Иммунопреципитация родной Chromatin, с использованием Neurospheres опухоли мозга мышиных

Резюме

Эпигенетические механизмы часто изменяются в глиомы. Иммунопреципитации Chromatin может использоваться для изучения последствий генетических изменений в глиомы, которые в результате изменения гистона модификации, которые регулируют хроматина структуры и Джин транскрипции. Этот протокол описывает родной хроматина иммунопреципитации мышиных мозга опухоль neurospheres.

Аннотация

Эпигенетические изменения могут быть вовлечены в развитии и прогрессировании глиомы. Изменения в метилирования и ацетилирование промоутеров и регулирования регионов онкогенов и супрессоров опухолевого роста может привести к изменения в экспрессии генов и играют важную роль в патогенезе опухолей головного мозга. Иммунопреципитации родной chromatin (обломока) является популярный метод, который позволяет обнаруживать изменения или другие белки, тесно привязанный к ДНК. В отличие от сшитого чип, в родной чип клетки не обрабатываются с формальдегидом для ковалентно связывать белок с ДНК. Это выгодно, потому что иногда сшивки может исправить белки, которые только временно взаимодействуют с ДНК и не иметь функциональное значение в регуляции генов. Кроме того антитела обычно поднимаются против нефиксированных пептиды. Таким образом специфичность антитела увеличивается в родной чип. Однако важно иметь в виду, что родной чип применима только для изучения гистонами или других белков, которые плотно связывать ДНК. Этот протокол описывает родной хроматина иммунопреципитации мышиных мозга опухоль neurospheres.

Введение

Эпигеномные события являются частыми в глиомы и вероятно играть важную роль в патогенезе опухоли. Действительно в педиатрических полноценного глиомы, мутации генов, кодирующих гистона варианты H3.3 и H3.1 часто происходят¹. Мутации влияют изменения гистона и имеют крупные эпигенетические последствия^2,3. В подростка взрослый спектра рецидивирующий мутации гена isocitrate дегидрогеназа в 1/2 (IDH1/2), мутации, которая тормозит α-кг зависимых гистона и ДНК-де methylasaes и генетические изменения в другие регуляторы хроматина, как ATRX и DAXX происходят ⁴. Таким образом, оно имеет решающее значение для изучения, как мутации, которые влияют на эпигеномный регуляторы изменить структуру хроматина и регулирования гистона модификации, которые, в свою очередь, имеют сильное влияние опухолевых клеток транскриптом.

Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является мощным инструментом, используемым для оценки влияния эпигеномные изменения в геноме^5,6,7. В родной чип хроматина переваривается с Микрококковая Нуклеаза (MNase), immunoprecipitated, с использованием антител против протеина интереса, и затем ДНК очищается от immunoprecipitated хроматина комплекс⁶. Клетки не устанавливается во время процедуры, поэтому этот метод применим только для изучения белков, которые тесно взаимодействуют с ДНК⁶. Отсутствие cross-linking СПИДа специфичность антитела, так как антитела обычно поднимаются против нефиксированных пептидов и белков⁷. Кроме того так как нет никаких сшивки шаг, это уменьшает шансы установления переходных протеин дна взаимодействий, которые являются неспецифическими и не регулирования в^7,8. Чип может использоваться для идентификации обогащения изменения гистона в определенном регионе геномной. Здесь мы подробно протокол для выполнения родной чип в neurospheres (NS) генерируется из генетически инженерии мыши модели глиомы.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Мичиган.

1. поколение опухоли мозга НС и культивирования условий.

1. Подготовьте среднего нервных стволовых клеток (НСК) с Дульбекко изменение Eagle среднего/F12B27 дополнение (1 x), N2 дополнение (1 x) и противомикробные реагента. Дополнение НСК среднего в день использования с человеческого рекомбинантного эндотелиальный фактор роста (EGF) и basic фибробластический фактор роста (ФБП) в конечной концентрации 20 нг/мл каждый.
2. Вызвать опухоль мозга мыши, используя Спящая красавица transposon системы, в которой вводится плазмид кодирования онкогенов или индуцируемый ориентации супрессоров в боковых желудочков новорожденных для создания спонтанной мозга опухоли⁹. Выберите мышь с большой опухоли, что подтверждается с работой с биолюминесценции образами.
   Примечание: Можно найти более подробную информацию о конструкции Спящая красоты Transposon системы и плазмиды, используемые в Кэлинеску и др. ⁹.
   1. Чтобы изображение мышей, придать 100 мкл раствора люциферин 30 мг/мл, внутрибрюшинно с помощью 26 иглы.
   2. 5 мин после инъекции люциферин, анестезировать животное, используя камеру анестезии с потока кислорода/изофлюрановая равным 2% изофлюрановая.
   3. Когда животные находятся под наркозом (обычно 2-3 мин), место животных в зале биолюминесценции с кислородом изофлюрановая равным 2% изофлюрановая. Если животные будет под наркозом дольше 5 минут, используйте глазная мазь для предотвращения сухости во время под наркозом.
   4. Изображение мышей, с использованием в vivo оптических изображений системы со следующими параметрами: автоматической экспозиции, большой биннинга и диафрагмы f = 1. Значение параметра считать большой опухоли — биолюминесценции > 10 /sr⁶ фотоны/s/см².
3. Усыпить мышь с передозировкой изофлюрановая ингаляционного анестетика в закрытой камере, проверьте, щепотка мыс, что животное наркозом и обезглавить мыши.
4. Экстракт мозга и вскрыть его, как описано ранее в Кэлинеску и др. ⁹.
5. Место мозга в 10 см Петри. Если опухоли индуцированные выражает флуоресцентный белок, использовать люминесцентные, рассекает микроскопом набор соответствующий канал флуоресцентные и 0,3 X увеличение, иначе определить массу опухоли на различия в ткани цвета и текстуры. Используйте скальпель и щипцы для разделения опухолевой ткани от нормального мозга.
6. Фарш опухоли на мелкие кусочки в чашке Петри. Место расчлененных опухоли в 1,5 мл трубку с 300 мкл НСК среды.
7. Используйте одноразовые пластиковые гранулы пестик, который подходит к стенкам трубки конические microcentrifuge нежно гомогенизировать опухоли. Добавьте 1 mL клеток отряд среды и Проинкубируйте образцы для 5 минут при 37 ° C.
   Примечание: Использование пестиком могут убить некоторых клеток. Если читатель хочет максимизировать жизнеспособность клеток, использование пестиком может быть пропущена.
8. Передайте суспензию клеток от шаге 1.7 через стрейнер ячейки 70 мкм и мыть сито с 25 мл среды НСК.
9. Центрифуга для подвески на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, сцеживаться супернатант и вновь приостановить гранулы в 6 мл среды НБК.
10. Пластина суспензию клеток опухоли из шага 1.9 в T-25 колбу культуры и культуры при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой 95% воздуха и 5% CO₂. Обычно после 3 дней будет смесь некоторых мертвых клеток, придерживался клеток и некоторых клеток, образующих NS, которые плавают в среде.
11. Передача в коническую пробирку 15 мл суспензии клеток, собирать только те ячейки, которые опускаться на дно с помощью микропипеткой и повторно пластины их на колбе культуры ткани T-75.
12. Сохранить клетки на относительно высокой плотности (1-3 Х 10⁶ клеток в T-25). Проход клеток, когда они вырожденная.
    Примечание: Confluency определяется размер сферы. Черный центров больших сферах означает что есть мертвых клеток в центре и указывают, что клетки должны быть пассированной немедленно.
13. Добавьте факторы роста (EGF и basic ФБП; 20 нг/мл) каждые три дня. Изменение среднего когда клетки не притока и средних поворотов оранжевый свет.
14. Чтобы изменить носитель, собирать старые среднего и центрифуги на 300 x g при комнатной температуре в течение 5 минут и вновь приостановить Пелле клеток в среде НБК, дополненная EGF и ФБП в концентрации, указанные в шаге 1.1.
    Примечание: Если сферы находятся в середине-высокой confluency, но не готовы быть пассированной (сфера размер мал с диаметром < 100 мкм), то гранулы могут быть разделены на две фляги.
15. Для прохода клетки, центрифуга клетки на 300 g x 5 мин при комнатной температуре, декантируют супернатант и инкубации клеток в среде отряд ячейки для 5 минут при 37 ° C.
    1. Добавьте 5 мл сбалансированного солевого раствора разбавить отряд среднего и центрифуги на 300 g x 5 мин при комнатной температуре.
    2. Декант супернатанта, Ресуспензируйте Пелле клеток в 18 мл среды НСК и поровну разделить подвеска три колбы T-25.
16. Чтобы заморозить аликвоты клеток, разбить ячейки как шаг 1.15 и заморозить клеток в 1 мл аликвоты плода бычьим сывороточным 90% с 10% диметилсульфоксида. Медленно остыть клетки, поместив клетки на льду за 10 мин, затем клеток-20 ° C на 30 мин и -80 ° C за 1 день. Следующий день, передачи клетки в контейнер для хранения жидкого азота.

2. родной чип

1. Подготовка хроматину
   1. После внесения запас производных NS, культура NS в T-75 в 15 мл среды НСК при 37 ° C в инкубатор культуры ткани с атмосферой воздуха 95% и 5% CO₂ до тех пор, пока NS стать вырожденная. Одна пластина вырожденная T-75 принесут 3-5 Х 10⁶ клеток.
   2. Когда клетки становятся вырожденная, центрифуга NS на 300 g x 5 мин, декантируют супернатант и добавьте 1 mL среды диссоциации клеток. Инкубировать клетки при 37 ° C за 5 минут добавить 5 мл среды и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева¹⁰.
      Примечание: 1 x 10⁶ клеток необходимы в иммунопреципитации (IP) реакции. Обратите внимание, что предварительно иммунной сыворотки или IgG управления также должны быть включены¹¹.
   3. Центрифуга NS в одной из труб microcentrifuge 1,5 мл на 300 x g 5 мин, сцеживаться супернатант и вновь приостановить NS лепешка с 1 мл раствора сбалансированного солевого раствора и передать низкопротеиновое привязки 1.5 мл пробирок microcentrifuge подвеска.
   4. Центрифуга NS на 300 x g 5 мин, декантируют супернатант и вновь приостановить Пелле клеток в 95 мкл буфера пищеварения (50 мм трис-HCl, рН 8,0, 1 мм₂CaCl, 0,2% полиэтиленгликоль octylphenyl эфира) за 1 х 10⁶ клеток дополнена протеазы ингибитор коктейль в высокой концентрации (1: 100). Сразу же накапайте клетки вверх и вниз для предотвращения слипания и избегать создания любые пузыри.
   5. Ресуспензируйте MNase в 50% глицерина сделать решение 1 мг/мл (1,15 единиц/мкл, хранятся при температуре-20 ° C), которое будет называться как «1 x» запас. Сделать «0.1 x» складе, делая второй разбавления 1:9 с 50% глицерина (например., 900 мкл «1 x» MNase и 100 мкл 50% глицерина) и хранить его при-20 ° C.
   6. Смешайте 5 мкл «0.1 x» MNase и 145 мкл буфера пищеварения. Держите фермента на льду все времена. 5 мкл разбавленного MNase, в буфере пищеварение за 1 х 10⁶ клеток. Флик трубки смешивать и поместить трубку в блоке 37 ° C для ровно 12 мин процесс образцы один одновременно для обеспечения точной инкубации время 12 мин.
   7. 10 мкл 10 x MNase остановить буфера (110 мм трис-HCl, рН 8,0, ЭДТА 55 мм) за 1 х 10⁶ клеток. Образцы должны храниться на льду с этого момента.
   8. Мкл 110 «2 x RIPA буфер» (280 мм NaCl, octylphenyl эфиром полиэтиленгликоля 1,8%, 0,2% лаурилсульфат натрия (SDS), 0,2% Na Дезоксихолат, 5 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA); хранить при 4 ° C) дополнена Ингибитор протеазы коктейль при высокой концентрации (1: 100) за 1 х 10⁶ клеток. Флик трубки смешивать.
   9. Центрифуга для трубы 15 мин в отцентрифугировать на 4 ° C и 1700 x g. супернатант передать новые регулярные 1,5 мл microcentrifuge трубы (низкопротеиновое привязки microcentrifuge трубы больше не нужны) и хранить их на льду. Выбросите гранулы.
2. Иммунопреципитация (IP)
   1. Смешайте белок и белок G магнитные бусы в соотношении 1:1. Для каждого IP-адреса готовить 25 мкл бисера.
   2. Вымойте бисер, добавив 1 мл Буфер RIPA (10 мм трис рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 140 NaCl, 1% полиэтиленгликоль octylphenyl эфира, 0.1% SDS, 0.1% Na Дезоксихолат; хранить при 4 ° C) дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000).
   3. Используйте магнит, чтобы позволить бусы отделяться от моющего раствора и декантировать моющий раствор (примерно 1 мин). Выполните шаг мыть дважды.
   4. Вновь приостановите бусы для исходного тома, используя буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы (1: 1000).
   5. При необходимости, разбавляют хроматина, используя буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы (1: 1000), так что каждый IP имеет объем 100-200 мкл. зарезервировать 10% от объема используется для ввода одного IP хроматина.
      Примечание: К примеру, если на IP используются 200 мкл, 20 мкл разбавленного хроматина должны быть зарезервированы для ввода. Для в общей сложности четыре IPs объем всего хроматина должны быть ослаблены 820 мкл.
   6. Подготовьте входные данные. Добавьте 100 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl рН 8,0, ЭДТА 1 мм) дополнены протеиназы K (0.5 мг/мл) на вход и инкубировать входных данных при температуре 55 ° C за 1 ч.
      Примечание: Шаги 2.2.6-2.2.7 могут выполняться наряду с шаги 2.3.4 и 2.4.1.
   7. Очистить входные данные с помощью ПЦР очистки комплект инструкций изготовителя и элюировать в 50 мкл буфера комплекта.
   8. Измерить концентрацию ввода, с помощью microvolume спектрофотометром и записывать результаты в записной книжке. Пустой с Элюирующий буфер из комплекта.
      Примечание: В neurospheres мыши, мы использовали примерно 6 мкг ДНК для каждого IP-адреса.
   9. Запуск ввода на гель 1% или загрузить 1 мкл на Bioanalyzer ДНК, с использованием стандартных параметров. Храните остаток для использования в качестве входных данных в нисходящие приложения.
   10. Добавить 10 мкл промывают белка A & G магнитные бусы для каждого IP-адреса и IP инкубировать 1 час при 4 ° C.
       Примечание: К примеру, добавьте 30 мкл белка A & G магнитные бусы для трех IPs.
   11. Поместите образцы на магнит и позволить бусы для разделения. Разделите хроматина, ранее определяется сумма перевода в новый 1,5 мл трубку.
   12. Добавьте антитела и заверните колпачки пластиковые парафин пленкой во избежание испарения. Проинкубируйте образцы на ночь при 4 ° C с вращением на 20 об/мин.
       Примечание: Концентрация должна определяться эмпирически рекомендациям производителя.
   13. Следующий день, спин трубы с помощью мини-центрифуга при комнатной температуре, 2000 x g, 10 s. Затем 10 мкл бусы для каждого IP-адреса и IP Инкубируйте 3 ч при температуре 4 ° C с вращением на 20 об/мин.
3. IP моет и переваривания белка
   1. 150 мкл Буфер RIPA, дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000) для каждого IP-адреса и Инкубируйте IP на 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитную подставку и магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки. Повторите это пять моет ТЭП.
   2. Добавить 150 мкл буфера LiCl (250 мм LiCl, 10 мм трис рН 8,0, 1 мм ЭДТА, 0,5% NP-40, 0,5% Na Дезоксихолат; хранить при 4 ° C) дополняют ингибиторы протеазы в низкой концентрации (1: 1000) для каждого IP-адреса и Инкубируйте IP на 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитные стоять и позволяют магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки.
   3. 150 мкл холодной TE (не ингибиторы протеазы) и инкубации образца при температуре 4 ° C с вращением на 20 об/мин за 5 минут место образца на магнитную подставку и магнитные бусы для разделения. Чтобы удалить супернатант используйте пипетки.
   4. После окончательной стирки шага, вновь приостановить образца в 100 мкл буфера TE дополнена протеиназы K (0.5 мг/мл) и инкубации образца при температуре 55 ° C за 1 ч.
4. Очистка ДНК и чип количественного PCR реального времени (ПЦР)
   1. Очищайте immunoprecipitated ДНК, используя комплект для очистки ПЦР. После добавления ДНК привязки буфера из комплекта для каждого образца Поместите трубку на магнит и ждать, пока магнитные бусы щебня, затем передать супернатант в столбце очистки. Следуйте инструкциям производителя и элюировать в 50 мкл буфера комплекта.
   2. Чтобы проверить, если IP является успешным, выполните ПЦР. В идеале грунтовки должны быть разработаны для регионов положительной и отрицательной контроля.
      Примечание: например, для IP выступал с H3K4me3 и H3K27me3, следующие примеры должны выполняться на ПЦР: H3K4me3, H3K27me3 и IgG чип ДНК, ввод ДНК, а не шаблон элемента (NTC) с праймерами для регионов обогащаться с H3K4me3 (положительный контроль) и регионах обогащаться с H3K4me3 (отрицательный контроль); Аналогичным образом для H3K27me3.
   3. Выполните стандартные протоколы для выполнения ПЦР¹². Короче говоря выполняйте ПЦР, используя зеленый Мастер микс SYBR, 0.5 мкл 10 мкм рабочей концентрации каждого прямого и обратного грунтовка и 2 мкл рабочего раствора микросхемы или ввода ДНК. Прочитано пластины с помощью ПЦР в режиме реального времени системы. Грунтовка последовательности приведены в таблице 2. Gapdh грунтовка последовательности от Хван и др. были используемые¹³.
   4. Анализировать чип данных по отношению к входу, то есть процент ввода метода (% IP)¹⁴. Рассчитайте процент ввода, используя следующие формулы:
      Скорректированы ввода = среднее ct (вход)-вход₂(DF)
      где DF является коэффициент разбавления начального ввода и
      DF = общий объем IP / объем ввода
      % IP = 100 × 2 ^ (с учетом ввода - Ct (IP))
      где КТ-коэффициент порогового значения.

Результаты

Схематическое представление NS, созданные от опухоли головного мозга, где клетки опухоли мозга являются Катюшка позитивные опухоли представлена на рисунке 1. На рисунке 2 это схематическое представление всей техники чип. Рис?...

Обсуждение

Протокола, представленные здесь позволят пользователю выполнять родной чип на NS, производный от опухоли мозга генной инженерии. В отличие от сшивки чип, этот протокол ограничен для изучения белков, которые тесно связывают с ДНК⁶. Количество ячеек, которые используются може...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W