사 후 시작, 이후 PBMC의 어떤 실수로 노출으로 인해 아무 편견이 있다. 이 설정 해야 손상 (또는 오염)을 피하기 위해 신중 하 게 처리 되어야 세포 단층 삽입의 움직임 동안 다른 한 6 잘 플레이트에서 합니다. 신중 하 게 수행 하는 경우 TEER 측정 조사 단층 침투성을 간단 하 고 비-침략 적 방법입니다. 이 분석 결과 엄격 하 게 공동 문화 설정에 관련 된 그리고 단층 침투성의 조사에 대 한 유일한 선택이 아니다. 그것은 잘 신선한 완전 한 매체와 보정은 일단 좋은 재현성을 측정의 수 있습니다. 일반적인 분석 아래 "basolateral" 하나에 위 "꼭대기" 구획에서 화학 염료의 확산에 초점 (예: fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran 분석 결과)16. 그러나, PBMC이이 연구에서 basolateral 구획에 있기 때문에, 우리는 실험에서 화학 시 약의 소개를 방지 하기로.

이 작품에서 채택 하는 다른 기법 중 TEER 측정은 유일 하 게 공동 문화 설정17,18필요 합니다. 그러나, 다른 일반적인 실험실 기술은 설치 생리에 가까운 조건의 조사 수 데이터 강한 생물 학적 중요성으로 셀 공동 문화에 적용 될 때 더 유익한 결과 제공 합니다. 다른 한편으로, 그것은 다공성 지원에 성장 하는 세포를 사용 하 여 서 부 럽 통해 분석할 세포 추출의 준비를 위한 세포 세포의 용 해 등 샘플을 준비 하는 데 필요한 작업에 몇 가지 문제가 발생할 수 언급 해야 합니다.

이 연구에서 채택 하는 시스템 개선, 예를 들면 기질 환경 재현 수 물질의 응용 프로그램으로 추가 될 가능성이 있다. 그러나,이 또한 시스템의 증가 복잡성 귀 착될 것 이다 고 설정의 완전 한 해 부 달성 될 더 어려울 것 이다.

셀 공동 문화에 대 한 설정을 확실히 복잡 한 시스템의 이해에 대 한 생체 외에서 연구의 발전을 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 이 기술은 분자 신호에 그리고 가능한 응용 프로그램의 프레임 워크에서 면역 체계의 활동의 변조에 기초 연구 연구에 새로운 입력을 제공 하는 기본 메커니즘에 대 한 지식을 증가 하는 종양학 임상 환자 관리입니다.

공개

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

감사의 말

이탈리아 연구소 핵 물리학 (INFN)에 대 한 부분적으로 INFN 자오선 프로젝트를 통해이 작품을 자금. 저자는 INFN 자오선 프로젝트 조정;에 대 한 교수 Edoardo Milotti (물리학과, 대학교의 트리 에스테, 이탈리아)를 인정 닥터 Roberto Chignola (생명 공학 부, 대학교의 베로나, 이탈리아) Caco-2 셀, ohmmeter, 제공 하 고 그의 귀중 한 도움과 훈련에 대 한. 우리는 또한 기술 지원에 대 한 Agnese Solari 인정합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates		Greiner Bio-one657610Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well Greiner Bio-one657160Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well Greiner Bio-one662160Plastic
RPMI 1640 without L-GlutamineLonza12-167FReagents
Foetal Bovine SerumLonzaDE14-801Reagents
L-Glutamine 200 mMLonza17-605CReagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10KLonza17-602EReagents
CO2 IncubatorHeal ForceHF240Equipment
Ficoll Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical BottomGreiner Bio-one227261Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical BottomGreiner Bio-one188261Plastic
CentrifugeThermoScientificCL31REquipment
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichP3813Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PSGreiner Bio-one690175Plastic
Clinac 2100 Linear AcceleratorVarianCLINAC 2100C/DEquipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)Sigma-AldrichM5655Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418Reagents
Multiwell Plate ReaderGDVDV990BV6Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 % AmrescoK940Reagents
Trypsin-EDTA SolutionSigma-AldrichT4049Reagents
1.5 mL tubesEppendorf0030125150Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeterMilliporeMERS 00001Equipment
Cell Lysis Buffer (10x)Cell Signalling Technology#9803Reagents
Bürker HemocytometerSigma-AldrichBR719520Equipment
BCA Protein Quantification KitAbcamab102536Reagents
2x Laemmli Sample Buffer BioRad#1610737Reagents
2-Mercaptoethanol BioRad#1610710Reagents
Accublock Digital Dry BathLabnet International Inc.D1100Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µLBioRad#4568093 Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gelBioRad#1658004Equipment
PowerPac HC High-Current Power SupplyBioRad#1645052 Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting StandardsBioRad#1610385 Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running BufferBioRad#1610732 Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer PacksBioRad#1704156Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer SystemBioRad#1704150Equipment
Blotting-Grade Blocker BioRad#1706404Reagents
Tween-20Sigma-Aldrich93773Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb Cell Signalling Technology#13255Reagents
Bovine Serum AlbumineSigma-AldrichA7906Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb Cell Signalling Technology#8193Reagents
ZO-2 Antibody Cell Signalling Technology#2847Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAbCell Signalling Technology #13531Reagents
Anti-Occludin AntibodyMilliporeABT146Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379]Abcamab32536Reagents
Anti-XIAP antibody Abcamab21278Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)GE Healthcare Life SciencesNA931VReagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)GE Healthcare Life SciencesNA934VReagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mLBioRad#1705060 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisherSigma-AldrichP7042Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisherSigma-AldrichP7167Reagents
Carestream Kodak BioMax light filmSigma-AldrichZ370401Reagents
Gel Doc EZ SystemBioRad#1708270 Equipment

참고문헌

  1. Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
  2. Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
  3. Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
  4. Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
  5. Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
  6. Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
  7. Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
  8. Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
  9. Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
  10. Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
  11. Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
  12. Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
  13. Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
  14. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  15. Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, 1-12 (2017).
  16. Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
  17. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  18. Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).

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