إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية باستخدام نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين

Summary

وكثيراً ما يتم تغيير آليات جينية في الدبقي. ويمكن استخدام إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين لدراسة النتائج المترتبة على التعديلات الوراثية في الدبقي التي تنتج عن التغييرات في هيستون التعديلات التي تنظم النسخ الكروماتين هيكل والجينات. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ مورين.

Abstract

يمكن إشراك تعديلات جينية في التنمية والتقدم من الدبقي. التغييرات في مثلايشن وأسيتيليشن مروجين والمناطق التنظيمية المسرطنة والمكثفات الورم يمكن أن تؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني وتلعب دوراً هاما في الآلية المرضية لاورام الدماغ. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية (رقاقة) هو تقنية شعبية يتيح الكشف عن التعديلات أو غيرها من البروتينات أحكام ملزمة للحمض النووي. على النقيض من رقاقة cross-linked، في رقاقة الأصلي، لا تعامل الخلايا مع فورمالدهايد تساهمي ربط البروتين بالحمض النووي. وهذا مفيد لأنه في بعض الأحيان قد إصلاح crosslinking البروتينات التي تتفاعل مع الحمض النووي فقط عابر وليس لها أهمية وظيفية في تنظيم الجينات. وبالإضافة إلى ذلك، يتم رفع الأجسام المضادة عموما ضد الببتيدات غير المثبتة. لذلك، يتم زيادة خصوصية جسم في الشريحة الأصلية. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن رقاقة الأصلي لا ينطبق إلا على دراسة هيستونيس أو غيرها من البروتينات التي تربط محكم للحمض النووي. ويصف هذا البروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين الأصلية في نيوروسفيريس ورم الدماغ موريني.

Introduction

أحداث جينية متكررة في جليوماس، والمرجح أن تلعب دوراً مهما في نشوء المرض ورم. وفي الواقع، في طب الأطفال الدبقي عالية الجودة، الطفرات في الجينات ترميز المتغيرات هيستون H3.3 و H3.1 تحدث بشكل متكرر¹. الطفرات تؤثر التعديلات هيستون وعواقب جينية رئيسية^2،3. تحدث الطفرات المتكررة في إيسوسيتراتي نازعة الجينات 1/2 (IDH1/2)، طفرة التي تمنع هيستون تعتمد α-كجم والحمض النووي دي-ميثيلاسايس، والتعديلات الوراثية في المنظمين الكروماتين الأخرى مثل أتركس و DAXX في المراهقين إلى الطيف الكبار، ⁴. ولذلك، من الأهمية لدراسة كيفية تغيير الطفرات التي تؤثر على المنظمين جينية هيكل الكروماتين والتعديلات التنظيمية هستون، الذي، بدوره، أثرا محسوسا الترنسكربيتوم ورم الخلايا.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) أداة قوية تستخدم لتقييم أثر إدخال تعديلات جينية في الجينوم^5،،من⁶⁷. في رقاقة الأصلي، الكروماتين يهضم مع نوكلياسي ميكروكوككال (مناسى)، إيمونوبريسيبيتاتيد استخدام جسم مضاد المثارة ضد بروتين الفائدة، وثم هو تنقية الحمض النووي من مجمع الكروماتين إيمونوبريسيبيتاتيد⁶. خلايا غير ثابتة أثناء الإجراء حتى هذه التقنية قابلة للتطبيق لدراسة البروتينات التي تتفاعل محكم مع الحمض النووي⁶فقط. نظراً لغياب العابرة للربط الإيدز خصوصية جسم حيث عادة ما يتم رفع الأجسام المضادة ضد الببتيدات أو البروتينات غير المثبتة⁷. وبالإضافة إلى ذلك، أنه ليس هناك أي خطوة كروسلينكينج، وهذا يقلل من فرص تحديد التفاعلات عابر البروتين-الحمض النووي التي هي غير محددة ولا التنظيمية^7،8. يمكن استخدام شرائح التعرف على إثراء التعديلات هستون في منطقة محددة بالجينوم. هنا، نحن بالتفصيل على بروتوكول لأداء رقاقة الأصلي في نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من وراثيا تصميم نماذج الماوس من الدبقي.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميتشيغان.

1-جيل من ورم الدماغ NS واستزراع الظروف.

1. إعداد متوسط الخلايا الجذعية العصبية (مجلس الأمن القومي) مع دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة/F12B27 الملحق (س 1)، N2 الملحق (س 1)، وكاشف مضادات الميكروبات. الملحق المتوسطة مجلس الأمن القومي اليوم للاستخدام مع الإنسان المؤتلف غشائي عامل النمو (مماثلة)، وعامل النمو الأساسية-تنتجها الخلايا الليفية (الأجيال) بتركيز نهائي من 20 نانوغرام/مليلتر كل.
2. حمل ورم الدماغ في الماوس استخدام نظام ينقول النائمة التي يتم حقن البلازميدات ترميز المسرطنة أو شرنا استهداف الورم المكثفات في البطينين الأفقي للمواليد الجدد لتوليد أورام الدماغ عفوية⁹. حدد ماوس مع وجود ورم كبير، الذي يتأكد بتصوير الإضاءة الحيوية.
   ملاحظة: يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلاً حول بنيات "النظام ينقول الجمال النوم" وبلازميد المستخدمة في كالينيسكو et al. ⁹.
   1. الصورة في الفئران، حقن 100 ميليلتر من 30 ملغ/مل لوسيفرين حل إينترابيريتونيلي باستخدام إبرة قياس 26.
   2. 5 دقيقة بعد حقن لوسيفرين، تخدير الحيوان استخدام تشكيل غرفة تخدير مع تدفق الأوكسجين/isoflurane تعيين إلى إيسوفلوراني 2%.
   3. عندما يتم تخديره من الحيوانات (عادة ما تكون من 2-3 دقيقة)، ضع الحيوانات في دائرة الإضاءة الحيوية مع الأكسجين إيسوفلوراني تعيين إلى إيسوفلوراني 2%. إذا كانت الحيوانات تحت التخدير لمدة تزيد على 5 دقائق، استخدم مرهم العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
   4. صورة الفئران باستخدام في فيفو بصري تصوير النظام مع المعلمات التالية: التعرض التلقائي، binning الكبيرة، والفتحة f = 1. المعلمة للنظر ورم كبير هو الإضاءة الحيوية > خ الفوتونات/s/سم²⁶ 10.
3. Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من استنشاق isoflurane مخدر في دائرة مغلقة، تحقق برشة تو أنه تم تخديره من الحيوان، وقطع رأس الماوس.
4. استخراج الدماغ وتشريح كما هو موضح سابقا في كالينيسكو et al. ⁹.
5. وضع الدماغ في 10 سم طبق بيتري. استخدام الفلورية تشريح مجهر تعيين القناة الفلورسنت مناسب و 0.3 X التكبير، إذا كان الورم الناجم عن تعرب عن بروتين فلوري، خلاف ذلك تحديد كتلة الورم بالاختلافات في أنسجة اللون والملمس. استخدام المبضع، والملقط لفصل أنسجة الورم من الدماغ العادي.
6. فرم الورم إلى قطع صغيرة في طبق بتري. مكان الورم تشريح في أنبوب 1.5 مل مع 300 ميليلتر من المتوسط القومي.
7. استخدام مدقة بيليه بلاستيك القابل للتصرف الذي يناسب على جدران أنبوب ميكروسينتريفوجي المخروطية مجانسة الورم بلطف. أضف 1 مل من الخلية المفرزة المتوسطة واحتضان العينة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: استخدام مدقة قد قتل بعض الخلايا. إذا أراد القارئ إلى أقصى حد ممكن بقاء الخلية، قد أغفل استخدام مدقة.
8. تمرير تعليق خلية من الخطوة 1، 7 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وغسل المصفاة مع 25 مل متوسط القومي.
9. الطرد المركزي من التعليق على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه إلى 6 مل متوسط القومي.
10. لوحة تعليق خلية ورم من الخطوة 1، 9 إلى قارورة ثقافة T-25 والثقافة أنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع جو من 95% الهواء و 5% CO₂. عادة بعد 3 أيام، سيكون هناك خليط من بعض الخلايا الميتة والخلايا التقيد بها وبعض الخلايا تشكيل NS التي تطفو في الأجل المتوسط.
11. نقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل وجمع الخلايا التي تنزل إلى أسفل باستخدام ميكروبيبيتي فقط وإعادة لوحة لهم على قارورة زراعة الأنسجة T-75.
12. الحفاظ على الخلايا في كثافة عالية نسبيا (1-3 × 10⁶ خلايا في T-25). مرور الخلايا عندما يكونون المتلاقية.
    ملاحظة: يتم تحديد كونفلوينسي بحجم مجالات. مراكز سوداء من مجالات كبيرة يعني أن هناك خلايا ميتة في المركز وتشير إلى أنه ينبغي أن يكون باساجيد الخلايا فورا.
13. إضافة عوامل النمو (basic-صندوق الأجيال القادمة؛ ولو 20 نانوغرام/مليلتر كل) كل ثلاثة أيام. تغيير المتوسط عندما تكون الخلايا غير روافد وبرتقالي فاتح يتحول المتوسط.
14. لتغيير في المتوسط، جمع المتوسطة القديمة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق وإعادة تعليق بيليه خلية في مجلس الأمن القومي المتوسطة وتستكمل مع مماثلة وصندوق الأجيال القادمة على التركيز المحدد في الخطوة 1، 1.
    ملاحظة: إذا كانت المجالات في منتصف-كونفلوينسي عالية، ولكن ليس على استعداد أن تكون باساجيد (حجم المجال صغير مع قطر < 100 ميكرومتر)، ثم يمكن تقسيم بيليه إلى قوارير اثنين.
15. لمرور الخلايا، الطرد المركزي الخلايا في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وصب المادة طافية واحتضان الخلايا في خلية مفرزة متوسطة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    1. إضافة 5 مل من محلول ملح متوازن لمفرزة تمييع المتوسطة والطرد المركزي أنه في 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. صب المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 18 مل متوسط القومي وتقسيم التعليق على قدم المساواة إلى ثلاثة T-25 قوارير.
16. لتجميد مختبرين للخلايا، فصل الخلايا كما هو الحال في الخطوة 1، 15، وتجميد الخلايا في مختبرين 1 مل من مصل البقر الجنين 90% مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد. يبرد ببطء الخلايا عن طريق وضع الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق، ثم حفظ الخلايا-20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، و-80 درجة مئوية لمدة يوم واحد. وفي اليوم التالي نقل الخلايا إلى حاوية تخزين نيتروجين سائل.

2-أصلي رقاقة

1. إعداد الكروماتين
   1. وبعد إجراء تقييم NS المشتقة، الثقافة NS في T-75 في 15 مل متوسطة مجلس الأمن القومي في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة بمناخ من الهواء 95% و 5% CO₂ حتى تصبح NS المتلاقية. لوح T-75 المتلاقية واحد سوف تسفر عن 3-5 × 10⁶ خلايا.
   2. عندما تصبح الخلايا المتلاقية، الطرد المركزي NS على 300 غرام x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وإضافة 1 مل من الخلية تفكك المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمل 5 إضافة 5 كحد أدنى من المتوسط وحساب عدد الخلايا استخدام هيموسيتوميتير¹⁰.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى 1 × 10⁶ خلايا كل رد فعل إيمونوبريسيبيتيشن (IP). لاحظ أن عنصر تحكم مفتش أو المصل المناعي مسبقاً يجب أن يكون أيضا شملت¹¹.
   3. الطرد المركزي NS في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحد في ز 300 x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية وتعليق إعادة بيليه NS مع 1 مل من محلول ملح متوازن ونقل التعليق إلى منخفض البروتين ملزمة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب.
   4. NS أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق، صب المادة طافية وإعادة تعليق بيليه الخلية في 95 ميليلتر من الهضم المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم كاكل₂، 0.2% أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين خماسي البروم ثنائي الفينيل) الواحدة 1 × 10⁶ خلايا تستكمل بحوزتي مثبط كوكتيل بتركيز عال (1: 100). فورا بيبيت الخلايا أعلى وأسفل لمنع التثاقل وتجنب خلق أي فقاعات.
   5. ريسوسبيند مناسى في الجلسرين 50% لجعل الحل 1 ملغ/مل (1.15 وحدات/ميليلتر، المخزنة في-20 درجة مئوية) التي سوف يشار إليها باسم "س 1" الأوراق المالية. جعل "0.1 x" الأسهم بالقيام بتخفيف 1:9 ثانية مع والغليسيرول 50% (مثلاً.، 900 ميليلتر من "س 1" مناسى و 100 ميليلتر من الجلسرين 50%) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
   6. مزيج 5 ميليلتر من "0.1 x" منسى و 145 ميليلتر من المخزن المؤقت الهضم. تبقى الإنزيم على الجليد من جميع الأوقات. إضافة 5 ميليلتر من منسى المخفف في المخزن المؤقت الهضم الواحدة 1 × 10⁶ خلايا. نفض الغبار على أنبوب لخلط ووضع الأنبوب في كتلة 37 درجة مئوية للضبط 12 دقيقة عملية عينات واحد في وقت واحد لضمان وقت حضانة دقيقة من 12 دقيقة.
   7. إضافة 10 ميليلتر من 10 × "مناسى إيقاف المخزن المؤقت" (110 مم تريس-HCl، pH 8.0، يدتا 55 مم) الواحدة 1 × 10⁶ خلايا. يجب الاحتفاظ بعينات على الجليد من هذه النقطة فصاعدا.
   8. إضافة ميليلتر 110 "من المخزن المؤقت x RIPA 2" (280 ملم كلوريد الصوديوم، الاثير أوكتيلفينيل غليكول البولي إثيلين 1.8%، 0.2% الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، 0.2% Na-ديوكسيتشولاتي، 5 مم جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N '، ن'--حمض tetraacetic (عطا)؛ المخزنة في 4 درجات مئوية) تستكمل مع مثبط البروتياز كوكتيل في تركيز عال (1: 100) الواحدة 1 × 10⁶ خلايا. نفض الغبار على أنبوب للمزيج.
   9. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 15 دقيقة في [ميكروفوج] عند 4 درجة مئوية و 1700 خ زاي نقل المادة طافية في أنابيب جديدة عادية 1.5 مل ميكروسينتريفوجي (لم تعد منخفضة البروتين ملزمة ميكروسينتريفوجي الأنابيب اللازمة) وتخزينها على الجليد. تجاهل بيليه.
2. إيمونوبريسيبيتيشن (IP)
   1. مزيج البروتين A والخرز المغناطيسي "ز البروتين" بنسبة 1:1. لكل من الملكية الفكرية، وإعداد 25 ميليلتر من الخرز.
   2. تغسل الخرز بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمعهد الملكي (10 ملم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 140 ملم كلوريد الصوديوم، 1% البولي إثيلين غليكول أوكتيلفينيل الاثير، والحزب الديمقراطي الصربي 0.1%، 0.1% نا-ديوكسيتشولاتي؛ المخزنة على 4 درجة مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000).
   3. استخدام مغناطيس للسماح بالخرز لفصل من الحل الغسيل وصب الحل الغسيل (حوالي 1 دقيقة). نفذ الخطوة يغسل مرتين.
   4. إعادة تعليق الخرز على وحدة التخزين الأصلية باستخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000).
   5. إذا كان ضروريا، وتمييع الكروماتين استخدام المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز (1: 1000) حيث يكون لكل IP حجم 100-200 ميليلتر. حجز نسبة 10% حجم المستخدمة في مجال الملكية الفكرية الكروماتين للمدخلات.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا استخدمت 200 ميليلتر في مجال الملكية الفكرية، 20 ميليلتر من الكروماتين المخفف ينبغي أن تكون محفوظة للإدخال. لما مجموعة أربع IPs، ينبغي إضعاف حجم إجمالي الكروماتين إلى 820 ميليلتر.
   6. إعداد الإدخال. إضافة 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (الرقم الهيدروجيني 10 ملم تريس-HCl 8.0، يدتا 1 مم) تستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) للإدخال واحتضان الإدخال في 55 درجة مئوية ح 1.
      ملاحظة: يمكن إجراء الخطوات 2.2.6-2.2.7 جنبا إلى جنب مع خطوات 2.3.4 و 2.4.1.
   7. تنقية الإدخال باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة والوتي في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
   8. قياس تركيز الإدخال باستخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي وتسجيل النتائج في دفتر الملاحظات. فارغة مع المخزن المؤقت شطف من كيت.
      ملاحظة: في نيوروسفيريس الماوس، استخدمنا حوالي 6 ميكروغرام من الحمض النووي لكل IP.
   9. تشغيل الإدخال على جل 1% أو تحميل 1 ميليلتر في "بيواناليزير الحمض النووي" استخدام الإعدادات القياسية. تخزين ما تبقى لاستخدامها كمدخلات في تطبيقات المتلقين للمعلومات.
   10. إضافة 10 ميليلتر بروتين غسلها A & ز الخرز المغناطيسي لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 1 في 4 درجات مئوية.
       ملاحظة: على سبيل المثال، إضافة 30 ميليلتر بروتين A & ز المغناطيسي الخرز لثلاثة من البرامج المتكاملة.
   11. وضع العينات في مغناطيس وتسمح الخرز لفصل. تقسيم الكروماتين بتحويل المبلغ الذي سبق تحديدها في أنبوب 1.5 مل جديدة.
   12. إضافة الجسم والتفاف القبعات مع الفيلم البارافين البلاستيك لتجنب التبخر. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
       ملاحظة: ينبغي تحديد تركيز تجريبيا في أعقاب توصيات الشركة المصنعة.
   13. في اليوم التالي، تدور الأنابيب استخدام أجهزة الطرد مركزي مصغرة في درجة حرارة الغرفة، 2000 س ز، ل 10 ق. ثم إضافة 10 ميليلتر من حبات لكل IP واحتضان الملكية الفكرية ح 3 في 4 درجات مئوية مع التناوب على 20 لفة في الدقيقة.
3. يغسل IP وهضم البروتين
   1. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ريبا تكملة مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية. كرر هذا يغسل تيب خمسة.
   2. إضافة 150 ميليلتر من المخزن المؤقت ليكل (250 ملم ليكل، 10 مم تريس pH 8.0، 1 مم يدتا، 0.5% NP-40، 0.5% نا-ديوكسيتشولاتي؛ ومخزن في 4 درجات مئوية) وتستكمل مع مثبطات البروتياز في التركيزات المنخفضة (1: 1000) لكل IP واحتضان الملكية الفكرية عند 4 درجة مئوية، مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة المغناطيسي الوقوف وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
   3. إضافة 150 ميليلتر الباردة الشركة المصرية للاتصالات (لا مثبطات البروتياز) واحتضان العينة في 4 درجات مئوية مع تناوب لفة في الدقيقة 20 لأدنى 5 مكان العينة على الوقوف مغناطيسية وتسمح الخرز المغناطيسي لفصل. استخدام بيبيت لإزالة المادة طافية.
   4. بعد هذه الخطوة النهائية الغسيل، إعادة تعليق العينة في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات وتستكمل مع بروتيناز ك (0.5 ملغ/مل) واحتضان العينة في 55 درجة مئوية ح 1.
4. تنقية الحمض النووي ورقاقة الكمية Real-Time PCR (qPCR)
   1. تنقية إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR. بعد إضافة الحمض النووي ملزم العازلة من المجموعة لكل عينة، وضع الأنبوب على مغناطيس وانتظر حتى الخرز المغناطيسي الكلي، ثم نقل المادة طافية على العمود "تنظيف". اتبع إرشادات الشركة المصنعة والوت في 50 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت المنصوص عليه في مجموعة.
   2. للتحقق من نجاح الملكية الفكرية، أداء قبكر. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تصمم كبسولة تفجير لمناطق السيطرة الإيجابية والسلبية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، لعنوان IP يقوم ب H3K4me3 و H3K27me3، نماذج التالية يجب تشغيل على قبكر: H3K4me3، H3K27me3، ومفتش رقاقة الحمض النووي، إدخال الحمض النووي، وليس قالب تحكم (المجلس الوطني الانتقالي) باستخدام كبسولة تفجير للمناطق لإثراء مع H3K4me3 (مراقبة إيجابية) و المناطق إثراء مع H3K4me3 (مراقبة سلبية)؛ وبالمثل، ل H3K27me3.
   3. اتبع البروتوكولات القياسية لأداء قبكر¹². بإيجاز، أداء قبكر استخدام مزيج الرئيسي الأخضر سيبر، 0.5 ميليلتر من 10 ميكرون العامل تركيز كل إلى الأمام وعكس التمهيدي وميليلتر 2 رقاقة أو إدخال الحمض النووي. قراءة لوحات باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي. وترد في الجدول 2تسلسل التمهيدي. تسلسلات التمهيدي جابده من هوانغ وآخرون. وكانت تستخدم¹³.
   4. تحليل بيانات الشريحة بالنسبة للمدخلات، أي في المئة إدخال أسلوب (% IP)¹⁴. حساب النسبة المئوية للإدخال باستخدام الصيغ التالية:
      تعديل الإدخال = ct يعني (مدخلات)-تسجيل₂(مدافع)
      حيث مدافع هو عامل إضعاف للانطلاق بالإدخال و
      مدافع = الحجم الكلي للملكية الفكرية/حجم الإدخال
      % IP = 100 × 2 ^ (تعديل الإدخال-"الأشعة المقطعية" (IP))
      حيث Ct هو عامل العتبة.

النتائج

ويرد تمثيل تخطيطي للورم NS المتولدة من ورم الدماغ التي تكون فيها خلايا ورم المخ كاتوشكا إيجابية في الشكل 1. الرقم 2 تمثيل تخطيطي لتقنية شرائح كاملة. يظهر الشكل 3 نتائج تمثيلية للونين من ورم الدماغ NS يهضم مع مناسى ل 12 دقيقة، مم?...

Discussion

البروتوكول المعروضة هنا سوف تمكن المستخدم من أداء رقاقة الأصلي في NS المستمدة من أورام الدماغ المهندسة وراثيا. على النقيض من رقاقة العابرة للربط، يقتصر هذا البروتوكول لدراسة البروتينات التي تربط محكم مع الحمض النووي⁶. يمكن تعديل عدد الخلايا التي تستخدم عند الضرورة ويمكن الار?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W