Inmunoprecipitación de cromatina nativa usando neuroesferas del Tumor de cerebro murino

Resumen

Con frecuencia se alteran mecanismos epigenéticos en glioma. Inmunoprecipitación de cromatina podría utilizarse para estudiar las consecuencias de las alteraciones genéticas en gliomas que resultan de cambios en las modificaciones de las histonas que regulan la transcripción de la cromatina estructura y gene. Este protocolo describe inmunoprecipitación de cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.

Resumen

Las modificaciones epigenéticas pueden participar en el desarrollo y progresión de la glioma. Cambios en la metilación y acetilación de promotores y regiones reguladoras de oncogenes y supresores del tumor pueden conducir a cambios en la expresión génica y juega un papel importante en la patogenesia de los tumores cerebrales. Inmunoprecipitación de cromatina nativa (ChIP) es una técnica popular que permite la detección de modificaciones u otras proteínas estrechamente ligadas a ADN. En contraste con reticulado ChIP, chip nativo, las células no son tratadas con formaldehído a enlace covalente proteínas al ADN. Esto es ventajoso porque a veces reticulación puede fijar las proteínas que interactúan con el ADN sólo transitoriamente y no tienen significación funcional en la regulación génica. Además, los anticuerpos son criados generalmente contra péptidos no fijadas. Por lo tanto, especificidad de anticuerpo aumenta en viruta nativa. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ChIP nativo sólo es aplicable para el estudio de las histonas u otras proteínas que se unen firmemente a la DNA. Este protocolo describe la inmunoprecipitación de la cromatina nativa de neuroesferas de tumor de cerebro murino.

Introducción

Eventos epigenéticos en los gliomas son frecuentes y probablemente juegan un papel importante en la patogénesis del tumor. De hecho, en el glioma pediátrico de alto grado, las mutaciones en genes que codifican variantes de la histona H3.3 y H3.1 ocurren con frecuencia¹. Las mutaciones afectan a modificaciones de las histonas y tienen importantes consecuencias epigenéticas^2,3. En el adolescente a adulto espectro, mutaciones recurrentes en el gene de la deshidrogenasa de isocitrato (IDH1/2), 1/2 una mutación que inhibe la histona dependiente de α-KG y de-methylasaes de ADN y alteraciones genéticas en otros reguladores de la cromatina como ATRX y DAXX se producen ⁴. por tanto, es de vital importancia para el estudio de cómo las mutaciones que afectan los reguladores epigenéticos alteran la estructura de la cromatina y regulación histona modificaciones, que, a su vez, tienen un impacto dramático del transcriptoma de las células del tumor.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta utilizada para evaluar el impacto de las modificaciones epigenéticas en el genoma^5,6,7. En viruta nativa, cromatina se digiere con nucleasa micrococcal (MNase), immunoprecipitated utiliza un anticuerpo contra la proteína de interés, y luego es purificado DNA del complejo de la cromatina immunoprecipitated⁶. Las células no son fijos durante el procedimiento por lo que esta técnica sólo es aplicable para el estudio de proteínas que interaccionan fuertemente con el ADN⁶. La ausencia de cross-linking ayuda especificidad de anticuerpo puesto que generalmente se levantan anticuerpos contra péptidos o proteínas no fijadas⁷. Además, puesto que no hay ningún paso Cross-linking, esto reduce las posibilidades de fijación interacciones proteína transitoria-ADN que son no específicos y no normativo^7,8. ChIP se puede utilizar para identificar el enriquecimiento de modificaciones de las histonas en una región genómica específica. Aquí detallamos un protocolo para realizar ChIP nativo de neuroesferas (NS) generados a partir de genéticamente diseñados modelos de ratón de glioma.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Michigan.

1. generación de tumor cerebral NS y las condiciones de cultivo.

1. Preparar medio de células madre neurales (NSC) de Dulbecco modificado Eagle medio/F12B27 suplemento (1 x) suplemento de N2 (1 x) y un reactivo antimicrobiano. Suplemento medio de NSC en el día de uso con factor de crecimiento endotelial recombinante humano (EGF) y factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF) a una concentración final de 20 ng/mL de cada una.
2. Inducir el tumor de cerebro de ratón utilizando el sistema de transposon de la bella durmiente en el que se inyección plásmidos codifican oncogenes o shRNA dirigido a supresores de tumor en los ventrículos laterales de los recién nacidos para generar tumores de cerebro espontánea⁹. Seleccione un ratón con un tumor grande, que se confirma con la proyección de imagen de bioluminiscencia.
   Nota: Información más detallada sobre las construcciones sistema de Transposon belleza durmiente y plásmido utilizado puede encontrarse en Calinescu et al. ⁹.
   1. Para los ratones de la imagen, inyectar 100 μl de solución de luciferin de 30 mg/mL por vía intraperitoneal utilizando una aguja de 26 calibre.
   2. 5 minutos después de la inyección de luciferin, anestesiar al animal con una cámara de anestesia de flujo de oxígeno/isoflurano a 2% de isoflurano.
   3. Cuando los animales son anestesiados (generalmente 2-3 min), colocar los animales en la cámara de bioluminiscencia con isoflurano de oxígeno a 2% de isoflurano. Si los animales estará bajo anestesia durante más de 5 minutos, usar un ungüento oftálmico para prevenir sequedad mientras que bajo anestesia.
   4. Los ratones utilizando un en vivo sistema con los siguientes parámetros de imagen óptico de la imagen: exposición automática, gran binning y apertura f = 1. El parámetro a considerar un tumor grande es una bioluminiscencia > 10⁶ fotones/s/cm²/sr.
3. Eutanasia el ratón con una sobredosis de isoflurane anestésico inhalante en una cámara cerrada, verifique por pellizco del dedo del pie que el animal está anestesiado y decapitar el ratón.
4. Extraer el cerebro y analizar como se describe anteriormente en Calinescu et al. ⁹.
5. Colocar el cerebro en un plato de Petri de 10 cm. Si el tumor inducido expresa una proteína fluorescente, un fluorescente, microscopio de disección configurar el canal fluorescente y aumentos de 0.3, de lo contrario identificar masa tumoral por las diferencias en tejido color y textura. Usar bisturí y pinzas para separar el tejido del tumor en el cerebro normal.
6. Pique el tumor en pequeños pedazos en la caja Petri. Lugar del tumor disecado en un tubo de 1,5 mL con 300 μL de medio de NSC.
7. Utilizar un mortero de pellets de plástico desechable que se adapta a las paredes de un tubo de microcentrífuga cónica para homogenizar suavemente el tumor. Añadir 1 mL de medio de separación celular e incubar la muestra durante 5 min a 37 ° C.
   Nota: El uso de un mortero puede matar algunas células. Si el lector quiere maximizar la viabilidad de las células, el uso de un mortero puede omitirse.
8. Pasar la suspensión celular de paso 1.7 a través de un tamiz de célula μm 70 y lavar el filtro con 25 mL de medio de NSC.
9. Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 6 mL de medio de NSC.
10. Disponer la suspensión de células de tumor de paso 1.9 en un matraz de cultivo T-25 y cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% aire y 5% CO₂. Generalmente después de 3 días, habrá una mezcla de algunas células muertas, células adheridas y algunas células formando NS que flotan en el medio.
11. Transferir la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL, recoger sólo las células que se hunden hasta el fondo utilizando una micropipeta y re-de placa en un matraz de cultivo de tejidos T-75.
12. Mantener las células en relativamente de alta densidad (1-3 X 10⁶ células en un T-25). Paso de las células cuando son confluentes.
    Nota: Confluencia es determinado por el tamaño de las esferas. Negro centros de esferas grandes significa que son células muertas en el centro e indican que las células deben ser pasadas inmediatamente.
13. Añadir los factores de crecimiento (EGF y FGF de basic; 20 ng/mL cada una) cada tres días. Cambiar el medio cuando las células no son confluentes y la naranja de luz media vueltas.
14. Para cambiar el medio, recoger el viejo medio y centrifugar a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos y resuspender el pellet celular en medio de la NSC suplementado con EGF y FGF a la concentración indicada en el paso 1.1.
    Nota: Si las esferas son en mediados de-alta confluencia, pero no está listo para ser pasados (tamaño de la esfera es pequeño con un diámetro < 100 μm), luego el sedimento se puede dividir en dos matraces.
15. Para las células de paso, centrifugar las células a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente, decantar el sobrenadante e incubar las células en medio de la separación celular por 5 min a 37 ° C.
    1. Añadir 5 mL de solución de sal equilibrada al medio de diluir la separación y centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    2. Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 18 mL de medio de NSC, la suspensión se dividen igualmente en tres frascos de T-25.
16. Para congelar las alícuotas de células, disociar las células como en el paso 1.15 y congelar las células en alícuotas de 1 mL de suero bovino fetal del 90% con 10% de dimetilsulfóxido. Enfríe lentamente las células colocando las células en hielo durante 10 min, y luego mantener las células de-20 ° C por 30 min y -80 ° C por 1 día. Al día siguiente, transferir las células a un contenedor de almacenamiento de nitrógeno líquido.

2. nativo ChIP

1. Preparación de la cromatina
   1. Después de hacer el balance de derivados NS, NS en un T-75 en 15 mL de medio de NSC a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos con una atmósfera de 95% aire y 5% CO₂ la cultura hasta NS convertirse en confluente. Una placa de T-75 confluente producirá 3-5 X 10⁶ células.
   2. Cuando las células se vuelven confluentes, Centrifugue NS a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y agregar 1 mL de medio de disociación celular. Incubar las células a 37 ° C por 5 minutos agregar 5 mL de medio y contar las células utilizando un hemocitómetro¹⁰.
      Nota: se necesitan 1 x 10⁶ células por reacción de inmunoprecipitación (IP). Tenga en cuenta que un suero inmune previo o un control de IgG debe ser también incluye¹¹.
   3. Centrifugue el NS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet NS con 1 mL de solución de sal equilibrada y transferir la suspensión a tubos de microcentrífuga de baja proteína vinculante 1,5 mL.
   4. NS de centrifugar a 300 x g durante 5 min, decantar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 95 μl de tampón de digestión (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl₂, 0.2% polietilenglicol éter de Octylpheny) por 1 x 10⁶ células con proteasa inhibidor de cóctel en una alta concentración (1: 100). Inmediatamente pipetear las células arriba y abajo para evitar el agrupar y creando las burbujas.
   5. Suspender MNase en glicerol al 50% 1 mg/mL solución (1.15 unidades/μl, almacenado a-20 ° C) que se referirá como "1 x". Hacer un "0.1 x" stock haciendo una segunda dilución 1:9 con 50% de glicerol (e.g., 900 μl de "1 x" MNase y 100 μl de glicerol al 50%) y almacenar a-20 ° C.
   6. Mezcla 5 μl de "0.1 x" MNase y 145 μl de tampón de digestión. Mantenga la enzima en el hielo de todos los tiempos. Añadir 5 μl de MNase diluido en buffer de digestión por 1 x 10⁶ células. Flick el tubo para mezclar y colocar el tubo en el bloque de 37 ° C exactamente 12 minutos proceso las muestras de uno a la vez para asegurar un tiempo exacto de la incubación de 12 minutos.
   7. Añadir 10 μl de 10 x Buffer de parada de MNase (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, EDTA de 55 mM) por 1 x 10⁶ células. Las muestras deben mantenerse sobre hielo desde este punto hacia adelante.
   8. Agregar 110 μl "2 x RIPA buffer" (280 mM NaCl, 1,8% polietilenglicol éter de Octylpheny, 0.2% sodio dodecil sulfato (SDS), 0,2% desoxicolato de Na, 5 mM el glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA); almacenados a 4 ° C) complementado con inhibidor de la proteasa cóctel en alta concentración (1: 100) por 1 x 10⁶ células. Flick el tubo para mezclar.
   9. Centrifugar los tubos durante 15 minutos en una microcentrífuga a 4 ° C y 1700 x g. transferir el sobrenadante a un nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL regular (no son necesarios tubos de microcentrífuga de baja proteína vinculante) y guardarlos en hielo. Deseche los pellets.
2. Inmunoprecipitación (IP)
   1. Mezclar proteína y granos magnéticos G de proteínas en una proporción 1:1. Para cada IP, preparar 25 μl de granos.
   2. Lavar los granos mediante la adición de 1 mL de tampón RIPA (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% polietilenglicol éter de Octylpheny, 0.1% SDS, de 0.1% desoxicolato de Na; almacenados a 4 ° C) suplementado con los inhibidores de proteasa en baja concentración (1: 1000).
   3. Use un imán para permitir que los granos a separar de la solución de lavado y decantar la solución de lavado (aproximadamente 1 min). Realizar la etapa de lavado dos veces.
   4. Vuelva a suspender las cuentas en el volumen original usando almacenador intermediario RIPA suplementado con los inhibidores de proteasa (1: 1000).
   5. Si es necesario, diluir la cromatina usando almacenador intermediario RIPA suplementado con los inhibidores de proteasa (1: 1000) por lo que cada IP tiene un volumen de 100-200 μl. reserva 10% del volumen utilizado por IP de la cromatina en la entrada.
      Nota: por ejemplo, si se utilizan 200 μL por IP, 20 μl de la cromatina diluida debe ser reservado para la entrada. Para un total de cuatro IPs, volumen total de la cromatina debe diluirse a 820 μl.
   6. Preparar la entrada. Añada 100 μl de tampón de TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) complementado con proteinasa K (0.5 mg/mL) a la entrada e incubar la entrada a 55 ° C durante 1 hora.
      Nota: 2.2.6-2.2.7 de pasos se puede realizar con pasos 2.3.4 y 2.4.1.
   7. Purificar la entrada utilizando un kit de purificación PCR siguiendo las instrucciones del fabricante y eluir en 50 μl de tampón de elución provisto en el kit.
   8. Medir la concentración de la entrada utilizando un espectrofotómetro microvolume y anote los resultados en un cuaderno. En blanco con tampón de elución del kit.
      Nota: En ratón neuroesferas, utilizamos aproximadamente 6 μg de ADN para cada IP.
   9. Funcionar la entrada en un gel de 1% a carga 1 μL en un Bioanalizador de ADN utilizando la configuración estándar. Guarde el resto para su uso como insumo en aplicaciones posteriores.
   10. Añadir 10 μl de proteína lavada & granos magnéticos G para cada IP y IP incubar 1 h a 4 ° C.
       Nota: por ejemplo, Añadir 30 μl de proteína A y G de perlas magnéticas para tres IPs.
   11. Coloque las muestras en un imán y permite separar los granos. Dividir la cromatina mediante la transferencia de la cantidad previamente determinada en un nuevo tubo de 1,5 mL.
   12. Añadir el anticuerpo y envuelva las tapas con film de plástico de la parafina para evitar la evaporación. Incubar las muestras durante la noche a 4 ° C con rotación a 20 rpm.
       Nota: Concentración debe determinarse empíricamente, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
   13. Al día siguiente, girar los tubos utilizando una mini centrífuga a temperatura ambiente, 2000 x g, durante 10 s. Luego añadir 10 μl de granos a cada IP e incubar IP durante 3 h a 4 ° C con rotación a 20 rpm.
3. Lavados IP y digestión de proteínas
   1. Agregar 150 μL de tampón RIPA suplementado con los inhibidores de proteasa en baja concentración (1: 1000) a cada IP y IP de incubar a 4 ° C con rotación a 20 rpm por 5 min lugar la muestra en un soporte magnético y permitir que las bolas magnéticas separar. Utilice una pipeta para remover el sobrenadante. Repita este lavado cinco de tep.
   2. Agregar 150 μL de tampón de LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0.5% desoxicolato de Na, conservar a 4 ° C) suplementado con los inhibidores de proteasa en baja concentración (1: 1000) a cada IP y IP de incubar a 4 ° C con rotación a 20 rpm por 5 min lugar la muestra en un magnético soporte y permitir que los granos magnéticos separar. Utilice una pipeta para remover el sobrenadante.
   3. Añadir 150 μL de TE frío (no inhibidores de la proteasa) e incubar la muestra a 4 ° C con rotación a 20 rpm por 5 min lugar la muestra en un soporte magnético y dejar granos magnéticos separar. Utilice una pipeta para remover el sobrenadante.
   4. Después del paso del lavado final, vuelva a suspender la muestra en 100 μl de buffer TE complementado con proteinasa K (0.5 mg/mL) e incubar la muestra a 55 ° C durante 1 hora.
4. Purificación de DNA y PCR cuantitativa (qPCR) a ChIP en tiempo real
   1. Purificar immunoprecipitated ADN utilizando un kit de potabilización de la polimerización en cadena. Después de la adición de tampón de Unión DNA kit de cada muestra, coloque el tubo en un imán y espere hasta que los granos magnéticos agregados, entonces transfiera el sobrenadante a la columna de limpieza. Siga las instrucciones del fabricante y eluir en 50 μl de tampón de elución provisto en el kit.
   2. Para comprobar si la IP es exitosa, realizar una qPCR. Idealmente, imprimaciones deben estar diseñados para las regiones de control positivo y negativo.
      Nota: por ejemplo, para una IP realizada con H3K4me3 y H3K27me3, las muestras siguientes se deben ejecutar en qPCR: entrada H3K4me3, H3K27me3 y IgG ChIP de ADN, DNA y una sin plantilla control (NTC) usando las cartillas para las regiones a ser enriquecido con H3K4me3 (control positivo) y regiones a ser enriquecido con H3K4me3 (control negativo); Asimismo, para H3K27me3.
   3. Seguir protocolos estándar para qPCR¹². Brevemente, realizar una qPCR usando SYBR verde mix master, 0,5 μl de la concentración de trabajo de 10 μm de cada primer avance y retroceso y 2 μl del ChIP o del ADN de entrada. Leer las placas mediante un sistema de PCR en tiempo Real. Secuencias de la cartilla se proporcionan en la tabla 2. Las secuencias de la cartilla de Gapdh de Hwang et al. fueron usados¹³.
   4. Analizar datos de la viruta relativa a la entrada, es decir, % entrada método (% IP)¹⁴. Calcular el porcentaje de entrada usando las siguientes fórmulas:
      Ajustar la entrada = media ct (entrada)-sesión₂(DF)
      donde DF es el factor de dilución de la entrada inicial y
      DF = volumen total de la propiedad intelectual / volumen de entrada
      % IP = 100 × 2 ^ (ajustar entrada - Ct (IP))
      donde Ct es el factor del umbral.

Resultados

Una representación esquemática del tumor NS generados a partir de un tumor cerebral donde las células del tumor cerebral son Katushka positivo se presenta en la figura 1. Figura 2 es una representación esquemática de la técnica de ChIP toda. Figura 3 muestra los resultados representativos de la cromatina de tumor cerebral NS digerido con MNase de 12 min, dando una mayoría de mono, di y tri-nuc...

Discusión

El protocolo que presentamos le permitirá al usuario realizar ChIP nativo en NS derivado de tumores cerebrales mediante ingeniería genética. En contraste con cross-linking el ChIP, este protocolo es limitado para el estudio de las proteínas que se asocian estrechamente con ADN⁶. El número de células utilizadas puede modificarse según sea necesario y el protocolo puede ampliarse. Se utilizaron 1 X 10⁶ células por IP, sin embargo, ChIP nativo también se puede realizar con tan poc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, refrigerated	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	for magnetic bead washes
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A magnetic beads
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G magnetic beads
EGF	PeproTech	AF-100-15	prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fast SYBR Green Master Mix	Applied Biosystems	4385612	qPCR reagent
Fetal Bovine Serum	Gibco	10437028	for freezing cells
FGF	PeproTech	100-18b	Prepare 20 μg/mL stock in 0.1% BSA and aliquot.
Forceps	Fine Science Tools	11008-13	for dissection of tumor
Glycerol, MB Grade	EMD- Millipore	356352
H3K4me3	Abcam	Ab8580
H3K27me3	Millipore	07-449
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalation anesthetic
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optical imaging system
Hyqtase	HyClon	SV3003001	cell detachment media
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Low binding microtubes	Corning Costar	CLS3207	low protein binding microcentrifuge tube
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	each batch may differ; purchase sufficient amount for experiments and aliquot.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normal Rabbit IgG	Millipore	12-372
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-microbial agent, use at 0.1 mg/mL.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	aliquot and store at -20 °C.
Protinase K	Sigma-Aldrich	P2308	make 10 mg/mL stock in water; aliquot and store at -20 °C.
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104	DNA purification kit
Scalpel	Fine Science Tools	10007-16	for dissection of tumor
Sodium Chloride	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodium Dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP 151-500	polyethylene glycol octylphenyl ether
Standard Mini Centrifuge	Fisherbrand	12-006-901	standard mini centrifuge
SZX16 microscope	Olympus	SZX16	flourescent dissecting microscope
ViiA 7 Real-Time PCR System with Fast 96-Well Block	Applied Biosystems	4453535
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W