JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا مقايسة نفاذية الأوعية الدموية الدماغ ماوس استخدام الحقن داخل لتتبع الفلورسنت تليها التروية التي تنطبق على نماذج حيوانية من اختلال وظيفي في حاجز الدم في الدماغ. يتم استخدام أحد نصفي الدماغ لتقييم نفاذية كمياً، وأخرى للتتبع التصور/إيمونوستينينج. يستغرق الإجراء 5-6 ح للفئران 10.

Abstract

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو حاجز متخصصة الذي يحمي المكروية المخ من السموم ومسببات الأمراض في الدورة الدموية ويحافظ على التوازن في الدماغ. المواقع الرئيسية للجدار هي خلايا بطانية من الشعيرات الدموية الدماغ وظيفة الحاجز الذي ينتج من ضيق الوصلات بين الخلايا والناقلين افلوكس أعرب عن غشاء البلازما. وينظم هذه الدالة بيريسيتيس وأستروسيتيس التي تشكل معا وحدة neurovascular (NVU). العديد من الأمراض العصبية مثل السكتة الدماغية، مرض الزهايمر (AD)، أورام الدماغ ترتبط بوظيفة BBB البصر. ولذلك تقييم نفاذية BBB عاملاً حاسما في تقييم مدى خطورة الأمراض العصبية ونجاح استراتيجيات المعالجة المستخدمة.

نحن الحاضرين هنا بسيطة بعد فحص نفاذية قوية التي تم تطبيقها بنجاح على الماوس عدة نماذج على حد سواء، الوراثية والتجريبية. الأسلوب الكمي للغاية وموضوعية بالمقارنة مع تحليل fluorescence الراسم بالفحص المجهري الذي يتم تطبيقه عادة. في هذا الأسلوب، يتم حقن الفئران إينترابيريتونيلي مع مزيج تتبع الفلورسنت خاملة مائي متبوعاً أنيسثيتيزينج الفئران. يتم تنفيذ التروية القلبية للحيوانات قبل الحصاد المخ أو الكلي أو الأجهزة الأخرى. تجانس وفصل الأجهزة متبوعاً بقياس الأسفار من المادة طافية. الدم مستمدة من ثقب القلب قبل التروية يخدم غرض تطبيع إلى حجرة الأوعية الدموية. هو تطبيع fluorescence الأنسجة للأسفار المصل والوزن الرطب للحصول على كمية مؤشر نفاذية الراسم. لتأكيد إضافية، يمكن أن تستخدم contralateral هيمي-الدماغ الحفاظ على إيمونوهيستوتشيميستري لأغراض التتبع fluorescence التصور.

Introduction

حاجز الدم في الدماغ (BBB) يتألف من خلايا بطانية microvascular (ECs) يدعمه مرتبطة ارتباطاً وثيقا بيريسيتيس (أجهزة الكمبيوتر)، وانشيثيد في الصفيحة القاعدية، وأستروسيتيس (ACs) بتغليف الغشاء الطابق السفلي مع النهاية أقدامهم1 ،2. ECs تتفاعل مع العديد من أنواع الخلايا التي دعم وتنظيم وظيفة الحاجز، رابطة الدول الكاريبية وأجهزة الكمبيوتر، وفي المقام الأول، وأيضا الخلايا العصبية و microglia، كلها معا تشكل وحدة neurovascular (NVU). NVU حاسم بالنسبة لوظيفة BBB، مما يحد من نقل السموم المنقولة بالدم والمسببة للأمراض من الدخول إلى الدماغ. هذه الوظيفة هي نتيجة لضيق مفرق جزيئات مثل كلودين-5، أوككلودين، زونولا أوككلودينس-1، التي موجودة بين ECs وأيضا بسبب عمل الناقلين مثل فبروتين/سكري (ف-gp) efflux تلك الجزيئات التي تدخل البطانة بالعودة إلى سفينة التجويف1،،من23. ومع ذلك يسمح بي بي بي لنقل الجزيئات الأساسية مثل المواد الغذائية (السكر، والحديد، والأحماض الأمينية) من الناقلين محددة أعربت المفوضية الأوروبية أغشية البلازما1،2،3. الغاية هو الاستقطاب طبقة الجماعة الأوروبية فيما يتعلق بتوزيع ناقلات مختلفة بين لومينال (الدم-تواجه) وأبلومينال (أغشية الدماغ المواجه) للسماح نقل محددة واتجاهي الدالة4،5 . بينما BBB الحماية فيما يتعلق بأحكام تنظم الوسط الجهاز العصبي المركزي، تحديا رئيسيا لإيصال المخدرات الجهاز العصبي المركزي في أمراض مثل باركنسون مع BBB وظيفية. حتى في الأمراض العصبية مع بي بي بي خلل وظيفي، أنه لا يمكن افتراض أن زيادة إيصال المخدرات الدماغ لا سيما والخلل في الحاجز ويمكن أن تشمل الأضرار بأهداف محددة الناقل على سبيل المثال كما هو الحال في مرض الزهايمر (AD). في الإعلان، تعرف العديد من الناقلين بيتا اميلويد مثل LRP1، الغضب، فسباق الجائزة الكبرى لتكون dysregulated واستهداف متعهدي النقل هذه ومن ثم قد يكون من غير المجدي6،،من78. هو ضعف BBB في العديد من الأمراض العصبية مثل السكتة الدماغية، الإعلانية، والتهاب السحايا، التصلب المتعدد، وفي الدماغ الأورام9،،من1011. استعادة وظيفة الحاجز جزءا أساسيا من استراتيجية علاجية وهكذا يتم تقييمه الحرجة.

في هذا العمل، لقد قمنا بوصف موضوعي وبروتوكول الكمية لفحص النفاذية في القوارض ونحن تطبيقها بنجاح على عدة خطوط الماوس كلا المرض وراثيا والتجريبية نماذج10،12،13 ،14. ويستند الأسلوب حقنه داخل بسيطة لتتبع الفلورسنت يليه نضح الفئران لإزالة تتبع من حجرة الأوعية الدموية. المخ والأجهزة الأخرى هي نضح الوظيفة التي تم جمعها والنفاذيه بهدف تقييم ومؤشر نفاذية المطلق استناداً إلى قياسات الأسفار من الأنسجة هوموجيناتيس في قارئ لوحة. يتم تصحيح جميع الأسفار الخام القيم للخلفية باستخدام هوموجيناتيس الأنسجة أو المصل من الحيوانات الصورية التي لا تتلقى أي التتبع. وترد نورماليزيشنز وافرة لحجم المصل والمصل الأسفار ووزن الأنسجة، وهكذا تسفر عن مؤشر نفاذية المطلق وقابلة للمقارنة بين تجارب وأنواع الأنسجة. تيسيرا للمقارنة بين المجموعات، ويمكن تحويل قيم الفهرس نفاذية المطلق لنسب سهولة كما كان يؤديها قبل12. وفي الوقت نفسه، ويمكن الاستفادة العقول هيمي المخزنة والكلى للتصور الراسم بالأسفار مجهرية10. يمكن أن يكون الفحص المجهري fluorescence الكلاسيكية قيماً في الحصول على الفرق الإقليمية في نفاذية لو مرهقة بسبب اختيار ذاتي من أقسام النسيج والصور لتحليل شبه كمي. الخطوات التفصيلية التي ترد في البروتوكول، ويتم إضافة الملاحظات عند الاقتضاء. وهذا يوفر المعلومات اللازمة لأداء فحص النفاذية في فيفو بنجاح في الفئران التي يمكن تحجيمها إلى غيرها من الحيوانات الصغيرة. يمكن تطبيقها في التحليل لأنواع كثيرة من تتبع السماح للتهمة والحجم على أساس تقييم نفاذية بمزيج من تتبع مع الأطياف fluorescence متميزة.

Protocol

كل الحيوانات عولجت بأقصى قدر من العناية في التقليل من الألم أو عدم الراحة أثناء الإجراء. هذا الإجراء يتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان لمؤسستنا، ووافقت عليه اللجنة المحلية (ريجيرونجسبرايسيديوم دارمشتات، الموافقة على عدد كيه/1044).

ويرد في الشكل 1تخطيطي لخطوات العمل في فيفو مقايسة النفاذية في الفئران. ويرد أدناه تفاصيل كل خطوة.

1-التعامل مع الحيوان

  1. إعداد وإدارة تتبع والمسكنات
    1. إعداد أنابيب المسمى وقوالب للأنسجة التضمين على الأقل يوميا قبل فحص النفاذية. الحفاظ على ظروف معقمة في جميع أنحاء البروتوكول التي تعمل تحت غطاء الدخان نظيفة واستخدام أدوات تنظيف مع الإيثانول 80%. استخدام الذكور أو الإناث البرية من نوع (WT) أو أنجيوبويتين-2 (إنج-2) مكسب للدالة (صندوق القناص) CD1 الفئران في المجموعة العمرية البالغين ناضجة من 3-6 أشهر للبروتوكول الحالي. أداء الوراثي للفئران كما هو موضح مسبقاً من 10.
      ملاحظة: الكحول 80% لن تسفر عن الصكوك العقيمة ولكن سيتم تقليل تلوث العينات التي أعدت.
    2. تمييع جميع تتبع في برنامج تلفزيوني العقيمة في مخزونات 2 مم وتخزين مختبرين محمية من الضوء في-20 درجة مئوية.
    3. اختر تتبع مثل (ميثيل والرودامين) جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية و (fluorescein isothiocyanate) فيتك مع الأطياف المتميزة الإثارة/الانبعاثات والتي يسين يمكن حلها أدى إلى تدخل الحد الأدنى بين الأصباغ بالفحص المجهري الأسفار (استخدام جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية أو فيتك تصفية على التوالي)، وفلوروميتري في قارئ لوحة لفحص النفاذية.
      ملاحظة: جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية ديكستران 3 دينار كويتي وفيتك ديكستران 3 دينار كويتي المستخدمة في الدراسة كلا يسين يمكن حلها وبالتالي يمكن أيضا استخدامها للمناعي التحليل بعد انتهاء التثبيت مع الألدهيدات من أجل التحقيق في الخلافات الإقليمية.
    4. التعامل مع جميع الحيوانات بعناية فائقة وفقا للمبادئ التوجيهية الرعاية المؤسسية. حقن إينترابيريتونيلي كل الماوس مع 100 ميليلتر الراسم حل يمكن زيادة تصل إلى 200 ميليلتر عندما يقترن تتبع إضافية استخدام 100 ميليلتر من كل التتبع في10،1:1 ميكس13. حقن الحيوانات واحد على الأقل مع برنامج تلفزيوني وحدها بدلاً من تتبع بمثابة تحكم الشام للطرح الخلفية أوتوفلوريسسينسي.
    5. 5 دقيقة بعد حقن الراسم، تخدير الحيوان مع حقن الملكية الفكرية من الكيتامين و Xylazine (100 ملغ و 5-10 ملغ في 0.9% وزن المحلول الملحي في الجسم كجم على التوالي، 150 ميليلتر كوكتيل كل 25 جرام الماوس).
      ملاحظة: مرهم البيطرية لم يطبق على العينين أثناء الإجراء كما كانت الفترة بين تخدير الحيوان ونضح/تضحية قصيرة حيث لم يكن أي جفاف العينين لاحظ (10 دقائق).
  2. التروية الدموية جمع والقلب
    1. إعداد الحيوانات التروية القلبية 10 دقيقة بعد الإدارة مخدر. تحقق من عدم استجابة نشل مخلب بغية ضمان وصول الحيوان إلى طائرة جراحية التخدير.
    2. وضع الحيوانات على ظهورهم وتطبيق الإيثانول 80% على جلد منطقة البطن. باستخدام مقص صغير، فتح جدار البطن مع شق صغير (2 سم) تحت القفص الصدري فقط. فصل الكبد من الحجاب الحاجز وثم قطع ببطء من خلال الحجاب الحاجز فضح التجويف الجنبي 15.
    3. قص القفص الصدري على الصعيد الثنائي وإصلاح القص قص من أجل فضح البطين الأيسر. أدخل إبرة فراشة 21-مقياس متصل بنظام التروية تحوي في مؤخرة البطين الأيسر.
    4. ثقب الاذين الأيمن وبسرعة (داخل 10 s) جمع 200-300 ميليلتر من الدم في تجويف الصدر باستخدام تلميحات ماصة 1 مل (مع نهاية وقف إنتاج المواد الانشطارية) في أنابيب جمع المصل وتخزينها على الجليد.
      ملاحظة: هذا الإجراء التروية عدم البقاء على قيد الحياة.
    5. حالما يتم جمع الدم، التبديل على نظام التروية (10-12 دورة في الدقيقة، 5 مل/دقيقة) ونتخلل الحيوان لمدة 3 دقيقة مع (RT) حارة س 1 برنامج تلفزيوني (خالية من كاليفورنيا2 +/أيونات Mg2 + ).
      ملاحظة: برنامج تلفزيوني يتضمن Ca2 +/Mg2 + أيونات يمكن أن تستخدم لأفضل قلب النشاط خلال نضح. المبلغ الإجمالي لبرنامج تلفزيوني تستخدم لنضح في حدود 15-20 مل.
    6. تقييم جودة التروية بالإشارة إلى لون الكبد، والكليتين، التي تظهر الأبيض/بالي بعد التروية.
      ملاحظة: الكلي أو الكبد التروية لا تشير بالضرورة إلى نضح الدماغ كالشرايين (السباتي/العمود الفقري) التوصل إلى الدماغ من الشريان الاورطي قد تحصل على تمزق أثناء الإعداد في الخطوة 3 خاصة خلال ثقب أذينية.

2-الأنسجة المعالجة

  1. جهاز جمع وتخزين
    1. في نهاية نضح، تأكيد وفاة الحيوان بالتفسخ عنق الرحم والحصاد الدماغ والكليتين. التحقق من نضح الدماغ بلون العقول (لا الدم مرئياً في سفن السحايا)، بغية استبعاد الحيوانات من تحليل النفاذية عند نضح الجودة ليست جيدة. فصل المخ إلى هيميبرينس 2 استخدام مشرط (الشكل 1).
    2. تشريح مع هيميبرين واحد مشرط خالية من الفصوص شمي والمخيخ ونقل هيميسيريبروم إلى أنبوب 2 مل. تخزين هيمي-المخيخ في أنبوب إضافية إذا لزم الأمر لتقييم نفاذية الدماغ.
    3. نقل الكلي واحد إلى آخر 2 مل الأنبوبة. تخزين العينات فورا على الثلج الجاف.
    4. تضمين أصلاً الكلي والدماغ هيمي (تتألف من المخيخ والفصوص شمي) المتبقية في الحرارة الأمثل قطع الأنسجة-تك (O.C.T) مركب على الثلج الجاف.
    5. وفي النهاية، الطرد المركزي عينات دم مخزنة على الجليد في أنابيب جمع المصل في 10، 000 ز، 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل supernatants المصل لأنابيب 1.5 مل ووضعها في حاوية الثلج الجاف.
    6. نقل جميع العينات التي تم جمعها في الثلج الجاف للثلاجة-80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
      ملاحظة: من المهم لتجميد العينات قبل الشروع في خطوات تحقيق التجانس كما يزيد من كفاءة التجانس بعد تجميد ذوبان الجليد.
  2. تجانس والطرد المركزي
    1. ذوبان الجليد على الجليد العينات نصفي المخ والكلى المجمدة إلى أسفل في-80 درجة مئوية، وتزن هذه الأنابيب التي تحتوي على الأجهزة. من هذه الأوزان، طرح متوسط قيمة عدة أنابيب فارغة (حوالي 20) للحصول على وزن الأنسجة. إضافة ميليلتر 300 و 200 ميليلتر من البرد 1 X برنامج تلفزيوني للأنابيب التي تحتوي على الكلي وهيمي-المخ، على التوالي.
      ملاحظة: للحصول على كميات أقل من الأنسجة (مثل هيمي-المخيخ، أدناه 100 مغ) يوصي بوزنها أنابيب فردية.
    2. مجانسة كل عينة في أنابيب ايبندورف الأصلي مع مدقة تترافلوروايثيلين (PTFE) إرفاقه محرض علوية كهربائية (1، 000 دورة في الدقيقة) قبل تنفيذ ضربات حوالي 15 (السكتة الدماغية 1 = 1 أعلى وأسفل 1). شطف المدقة مع برنامج تلفزيوني بين العينات والقضاء على الجفاف قبل الانتقال إلى النموذج التالي.
      ملاحظة: تجنب استخدام المنظفات خلال التجانس سبب التدخل المحتملة مع فلوروميتري. ومع ذلك، الراسم داخل الخلايا أيضا الكشف عن في هذا البروتوكول كما هو دقة تجانس الأنسجة، وأكثر فعالية بعد جولة واحدة من تجميد ذوبان الجليد.
    3. تخزين العينات المتجانس على الجليد محمية من الضوء وكلنا معا في نهاية المطاف في 15,000 ز، 20 دقيقة، 4 درجة مئوية في أجهزة الطرد مركزي منضدية للطرد المركزي. نقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب 1.5 مل جديدة على الجليد فلوروميتري فورا أو في-80 درجة مئوية يتم تحليلها في وقت لاحق.
  3. الأسفار القياس والتقدير الكمي
    1. إذا جمدت في نهاية الخطوة السابقة، ذوبان الجليد على الجليد عينات الأنسجة المادة طافية ومصل الدم المخزنة في-80 ˚C حماية لهم من الضوء مع إحباط.
    2. "الماصة؛" 50 ميليلتر من المصل المخفف (PBS 1 x ميليلتر 30 + 20 ميليلتر المصل) أو الأنسجة سوبيرناتانتس (كما هو) في لوحة سوداء 384-جيدا. تشمل عينة واحدة على الأقل من الحيوان الشام سوبيرناتانتس مصل الدم والأنسجة التأكد من الطرح الخلفية المناسبة، كما عادة أعلى من برنامج تلفزيوني يستخدم كمخفف هذه الخلفية هوموجيناتي الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن استخدام متوسط 3 الشام الحيوانات أوتوفلوريسسينسي على الرغم من أن لوحظ تقلب قليلاً جداً في الشام أوتوفلوريسسينسي القيم (البيانات لا تظهر). يمكن تخفيض كمية المصل المستخدمة باذابته مع برنامج تلفزيوني، التي يمكن أن تزيد أيضا إشارة إلى نسبة الضوضاء للعينات مع الأسفار منخفضة مثل عينات المخ. تم اختبار المصل تصل 10 ميليلتر إذابته مع 40 ميكروليتر PBS. تأكد من أن لا فقاعات موجودة في الآبار.
    3. إدراج لوحة سوداء 384-جيدا للقارئ لوحة وفتح نصي جديد تحديد قياس الأسفار.
    4. مجموعة الكسب للأمثل واستخدام قيم الإثارة/الانبعاثات (nm) 550/580 أو 490/520 لدى جمهورية ترانسنيستريا المولدوفية أو فيتك على التوالي والبدء القياس الحصول على وحدات الفلورية الخام (رفوس).
    5. تستخدم وحدات الفلورية الخام (رفوس) من قارئ لوحة لحساب مؤشر النفاذية (PI) بعد طرح القيم المناظرة في الشام.
      1. * فهرس النفاذية (مل/g) = (وزن الأنسجة الأنسجة رفوس/ز)/(المصل المصل رفوس مليلتر)
    6. مثال على حساب الدماغ نفاذية الفهرس (PI) الحيوان GOF1 (الجدول 1):
      1. GOF1 الدماغ رفوس-رفوس الدماغ الشام = 154-22.5 = 131.5
      2. GOF1 المصل رفوس-شام المصل رفوس = 38305-27 = 38278
      3. الوزن (ز) الدماغ = 0.195
      4. حجم المصل (مل) = 0.02
      5. الدماغ نفاذية الفهرس (10-3 مل/ز) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
        ملاحظة: العمليات الحسابية مؤشر نفاذية تسفر عن القيم المطلقة وقابلة للمقارنة بين تجارب وأنواع الأنسجة. لكن هذه يمكن أن تعرض كنسب تيسيرا للمقارنة بين المجموعات 2 12. يمكن تحقيق ذلك بتقسيم PI كل حيوان في كلتا المجموعتين مع بي يعني من مجموعة السيطرة على القيادة يعني مجموعة عنصر التحكم عن طريق 1 بعد حفظ الاختلاف بين الحيوان في السيطرة على المجموعة. ويوفر هذا التحول القيم للمجموعة التجريبية (أو مجموعات) مقارنة بمجموعة التحكم تعيين إلى 1.
  4. التصور الفلورة للتتبع
    1. قص القطع الكلي/هيمي-الدماغ مدمجة أصلاً في الأنسجة-تك مجمع (O.C.T) (الخطوة 2، 1) ميكرومتر 10 أقسام على كريوستات تعيين إلى-20 درجة مئوية، ونقل المقاطع إلى شرائح توضع في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة هي الأجزاء المجففة (حوالي 30 دقيقة)، نقل الشرائح إلى برادات-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    2. اليوم من تلطيخ، ذوبان الجليد الشرائح في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ومن ثم إصلاحها المقاطع مع 4% بارافورمالاديهيدي (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة التي تليها الغسيل السريع في برنامج تلفزيوني.
    3. احتضان المقاطع في بيرميبيليزيشن/حظر العازلة المصنوعة من PBS العقيمة التي تحتوي على جيش صرب البوسنة 1% و 0.5% X-100 تريتون درجة الحموضة 7.5 ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    4. احتضان شرائح 1.5 ح في درجة حرارة الغرفة مع جسم CD31 الأساسي (0.5 ملغ/مل، استنساخ MEC 13.3)، تضعف في 1: 100 في المخزن المؤقت الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني العقيمة، 0.5% جيش صرب البوسنة، 0.25% Triton X-100 (الرقم الهيدروجيني 7.2) تليها ثلاثة يغسل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    5. أداء الحضانة جسم الثانوية في المخزن المؤقت أعلاه على ح 1 في درجة حرارة الغرفة مع إبلاغها المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة المخفف 1: 500 (2 مغ/مل). ل CD31، يمكن استخدام الماعز لمكافحة الفئران 568 أليكسا أو 488 أليكسا في إضعاف 1: 500. وتشمل DAPI (300 ميكرون) في جسم الثانوي خلط (1:1، 000 التخفيف من المخزون) وصمة عار للنواة.
    6. جبل المقاطع الملون مع أكوا بوليماونت وتترك بين عشية وضحاها البلمرة عند درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    7. الحصول على الصور باستخدام ليزر [كنفوكل] تصوير طيفي نظام مجهر مسح. تحليل الصور بشيكل عناصر البرمجيات (الإصدار 4، 3). يمكن استخدام برامج مثل فوتوشوب لتوليد الأرقام المونتاج.

النتائج

ونحن مؤخرا تبين أن الفئران (صندوق القناص) مكسب للدالة (إنج-2) أنجيوبويتين-2 يكون أعلى نفاذية الأوعية الدموية الدماغ من الفئران التحكم في ظروف صحية10. في الفئران المستحثة بالسكتة الدماغية، كما أنها تبين أن الفئران صندوق القناص أكبر احتشاء الأحجام والنفاذيه أكب?...

Discussion

حاجز الدم في الدماغ خلل يرتبط بعدد من الاضطرابات العصبية، بما في ذلك أورام الدماغ الأولية والثانوية أو السكتة الدماغية. وكثيراً ما يرتبط تصنيف BBB بذمة CNS مهددة للحياة. توضيح الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فتح أو إغلاق BBB هو ولذلك من الأهمية العلاجية في الاضطرابات العصبية، وعادة بالتحقيق في...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

الكتاب تود أن تقر كونسورتيوم سفينجونيت الممول من مؤسسة ليدوق لدعم هذا العمل. كما أيد هذا العمل مركز البحوث التعاونية "التمايز الأوعية الدموية وإعادة عرض" (CRC/Transregio23، ومشروع C1) وقبل 7. وتنظيم الأسرة، كوفوند، وغوته الدولي Postdoc برنامج الذهاب في، 291776 رقم التمويل. ونعترف كذلك سومر كاثلين لها المساعدة التقنية مع الفئران المناولة والتنميط.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kDThermosfisherD3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kDThermosfisherD3306
Ketamine (Ketavet)Zoetis
Xylazine (Rompun)Bayer
0.9% SalineFresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBSGibco10010-015
Tissue-tek O.C.T compoundSakura Finetek4583
37% Formaldhehyde solutionSigma252549-1Lprepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction VRoth8076.3
Triton X-100SigmaT8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3BD Pharmingen553370
goat anti rat alexa 568Molecular ProbesA-11077
goat anti rat alexa 488Molecular ProbesA-11006
DAPIMolecular ProbesD1306
Aqua polymountPolyscience Inc18606
21-gauge butterfly needleBD387455
serum collection tubeSarstedt41.1500.005
2mL eppendorf tubesSarstedt72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipersKimberley-Clark Professional05511
384-well black plateGreiner781086
slides superfrost plusThermoscientificJ1800AMNZ
PTFE pestleWheaton358029
electric overhead stirrerVWRVWR VOS 14
plate readerTecanInfinite M200
CryostatMicrom GmbHHM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope SystemNikon
peristaltic perfusion systemBVK Ismatec
microcentrifugeeppendorf5415R

References

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier. Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).
  3. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nature Medicine. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  4. Devraj, K., Klinger, M. E., Myers, R. L., Mokashi, A., Hawkins, R. A., Simpson, I. A. GLUT-1 glucose transporters in the blood-brain barrier: differential phosphorylation. Journal of neuroscience research. 89 (12), 1913-1925 (2011).
  5. Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature reviews. Drug discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
  6. Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nature reviews. Neuroscience. 12 (12), 723-738 (2011).
  7. Paganetti, P., Antoniello, K., et al. Increased efflux of amyloid-β peptides through the blood-brain barrier by muscarinic acetylcholine receptor inhibition reduces pathological phenotypes in mouse models of brain amyloidosis. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 38 (4), 767-786 (2014).
  8. Devraj, K., Poznanovic, S., et al. BACE-1 is expressed in the blood-brain barrier endothelium and is upregulated in a murine model of Alzheimer's disease. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (7), 1281-1294 (2016).
  9. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  10. Gurnik, S., Devraj, K., et al. Angiopoietin-2-induced blood-brain barrier compromise and increased stroke size are rescued by VE-PTP-dependent restoration of Tie2 signaling. Acta neuropathologica. 131 (5), 753-773 (2016).
  11. Scholz, A., Harter, P. N., et al. Endothelial cell-derived angiopoietin-2 is a therapeutic target in treatment-naive and bevacizumab-resistant glioblastoma. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 39-57 (2016).
  12. Gross, S., Devraj, K., Feng, Y., Macas, J., Liebner, S., Wieland, T. Nucleoside diphosphate kinase B regulates angiogenic responses in the endothelium via caveolae formation and c-Src-mediated caveolin-1 phosphorylation. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (7), 2471-2484 (2017).
  13. Ziegler, N., Awwad, K., et al. β-Catenin Is Required for Endothelial Cyp1b1 Regulation Influencing Metabolic Barrier Function. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 36 (34), 8921-8935 (2016).
  14. Vutukuri, R., Brunkhorst, R., et al. Alteration of sphingolipid metabolism as a putative mechanism underlying LPS-induced BBB disruption. Journal of Neurochemistry. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  16. Hoffmann, A., Bredno, J., Wendland, M., Derugin, N., Ohara, P., Wintermark, M. High and Low Molecular Weight Fluorescein Isothiocyanate (FITC)-Dextrans to Assess Blood-Brain Barrier Disruption: Technical Considerations. Translational stroke research. 2 (1), 106-111 (2011).
  17. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  18. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  19. Bell, R. D., Winkler, E. A., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  20. Banks, W. A., Gray, A. M., et al. Lipopolysaccharide-induced blood-brain barrier disruption: roles of cyclooxygenase, oxidative stress, neuroinflammation, and elements of the neurovascular unit. Journal of Neuroinflammation. 12, 223 (2015).
  21. Krause, G., Winkler, L., Mueller, S. L., Haseloff, R. F., Piontek, J., Blasig, I. E. Structure and function of claudins. Biochimica et biophysica acta. 1778 (3), 631-645 (2008).
  22. Johansson, B. B. Blood-Brain Barrier: Role of Brain Endothelial Surface Charge and Glycocalyx. Ischemic Blood Flow in the Brain. , 33-38 (2001).
  23. Fu, B. M., Li, G., Yuan, W. Charge effects of the blood-brain barrier on the transport of charged molecules. The FASEB Journal. 22 (1 Supplement), (2008).
  24. Goebl, N. A., Babbey, C. M., Datta-Mannan, A., Witcher, D. R., Wroblewski, V. J., Dunn, K. W. Neonatal Fc receptor mediates internalization of Fc in transfected human endothelial cells. Molecular biology of the cell. 19 (12), 5490-5505 (2008).
  25. Lopez-Quintero, S. V., Ji, X. -. Y., Antonetti, D. A., Tarbell, J. M. A three-pore model describes transport properties of bovine retinal endothelial cells in normal and elevated glucose. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (2), 1171-1180 (2011).
  26. Hallmann, R., Mayer, D. N., Berg, E. L., Broermann, R., Butcher, E. C. Novel mouse endothelial cell surface marker is suppressed during differentiation of the blood brain barrier. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 202 (4), 325-332 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved