利用小鼠脑肿瘤球的原发染色质沉淀

摘要

后生机制在胶质瘤中经常被改变。染色质沉淀可用于研究基因改变的后果, 胶质瘤的改变导致的组蛋白修饰, 调节染色质结构和基因转录。本协议描述了小鼠脑肿瘤球的原发染色质沉淀。

摘要

后生修饰可能参与胶质瘤的发展和进展。癌基因和肿瘤抑制因子的促发和调控区的甲基化和再乙酰性的改变, 可能会导致在脑肿瘤的发病机制中的表达改变, 并发挥重要作用。原生染色质沉淀 (芯片) 是一种流行的技术, 允许检测的修改或其他蛋白质紧紧绑定到 DNA。与交联芯片不同的是, 在原生芯片中, 细胞不能用甲醛来将蛋白质与 DNA 进行共价键连接。这是有利的, 因为有时交联可能修复的蛋白质, 只有短暂的互动与 DNA, 并没有功能意义的基因调控。此外, 抗体通常是针对不固定的多肽。因此, 原片中抗体特异性增加。然而, 重要的是要记住, 本机芯片只适用于研究组蛋白或其他与 DNA 紧密结合的蛋白质。本协议描述了鼠脑肿瘤球的原染色质沉淀。

引言

后生事件在胶质瘤中很常见, 可能在肿瘤发病中起重要作用。的确, 在儿科高级别胶质瘤中, 基因组蛋白变体 H3.3 和 H3.1 编码的突变通常发生在¹。突变影响组蛋白修饰, 并有主要的后生后果^2,3。在青春期到成人频谱, 复发突变的异脱氢酶基因 1/2 (IDH1/2), 一种突变, 抑制α公斤依赖组蛋白和 DNA de methylasaes, 以及基因改变的其他染色质调节器, 如 ATRX 和 DAXX 发生⁴. 因此, 研究影响后生调节因子的突变是如何改变染色质结构和调节组蛋白修饰的至关重要的, 而这反过来又会对肿瘤细胞的转录产生巨大的影响。

染色质沉淀 (芯片) 是一种功能强大的工具, 用于评估在基因组^5,6,7中表观遗传修饰的影响。在原生芯片中, 染色质是用 micrococcal 核酸 (MNase) 消化的, immunoprecipitated 使用对感兴趣的蛋白质提出的抗体, 然后从 immunoprecipitated 染色质复合体⁶中纯化出 DNA。细胞在过程中没有固定, 因此这种技术只适用于与 DNA⁶紧密交互的蛋白质的研究。缺乏交叉链接艾滋病抗体特异性, 因为抗体通常是针对不固定的多肽或蛋白质⁷。此外, 由于没有交叉链接的步骤, 这就减少了固定非特定的瞬时蛋白质-DNA 相互作用的几率, 而不是规范的^7,8。芯片可以用来识别在特定的基因组区域中蛋白修饰的丰富性。在这里, 我们详细介绍了一个在球 (NS) 中由基因改造的小鼠胶质瘤模型来执行本机芯片的协议。

研究方案

这里描述的所有方法都得到了密歇根大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 产生脑肿瘤 NS 和培养条件。

1. 准备神经干细胞培养基 (国安局) 与 Dulbecco 的改良鹰 Medium/F12B27 补充剂 (1x), N2 补充剂 (1x), 和抗菌试剂。在与人类重组内皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维细胞生长因子 (增殖素) 的使用日, 在最终浓度为 20 ng/毫升时, 补充国安局培养基。
2. 利用睡眠美容转系统诱导小鼠脑肿瘤, 将基因或 shRNA 靶向肿瘤抑制物的质粒编码, 注入新生儿的侧脑室, 产生自发性脑肿瘤⁹。选择一个大肿瘤的老鼠, 这是证实与生物发光成像。
   注: 有关睡眠美容转系统和质粒结构的详细信息, 可在 Calinescu et al.中找到。⁹。
   1. 为图像的小鼠, 注入100µL 30 毫克/毫升素溶液腹腔使用26口径针。
   2. 5分钟后注射素, 麻醉的动物使用麻醉室氧/异氟醚流量设置为2% 异氟醚。
   3. 当动物被麻醉 (通常2-3 分钟), 安置动物在生物发光房间与氧异氟醚设置到2% 异氟醚。如果这些动物的麻醉时间超过5分钟, 请使用眼部药膏来预防麻醉时的干燥。
   4. 使用活体光学成像系统对小鼠进行图像处理, 其参数如下: 自动曝光、大分和孔径 f=1。考虑它的参量大肿瘤是生物发光 > 10⁶光子/s/cm²/sr。
3. 用过量的异氟醚吸入麻醉剂在密闭的室内安乐, 用脚趾夹紧检查动物的麻醉, 并斩首鼠标。
4. 提取大脑和解剖它如前面所描述的 Calinescu et al.⁹。
5. 将大脑放置在10厘米的培养皿中。如果肿瘤诱导表达荧光蛋白, 使用荧光解剖显微镜设置适当的荧光通道和0.3X 放大倍数, 否则识别肿瘤肿块的不同组织的颜色和质地。用手术刀和镊子将肿瘤组织从正常的大脑中分离出来。
6. 将肿瘤切成小块在培养皿中。将解剖肿瘤放置在1.5 毫升的管中, 300 µL。
7. 使用一次性塑料颗粒杵, 适合于壁锥形离心管轻轻质肿瘤。加入1毫升的细胞剥离培养基, 并孵育样品5分钟在37° c。
   注意: 使用杵可能会杀死一些细胞。如果读者想最大化细胞的生存能力, 使用杵可以省略。
8. 通过70µm 细胞过滤器通过1.7 步的细胞悬架, 并用25毫升的国安培养基清洗滤网。
9. 离心悬浮在 300 x g 在室温下5分钟, 醒酒上清和再悬浮颗粒成6毫升的国安会培养基。
10. 板肿瘤细胞悬浮从步1.9 入 T-25 文化烧瓶和文化它在37° c 在一个组织培养孵化器以95% 空气大气和 5% CO₂。通常在3天之后, 会有一些死细胞、黏附的细胞和一些形成 NS 的细胞混合物在培养基中漂浮。
11. 将细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管中, 只收集到底部的细胞, 使用微, 再将其重新印在 T-75 的组织培养瓶上。
12. 保持相对高密度的单元格 (T-25 中的 1-3 X 10⁶单元格)。通过细胞时, 他们是汇合。
    注: 70-100 是由球体大小决定的。大球体的黑色中心意味着中心有死细胞, 并表明细胞应立即传代。
13. 每三天增加生长因子 (EGF 和碱性-20/毫升)。当细胞不汇合, 培养基变浅橙色时, 改变培养基。
14. 为了改变培养基, 收集旧介质, 在室温下离心 300 x g, 在5分钟内将细胞颗粒重新悬浮, 并在1.1 步中指定的浓度中补充 EGF 和生长因子。
    注: 如果球体在中至高 70-100, 但尚未准备好传代 (球体尺寸较小, 直径 < 100 µm), 则小球可分为两个烧瓶。
15. 通过细胞, 离心细胞在 300 x g 为5分钟在室温下, 醒酒上清液和孵育细胞脱离介质5分钟在37° c。
    1. 加入5毫升的平衡盐溶液稀释剥离介质, 并离心 300 x g, 在室温下5分钟。
    2. 醒酒上清液, 在18毫升的重中, 将细胞颗粒分成三 T-25 烧瓶。
16. 要冻结细胞的等分, 将细胞与步骤1.15 分离, 并在1毫升等分中冷冻90% 胎牛血清和10% 二甲基亚砜的细胞。将细胞放在冰上10分钟, 然后保持细胞-20 ° c 30 分钟,-80 ° c 为1天, 慢慢冷却细胞。第二天, 将细胞转移到液态氮储存容器。

2. 原片

1. 染色质制剂
   1. 在 T-75 的培养基中, 在37° c 的15毫升的组织培养箱中, 在95% 空气和 5% CO₂的环境下, 在 ns 成为汇合体后, 将其培养成 ns。一个汇合的 T-75 板将产生 3-5 X 10⁶单元。
   2. 当细胞成为汇合, 离心机 NS 在 300 x g 为5分钟, 醒酒上清和增加1毫升细胞离解介质。在37° c 孵育5分钟的细胞, 添加5毫升培养基, 并使用例¹⁰对单元格进行计数。
      注意: 每个沉淀 (IP) 反应需要 1 x 10⁶单元格。请注意, 前免疫血清或 IgG 控制也必须包括¹¹。
   3. 离心的 ns 在一个1.5 毫升离心管在 300 x g 5 分钟, 醒酒上清和再悬浮 ns 颗粒与1毫升的平衡盐溶液和转移悬浮到低蛋白结合1.5 毫升离心管。
   4. 离心机 NS 在 300 x g 为5分钟, 醒酒上清和重新悬浮在95µL 消化缓冲液中的细胞颗粒 (50 毫米三盐酸, pH 8.0, 1 毫米 CaCl₂, 0.2% 聚乙二醇苯基醚) 每 1 x 10⁶细胞补充的蛋白酶高浓度抑制剂鸡尾酒 (1:100)。立即吸管细胞, 防止结块, 避免产生气泡。
   5. 重 MNase 50% 甘油, 使1毫克/毫升溶液 (1.15 单位/µL, 储存在-20 ° c), 将被称为 "1x" 股票。做一个 "0.1x" 的股票, 做第二1:9 稀释与50% 甘油 (e. g, 900 µL 的 "1x" MNase 和100µL 50% 甘油), 并将其存储在-20 ° c。
   6. 混合5µL 的 "0.1x" MNase 和145µL 的消化缓冲液。保持酶在冰上的所有时间。在消化缓冲液中加入5µL 稀释 MNase 每 1 x 10⁶单元格。弹管混合和放置在37° c 块的管正好12分钟. 一次处理样品, 确保准确的孵化时间为12分钟。
   7. 每 1 x 10⁶单元格添加10µL 10x MNase 停止缓冲器 (110 毫米三盐酸, pH 8.0, 55 毫米 EDTA)。从这一点开始, 样品必须放在冰上。
   8. 添加110µL "2x 帕缓冲器" (280 毫米氯化钠, 1.8% 聚乙二醇苯基醚, 0.2% 十二烷基硫酸钠 (SDS), 0.2% Na-胆酸, 5 毫米乙二醇二 (β-氨基乙基醚)-n, n, n, n, 乙酸酸 (EGTA); 储存在4° c) 补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒在高浓度 (1:100) 每 1 x 10⁶细胞。弹管混合。
   9. 离心管15分钟在一个离心在4° c 和 1700 x g. 将上清液转移到新的常规1.5 毫升离心管 (低蛋白结合离心管不再需要) 并将它们储存在冰上。丢弃颗粒。
2. 沉淀 (IP)
   1. 混合蛋白 a 和蛋白 G 磁性珠子在1:1 的比例。每个 IP, 准备25µL 的珠子。
   2. 通过加入1毫升的帕缓冲液 (10 mm pH 8.0, 1 毫米 EDTA, 140 毫米氯化钠, 1% 聚乙二醇苯基醚, 0.1% SDS, 0.1% Na 胆酸; 储存在4° c), 辅以低浓度的蛋白酶抑制剂 (1:1000)。
   3. 使用磁铁允许珠子从洗涤液中分离, 醒酒洗涤液 (约1分钟)。执行清洗步骤两次。
   4. 使用帕缓冲剂补充蛋白酶抑制剂 (1:1000) 将珠子重新悬挂到原来的体积。
   5. 如有必要, 用蛋白酶抑制剂 (1:1000) 补充帕缓冲液稀释染色质, 使每个 ip 都有100-200 µL 的体积. 保留10% 的体积使用每 ip 染色质为输入。
      注: 例如, 如果每 IP 使用200µL, 则应为输入保留20µL 的稀释染色质。共四 IPs, 总染色质体积应稀释到820µL。
   6. 准备输入。添加100µL 的 TE 缓冲器 (10 毫米三盐酸 pH 8.0, 1 毫米 EDTA) 补充蛋白酶 K (0.5 毫克/毫升) 到输入和孵化输入在55° c 为 1 h。
      注意: 步骤 2.2. 6-2. 2.7 可以与步骤2.3.4 和2.4.1 一起执行。
   7. 按照制造商的说明和洗在试剂盒中提供的50µL 洗脱缓冲液, 使用 PCR 纯化试剂盒净化输入。
   8. 使用 microvolume 分光光度计测量输入的浓度, 并将结果记录在笔记本中。空白与洗脱缓冲从成套工具。
      注意: 在鼠标球, 我们使用了大约6µg 的 DNA 为每个 IP。
   9. 运行在1% 凝胶或负载1µL 在 DNA Bioanalyzer 使用标准设置的输入。将余数存储为在下游应用程序中用作输入。
   10. 添加10µL 的洗涤蛋白 A & G 磁性珠子为每个 ip 和孵化 ip 为1小时在4° c。
       注: 例如, 为三 IPs 添加30µL 的蛋白质 A & G 磁性珠子。
   11. 把样品放在磁铁上, 让珠子分开。通过将先前确定的量转移到新的1.5 毫升管中来分离染色质。
   12. 加入抗体, 用塑料石蜡膜包裹瓶盖, 避免蒸发。在4° c 的夜间孵育样品, 旋转 20 rpm。
       注: 浓度应根据制造商的推荐经验来确定。
   13. 第二天, 在室温下使用迷你离心机旋转管子, 2000 x g, 十年代。然后加入10µL 的珠子到每个 ip 和孵化 ip 为3小时在4° c 与自转在20转每分钟。
3. IP 洗涤和蛋白质消化
   1. 添加150µL 的帕缓冲剂补充与蛋白酶抑制剂在低浓度 (1:1000) 到每个 ip 和孵化 ip 在4° c 与自转在20转每分钟为 5 min. 将样品放在磁性的支架上, 让磁珠分开。用吸管去除上清液。重复这 tep 五洗。
   2. 添加150µL 氯化缓冲器 (250 毫米氯化, 10 毫米三, pH 8.0, 1 毫米 EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% Na 胆酸; 贮存在4° c) 在低浓度 (1:1000) 的补充与蛋白酶抑制剂, 在4° c 的每 ip 和孵育 ip 以自转在 20 rpm 为 5 min. 安置样品在磁性的立场和允许磁珠分开。用吸管去除上清液。
   3. 添加150µL 的冷 TE (无蛋白酶抑制剂) 和孵化的样品在4° c 旋转在 20 rpm 为5分钟. 将样品放在磁性支架上, 并允许磁珠分开。用吸管去除上清液。
   4. 在最后的洗涤步骤, 重新暂停样品在100µL 的 TE 缓冲补充蛋白酶 K (0.5 毫克/毫升) 和孵化样品在55° c 为1小时。
4. DNA 纯化与芯片定量实时 PCR (qPCR)
   1. 利用 PCR 纯化试剂盒净化 immunoprecipitated DNA。在从试剂盒中添加 DNA 结合缓冲器到每个样品后, 将管放在磁铁上, 等待磁珠聚合, 然后将上清液转移到清理柱上。按照制造商的说明和洗在50µL 的洗脱缓冲器提供的套件。
   2. 要检查 IP 是否成功, 请执行 qPCR。理想情况下, 底漆应设计为正负控制区域。
      注: 例如, 对于使用 H3K4me3 和 H3K27me3 执行的 IP, 以下示例应在 qPCR 上运行: H3K4me3、H3K27me3 和 IgG 芯片 dna、输入 DNA 和无模板控制 (NTC), 使用引物来丰富区域与 H3K4me3 (阳性控制) 和用 H3K4me3 (负控制) 丰富区域;同样, 对于 H3K27me3。
   3. 按照标准协议执行 qPCR¹²。简要地, 执行 qPCR 使用 SYBR 绿色大师混合, 0.5 µL 10 µM 工作集中每向前和反向底漆和2µL 芯片或输入脱氧核糖核酸。使用实时 PCR 系统读取车牌。在表 2中提供了入门序列。Gapdh 引物序列从黄et al。使用了¹³。
   4. 分析与输入相关的芯片数据,即百分比输入方法 (% IP)¹⁴。使用以下公式计算百分比输入:
      调整的输入 = 平均 ct (输入)-日志₂(DF)
      DF 是起始输入的稀释因子,
      DF = 总的 IP 容量/输入量
      % ip = 100×2 ^ (被调整的输入-Ct (IP))
      其中 Ct 是阈值因子。

结果

在图 1中, 在脑肿瘤细胞 Katushka 阳性的脑瘤中产生的肿瘤 NS 的图示。图 2是整个芯片技术的示意图表示。图 3显示了来自脑肿瘤 NS 的染色质的代表性结果, MNase 为12分钟, 产生了大多数单、di 和三核。在芯片上, 可以对芯片进行 qPCR, 并输入 DNA 样本。图 4显示了来自 qPCR glyceraldehyde-3-phosp...

讨论

这里提供的协议将使用户能够在来自基因工程脑肿瘤的 NS 上执行本机芯片。与交叉连接芯片相比, 这个协议是有限的研究与 DNA 紧密关联的蛋白质⁶。所使用的单元格数可以根据需要进行修改, 并且可以扩展协议。我们每 IP 使用 1 X 10⁶单元, 但是, 本机芯片也可以执行, 只要有 4 X 10⁴单元格⁵。在本协议中, 我们通过 qPCR 分析芯片 DNA;然而, 该协议也可?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W