Immunoprécipitation de la chromatine native à l’aide de Neurospheres de tumeur de cerveau murin

Résumé

Des mécanismes épigénétiques sont fréquemment altérées dans les gliomes. Immunoprécipitation de la chromatine pourrait servir à étudier les conséquences des altérations génétiques dans les gliomes qui résultent de l’évolution des modifications d’histone qui régulent la transcription de gène et de la structure de la chromatine. Ce protocole décrit l’immunoprécipitation de la chromatine native sur neurospheres de tumeur de cerveau murin.

Résumé

Modifications épigénétiques peuvent être impliquées dans le développement et la progression des gliomes. Changements dans la méthylation et l’acétylation des promoteurs et des régions régulatrices des oncogènes et suppresseurs de tumeur peuvent entraîner des changements dans l’expression des gènes et jouent un rôle important dans la pathogenèse des tumeurs cérébrales. Immunoprécipitation de la chromatine native (ChIP) est une technique populaire qui permet la détection de modifications ou d’autres protéines étroitement liées à l’ADN. Contrairement à réticulé ChIP, Chip natif, les cellules ne sont pas traités avec du formaldéhyde pour lien par liaison covalente à l’ADN. C’est avantageux parce que parfois les réticulation peut fixer des protéines qui interagissent avec l’ADN seulement transitoirement et qui n’ont pas de signification fonctionnelle dans la régulation des gènes. En outre, les anticorps sont généralement opposés de peptides non fixées. Par conséquent, spécificité de l’anticorps est augmentée dans puce native. Cependant, il est important de garder à l’esprit que puce native ne s’applique qu’à l’étude des histones ou autres protéines qui se lient étroitement à l’ADN. Ce protocole décrit l’immunoprécipitation de la chromatine native sur neurospheres de tumeur de cerveau murin.

Introduction

Événements épigénétiques sont fréquents dans les gliomes et jouent probablement un rôle important dans la pathogenèse de la tumeur. En effet, en pédiatrie gliome, mutations dans les gènes codant les variants d’histones H3.3 et H3.1 produisent fréquemment¹. Les mutations affectent des modifications d’histone et ont des conséquences majeures épigénétique^2,3. Chez l’adolescent au spectre adult, mutations récurrentes isocitrate déshydrogénase gène 1/2 (IDH1/2), une mutation qui inhibe les α-KG charge histone et l’ADN de-methylasaes et des altérations génétiques dans les autres organismes de réglementation de la chromatine comme ATRX et DAXX se font ⁴. par conséquent, il est crucial d’étudier comment les mutations qui affectent les régulateurs épigénétiques alter structure chromatinienne et modifications d’histone réglementaires, qui, à son tour, ont des conséquences dramatiques du transcriptome des cellules tumorales.

Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil puissant utilisé pour évaluer l’impact des modifications épigénétiques dans le génome^5,6,7. À puce native, la chromatine est assimilée avec la nucléase micrococcique (MNase), immunoprécipitée à l’aide d’un anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt, et puis ADN est purifié du complexe de la chromatine d’immunoprécipitée⁶. Les cellules ne sont pas fixes au cours de la procédure afin que cette technique ne s’applique que pour l’étude des protéines qui interagissent étroitement avec ADN⁶. L’absence de réticulation du sida spécificité anticorps puisque les anticorps sont généralement élevés contre les interprétations de peptides ou protéines⁷. En outre, puisqu’il n’y a aucune étape de réticulation, cela réduit les chances de la fixation des interactions protéine-ADN transitoires qui sont non spécifiques et non réglementaires^7,8. Puce peut être utilisé pour identifier l’enrichissement des modifications d’histone dans une région génomique spécifique. Ici, nous détaillons un protocole pour effectuer puce native dans neurospheres (NS) provenant des organismes génétiquement machiné modèles murins de gliome.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université du Michigan.

1. génération de tumeur au cerveau NS et des conditions de culture.

1. Préparer les moyen de cellules souches neurales (NSC) avec supplément Modified Eagle Medium/F12B27 (1 x), Supplément N2 (1 x) et un réactif antimicrobien de Dulbecco. Supplément moyenne NSC le jour d’utilisation avec le facteur de croissance endothélial recombinante humaine (EGF) et facteur de croissance de fibroblaste-basic (FGF) à une concentration finale de 20 ng/mL de chaque.
2. Induire la tumeur au cerveau chez les souris en utilisant le système de transposon de belle au bois dormant dans lequel les plasmides codant les oncogènes ou shARN ciblant les suppresseurs de tumeur sont injectés dans les ventricules latéraux des nouveau-nés pour générer des tumeurs de cerveau spontanée⁹. Sélectionnez une souris avec une grande tumeur, qui est confirmée par l’imagerie de la bioluminescence.
   Remarque : Plus d’informations sur les constructions de Sleeping Beauty Transposon System et plasmide utilisées se trouvent dans Calinescu et al. ⁹.
   1. Pour les souris de l’image, injecter 100 µL de solution de luciférine de 30 mg/mL par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de 26 calibre.
   2. 5 min après l’injection de luciférine, anesthésier l’animal à l’aide d’une chambre d’anesthésie avec débit d’oxygène/isoflurane isoflurane 2 % la valeur.
   3. Quand les animaux sont anesthésiés (généralement 2-3 min), placer les animaux dans la chambre de bioluminescence à l’isoflurane oxygène mis à 2 % isoflurane. Si les animaux sera sous anesthésie pendant plus de 5 min, utiliser une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement tandis que sous anesthésie.
   4. L’image des souris en utilisant un en vivo optique d’imagerie système avec les paramètres suivants : exposition automatique, grand binning et ouverture f = 1. Le paramètre de l’examiner une grande tumeur est une bioluminescence > 10⁶ photons/s/cm²/sr.
3. Euthanasier la souris avec une surdose d’inhalation isoflurane anesthésique dans une enceinte fermée, vérifiez par pinch orteil que l’animal est anesthésié et décapiter la souris.
4. Extraire le cerveau et disséquer il comme décrit précédemment dans Calinescu et al. ⁹.
5. Placer le cerveau dans une boîte de Pétri de 10 cm. Si la tumeur induite par exprime une protéine fluorescente, utiliser un fluorescent binoculaire sur le canal approprié fluorescent et 0,3 X grossissement, identifier autrement masse tumorale par les différences dans la texture et la couleur de tissu. Utiliser le scalpel et forceps pour séparer le tissu de tumeur du cerveau normal.
6. Émincer la tumeur en petits morceaux dans la boîte de Pétri. Placer la tumeur disséquée dans un tube de 1,5 mL avec 300 µL de milieu NSC.
7. Utilisez un pilon de granulés de plastique jetables qui s’installe sur les murs d’un tube conique microcentrifugeuse pour homogénéiser doucement la tumeur. Ajouter 1 mL de milieu de détachement cellulaire et incuber l’échantillon pendant 5 min à 37 ° C.
   Remarque : L’utilisation d’un pilon peut tuer certaines cellules. Si le lecteur veut maximiser la viabilité des cellules, l’utilisation d’un pilon peut être omise.
8. Passer la suspension cellulaire de l’étape 1.7 à travers un tamis de cellule 70 µm et lavez le tamis avec 25 mL de milieu de NSC.
9. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 5 min à température ambiante, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 6 mL de milieu de NSC.
10. La suspension de cellules de tumeur de l’étape 1.9 dans un flacon de culture T-25 de la plaque et la culture à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère de 95 % air et 5 % de CO₂. Habituellement au bout de 3 jours, il y aura un mélange de quelques cellules mortes, de cellules adhérentes et de certaines cellules formant NS qui flottent dans le milieu.
11. Transférer la suspension de cellules dans un tube conique de 15 mL, percevoir uniquement les cellules qui se déposent au fond à l’aide d’une micropipette et re-plaque d’eux sur un flacon de culture de tissus T-75.
12. Maintenir les cellules à une densité relativement élevée (1-3 X 10⁶ cellules dans un T-25). Le passage des cellules lorsqu’elles sont confluentes.
    Remarque : La confluence est déterminée par la taille des sphères. Centre noir de moyenne de grandes sphères qu’il existe des cellules mortes dans le centre et indique que les cellules doivent être repiquées immédiatement.
13. Ajouter les facteurs de croissance (EGF et basic-FGF ; 20 ng/mL chacun) tous les trois jours. Changer le milieu lorsque les cellules ne sont pas des confluents et la lumière orange de tours moyennes.
14. Pour modifier le milieu, recueillir le milieu de la vieil et il centrifuger à 300 g à température ambiante pendant 5 min et Resuspendre le culot dans NSC additionné EGF et FGF à la concentration indiquée à l’étape 1.1.
    Remarque : Si les sphères sont à mi-confluence élevé, mais pas prêts à être repiquées (taille de la sphère est faible avec un diamètre < 100 µm), puis les granulés peuvent être divisés en deux flacons.
15. Pour les cellules, centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à température ambiante, éliminer le surnageant et incuber les cellules dans un milieu détachement cellulaire pendant 5 min à 37 ° C.
    1. Ajouter 5 mL de solution saline équilibrée au milieu de détachement diluées et il centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Décanter le liquide surnageant, resuspendre le culot dans 18 mL de milieu de NSC et répartissez la suspension également sur trois flacons de T-25.
16. Pour congeler les aliquotes de cellules, dissocier les cellules comme au point 1.15 et geler les cellules dans 1 ml de sérum de veau fœtal de 90 % à 10 % de diméthyl sulfoxide. Refroidir lentement les cellules en plaçant les cellules sur la glace pendant 10 min, puis en gardant les cellules de-20 ° C pendant 30 min et -80 ° C pendant 1 nuit. Le lendemain, les cellules de transfert à un conteneur de stockage d’azote liquide.

2. native ChIP

1. Préparation de la chromatine
   1. Après avoir fait le point sur NS dérivée, culture NS dans un T-75 dans 15 mL de milieu de NSC à 37 ° C dans un incubateur de culture de tissus avec une atmosphère d’air de 95 % et 5 % CO₂ jusqu'à ce que NS deviennent confluentes. Une plaque de T-75 confluente produira 3-5 X 10⁶ cellules.
   2. Lorsque les cellules deviennent confluentes, centrifuger NS à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et ajouter 1 mL de milieu de dissociation cellulaire. Incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min. Ajouter 5 mL de milieu et de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre¹⁰.
      Remarque : 1 x 10⁶ cellules sont requis par la réaction d’immunoprécipitation (IP). Notez qu’un sérum immun pré ou IgG contrôle doit également être inclus¹¹.
   3. Centrifuger le NS dans un tube de microtubes de 1,5 mL à 300 g pendant 5 min, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot de NS avec 1 mL de solution saline équilibrée et transférer la suspension pour tubes de microcentrifuge hypoprotidique liaison 1,5 mL.
   4. NS de centrifuger à 300 x g pendant 5 min, éliminer le surnageant et Resuspendre le culot dans 95 µL de tampon de digestion (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM CaCl₂, 0,2 % éther de polyéthylèneglycol octylphényle) par 1 x 10⁶ cellules additionnés de protéase inhibiteur de cocktail à une concentration élevée (1/100). Immédiatement pipette les cellules vers le haut et vers le bas pour éviter les grumeaux et éviter de créer des bulles.
   5. Resuspendre MNase dans 50 % de glycérol pour faire une solution de 1 mg/mL (1.15 unités/µL, conservés à-20 ° C) qui sera dénommée stock « 1 x ». Faire un « 0,1 x » stock en faisant une dilution de 1:9 deuxième à 50 % de glycérol (e.g., 900 µL de « 1 x » MNase et 100 µL de glycérol à 50 %) et les conserver à-20 ° C.
   6. Mix 5 µL de « 0,1 x » MNase et 145 µL de tampon de la digestion. Garder l’enzyme sur la glace tout les temps. Ajouter 5 µL de MNase dilué dans un tampon de digestion par 1 x 10⁶ cellules. Feuilleter le tube pour mélanger et placer le tube dans le bloc de 37 ° C pendant exactement 12 min processus l’un des échantillons à la fois d’assurer un temps d’incubation précis de 12 min.
   7. Ajouter 10 µL de 10 x MNase arrêter le tampon (110 mM Tris-HCl, pH 8,0, 55 mM EDTA) par 1 x 10⁶ cellules. Échantillons doivent être conservés sur glace à partir de là.
   8. Ajouter 110 µL tampon » 2 x RIPA » (280 mM NaCl, éther de polyéthylèneglycol de 1,8 % octylphényle, 0,2 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 0,2 % Na-désoxycholate, 5 mM ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tétraacétique (EGTA) ; stockés à 4 ° C) additionné de inhibiteur de la protéase cocktail à forte concentration (au 1/100) par 1 x 10⁶ cellules. Mettez le tube pour mélanger.
   9. Centrifuger les tubes pendant 15 min dans un microtube à 4 ° C et 1700 x g. transférer le surnageant dans un nouveaux tubes de microcentrifuge régulière de 1,5 mL (tubes de microcentrifuge hypoprotidique liaison ne sont plus nécessaires) et stockez-les sur la glace. Jeter le culot.
2. Immunoprécipitation (IP)
   1. Mélange de protéine A et billes magnétiques de protéines G dans un rapport 1:1. Pour chaque adresse IP, préparer 25 µL de perles.
   2. Les perles de lavage en ajoutant 1 mL de tampon RIPA (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1 % polyéthylène glycol éther d’octylphényle, SDS 0,1 %, 0,1 % Na-désoxycholate ; stockés à 4 ° C) complétée par des inhibiteurs de protéase à faible concentration (1 : 1000).
   3. Utiliser un aimant pour permettre des perles séparer de la solution de lavage et de décanter la solution de lavage (environ 1 min). Effectuer deux fois l’étape de lavage.
   4. Remettre en suspension les perles au volume initial à l’aide du tampon RIPA additionné d’inhibiteurs de la protéase (1 : 1000).
   5. Si nécessaire, diluer la chromatine à l’aide du tampon RIPA, complétée par des inhibiteurs de protéase (1 : 1000) afin que chaque adresse IP a un volume de 100-200 µL. réserve de 10 % du volume utilisé par la propriété intellectuelle de la chromatine pour l’entrée.
      NOTE : par exemple, si 200 µL sont utilisés par la propriété intellectuelle, 20 µL de chromatine diluée devrait être réservée pour l’entrée. Pour un total de quatre IPs, le volume total de la chromatine doit être dilué à 820 µL.
   6. Préparer l’entrée. Ajouter 100 µL de tampon de TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 1 mM) additionné de la protéinase K (0,5 mg/mL) à l’entrée et incuber l’entrée à 55 ° C pendant 1 h.
      Remarque : 2.2.6-2.2.7 étapes peuvent être effectuées avec les étapes 2.3.4 et 2.4.1.
   7. Purifier l’entrée à l’aide d’un kit de purification de PCR suivant les instructions du fabricant et éluer dans 50 µL de tampon d’élution fourni dans le kit.
   8. Mesurer la concentration de l’entrée à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume et consigner les résultats dans un carnet. Blanc avec un tampon d’élution du kit.
      Remarque : Dans neurospheres de souris, nous avons utilisé environ 6 µg d’ADN pour chaque adresse IP.
   9. Courir d’entrée sur un gel 1 % ou charger 1 µL sur un Bioanalyzer d’ADN en utilisant des paramètres standards. Conserver le reste pour une utilisation en tant qu’entrée dans les applications en aval.
   10. Ajouter 10 µL de protéine lavée A & billes magnétiques G pour chaque IP et IP Incuber 1 h à 4 ° C.
       NOTE : par exemple, ajouter 30 µL de protéine A et billes magnétiques G pour trois adresses IP.
   11. Placer les échantillons sur un aimant et permettre aux perles de séparer. Diviser la chromatine en transférant la somme préalablement déterminée dans un nouveau tube de 1,5 mL.
   12. Ajoutez l’anticorps et envelopper les bouchons avec film plastique paraffine pour éviter l’évaporation. Incuber les échantillons durant la nuit à 4 ° C avec rotation à 20 tr/min.
       NOTE : Concentration doit être déterminée empiriquement suivant les recommandations du fabricant.
   13. Le lendemain, faire tourner les tubes à l’aide d’une centrifugeuse minie à température ambiante, 2000 x g, pour 10 s. Ajouter 10 µL de perles à chaque adresse IP, puis incuber IP pendant 3 h à 4 ° C avec rotation à 20 tr/min.
3. Lavages de la propriété intellectuelle et de la Digestion des protéines
   1. Ajouter 150 µL de tampon RIPA, complétée par des inhibiteurs de protéase à faible concentration (1 : 1000) pour chaque adresse IP et incuber IP à 4 ° C, avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min Place l’échantillon sur un support magnétique et permettent les billes magnétiques séparer. Utilisez une pipette pour éliminer le surnageant. Répétez cette lave cinq tep.
   2. Ajouter 150 µL de tampon de LiCl (LiCl, 10 mM Tris pH 8,0, EDTA, 0,5 % de 1 mM à 250 mM NP-40, 0,5 % Na-désoxycholate ; conserver à 4 ° C) complétées par des inhibiteurs de la protéase à faible concentration (1 : 1000) pour chaque adresse IP et incuber IP à 4 ° C, avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min Place l’échantillon sur un magnétique stand et permettre des billes magnétiques séparer. Utilisez une pipette pour éliminer le surnageant.
   3. Ajouter 150 µL de TE froide (sans inhibiteurs de la protéase) et incuber l’échantillon à 4 ° C avec rotation à 20 tr/min pendant 5 min Place l’échantillon sur un support magnétique et permettent des billes magnétiques séparer. Utilisez une pipette pour éliminer le surnageant.
   4. Après le lavage final, remettre en suspension l’échantillon dans 100 µL de tampon TE additionné de protéinase K (0,5 mg/mL) et incuber l’échantillon à 55 ° C pendant 1 h.
4. Purification d’ADN et puce Quantitative Real-time PCR (qPCR)
   1. Purifier l’ADN immunoprécipitée à l’aide d’un kit de purification de PCR. Après addition de tampon de liaison ADN du kit pour chaque échantillon, placer le tube sur un aimant et attendre que des billes magnétiques globales, puis transférer le surnageant à la colonne de nettoyage. Suivez les instructions du fabricant et éluer dans 50 µL de tampon d’élution fourni dans le kit.
   2. Pour vérifier si l’IP est réussi, effectuez un qPCR. Idéalement, les amorces doivent être conçus pour les régions témoins positifs et négatifs.
      NOTE : par exemple, pour une adresse IP effectuée avec H3K4me3 et H3K27me3, les exemples suivants doivent être exécutés sur qPCR : H3K4me3, H3K27me3 et IgG puce ADN, entrée ADN et un aucun contrôle modèle (NTC) en utilisant des amorces pour les régions à s’enrichir avec H3K4me3 (contrôle positif) et régions à s’enrichir avec H3K4me3 (témoin négatif) ; de même, pour H3K27me3.
   3. Suivent des protocoles standards pour effectuer qPCR¹². En bref, effectuer un qPCR utilisant SYBR vert mix master, 0,5 µL de concentration de travail 10 µM de chaque amorce avant et arrière et 2 µL de puce ou de l’ADN d’entrée. Lire les plaques à l’aide d’un système de PCR en temps réel. Séquences d’amorces sont fournis dans le tableau 2. Les séquences d’amorces Gapdh de Hwang et al. ont été utilisé¹³.
   4. Analyser les données de la puce par rapport à l’entrée, c'est-à-dire, pour cent d’entrée méthode (IP %)¹⁴. Calculer le pourcentage d’entrée à l’aide des formules suivantes :
      Ajusté d’entrée = moyenne ct (entrée)-ouvrir une session₂(DF)
      où DF est le facteur de dilution de l’apport de départ et
      DF = volume total de la propriété intellectuelle / volume d’entrée
      % IP = 100 × 2 ^ (ajusté entrée - Ct (IP))
      où Ct est le facteur de seuil.

Résultats

Une représentation schématique de la tumeur NS généré à partir d’une tumeur au cerveau où les cellules de tumeur de cerveau sont Katushka positive est présentée dans la Figure 1. La figure 2 est une représentation schématique de la technique de la puce ensemble. La figure 3 montre les résultats représentatifs de la chromatine de tumeur au cerveau NS digéré avec MNase pendant 12 min, ...

Discussion

Le protocole présenté ici permettra à l’utilisateur d’effectuer puce native sur NS dérivées de tumeurs cérébrales génétiquement. Contrairement à la puce de réticulation, ce protocole est limité pour l’étude des protéines qui associent étroitement à ADN⁶. Le nombre de cellules utilisées peut être modifié selon les besoins et le protocole peut être entartré. Nous avons utilisé 1 X 10⁶ cellules / IP, cependant, puce natif peut-être être effectuée avec aussi p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W