Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Zusammenfassung

Blut - Hirn-Schranke (BBB) ist eine spezialisierte Barriere, die das Gehirn Mikroumgebung von Giftstoffen und Krankheitserregern in der Zirkulation schützt und pflegt Gehirn Homöostase. Die wichtigsten Sehenswürdigkeiten der Barriere sind Endothelzellen der Gehirn-Kapillaren ergibt sich deren Barrierefunktion aus enge interzelluläre Verbindungen und Efflux-Transporter über die Plasmamembran zum Ausdruck gebracht. Diese Funktion wird durch Perizyten und Astrozyten, die zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden) geregelt. Verschiedene neurologische Erkrankungen wie Schlaganfall, Alzheimer-Krankheit (AD), Hirntumoren eine Beeinträchtigung der BBB Funktion zugeordnet sind. Bewertung der BBB Permeabilität ist daher entscheidend bei der Bewertung der Schwere der neurologischen Erkrankung und den Erfolg der Behandlungsstrategien eingesetzt.

Wir präsentieren hier eine einfache, aber robuste Durchlässigkeit Assay, die auf mehrere Maus erfolgreich angewendet wurden sowohl genetische als auch experimentelle Modelle. Die Methode ist höchst quantitative und Objektive im Vergleich zu den Tracer Fluoreszenzanalyse Mikroskopie, die häufig angewendet wird. Bei dieser Methode werden Mäusen intraperitoneal mit einer Mischung aus wässrigen inert Fluoreszenz Tracer gefolgt von betäuben die Mäuse injiziert. Kardiale Perfusion der Tiere erfolgt vor der Ernte, Gehirn, Nieren oder anderen Organen. Organe sind homogenisiert und zentrifugiert, gefolgt von Fluoreszenzmessung von überstand. Blut aus der Herzpunktion kurz vor Perfusion dient zur Normalisierung soll das vaskuläre Fach. Die Gewebe-Fluoreszenz ist normiert auf die nassen Gewicht und Serum Fluoreszenz zu einer quantitativen Tracer Durchlässigkeit Index. Für zusätzliche Bestätigung sowohl der kontralateralen Hemi-Hirn für Immunohistochemistry bewahrt Tracer Fluoreszenz Visualisierung Zwecke einsetzbar.

Einleitung

Die Blut - Hirn-Schranke (BBB) besteht aus der mikrovaskulären Endothelzellen (ECs) unterstützt durch eng Perizyten (PCs), sind Ensheathed in der Basallamina und Astrozyten (ACs), die die Basalmembran mit den End-Füßen^{1 umhüllen ,2}. ECs mit mehreren Zelltypen, die unterstützen und regulieren die Barrierefunktion, in erster Linie ACs und PCs interagieren und auch Neuronen und Mikroglia, alle zusammen die neurovaskuläre Einheit (NVU bilden). Die NVU ist entscheidend für die Funktion der BBB, was den Transport von Blut übertragene Giftstoffe und Erreger in das Gehirn gelangen begrenzt. Diese Funktion ist ein Ergebnis der engen Kreuzung Moleküle wie occludin, Claudin-5, Zonula Occludens-1, die zwischen ECs und auch durch die Einwirkung von Transportern wie p-Glykoprotein (P-Gp), dass Fluth Moleküle, die das Endothel geben Sie wieder anwesend sind das Gefäß Lumen^1,2,3. Die BBB kann jedoch für den Transport von wesentlichen Moleküle wie Nährstoffe (Glukose, Aminosäuren, Eisen) durch spezifische Transporter zum Ausdruck auf den EC Plasmamembranen^1,2,3. Die EG-Ebene ist in Bezug auf die Verteilung der verschiedenen Transporter zwischen der luminalen (Blut-Einfassung) und abluminalen (Gehirn gerichteten Membranen), um die spezifischen und vektorielle Transport Funktion^{4,5 ermöglichen stark polarisiert.} . Während die BBB Schutzmaßnahmen in Bezug auf die streng regulieren das CNS-Milieu ist, ist es eine große Herausforderung für CNS Drug-Delivery bei Erkrankungen wie Parkinson mit einem funktionalen BBB. Auch bei neurologischen Erkrankungen mit BBB-Dysfunktion kann nicht davon auszugehen, dass die Gehirn-Drug-Delivery erhöht wird, zumal die Barriere Dysfunktion Schaden an den spezifischen Transporter Zielen wie zum Beispiel bei Alzheimer-Krankheit (AD) beinhalten könnte. N. Chr. mehrere Amyloid Beta-Transporter wie LRP1, RAGE, P-Gp sind bekanntermaßen Dysregulated und somit gezielt diese Transporter möglicherweise vergeblich^6,7,8. Die BBB ist in verschiedenen neurologischen Erkrankungen wie Schlaganfall, AD, Meningitis, Multiple Sklerose, und im Gehirn Tumoren^9,10,11beeinträchtigt. Die Wiederherstellung der Barrierefunktion ist ein wesentlicher Bestandteil der therapeutischen Strategie und damit ihre Beurteilung ist entscheidend.

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, einen objektiven und quantitativen Protokoll für Durchlässigkeit Assay bei Nagetieren, dass wir erfolgreich, mehrere Mauslinien beide transgene und experimentelle Krankheit Modelle^{10,12,13 angewendet ,14}. Die Methode basiert auf einer einfachen intraperitoneale Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion der Mäuse, die Tracer aus dem vaskulären Fach zu entfernen. Gehirn und andere Organe sind gesammelte Post Perfusion und Durchlässigkeit anhand objektiver und absolute Permeabilität Index anhand der Fluoreszenz-Messungen der Gewebe Homogenates in einem Teller-Reader. Alle rohen Fluoreszenz-Werte werden korrigiert, für den Hintergrund mit Gewebe Homogenates oder Serum von Schein-Tiere, die keiner Tracer erhalten. Reichliche Normierungen sind bei Serum, Serum Fluoreszenz, und das Gewicht des Gewebes, so nachgiebig Durchlässigkeit Index, absoluter und vergleichbare zwischen Experimenten und Gewebetypen ist, im Preis inbegriffen. Für Vergleich zwischen Gruppen zu erleichtern können die absolute Permeabilität Indexwerte leicht Verhältnisse umgewandelt werden, wie wir zuvor¹²durchgeführt hatte. Gleichzeitig könnten gespeicherte Hemi-Gehirn und Niere für die Tracer Visualisierung durch Fluoreszenz-Mikroskopie¹⁰genutzt werden. Die klassischen Fluoreszenzmikroskopie kann wichtige regionale Unterschied in der Durchlässigkeit zu erhalten, wenn auch umständlich durch subjektive Auswahl von Gewebeschnitten und Bilder für eine semi-quantitative Analyse bilden. Die einzelnen Schritte werden im Protokoll vorgestellt und Noten werden bei Bedarf hinzugefügt. Dies bietet die notwendige Informationen für die Durchführung von in Vivo Durchlässigkeit Assay erfolgreich bei Mäusen, die auf andere Kleintiere skaliert werden können. Der Test kann auf viele Arten von Tracern angewendet werden ermöglicht die Ladung und die Größe Durchlässigkeit Bewertung durch eine Kombination von Tracern mit unterschiedlichen Fluoreszenz Spektren gestützt.

Protokoll

Alle Tiere wurden mit größter Sorgfalt, die Minimierung von Schmerzen oder Beschwerden während des Verfahrens behandelt. Dieses Verfahren folgt den Richtlinien der Tierbetreuung unserer Institution und die Lokalkomitees (Regierungspräsidium Darmstadt, Zulassungsnummer FK/1044) genehmigt wurde.

Abbildung 1zeigt eine schematische Darstellung der Arbeitsschritte für in Vivo Durchlässigkeit Assay bei Mäusen. Die Details der einzelnen Schritte werden im folgenden beschrieben.

1. Umgang mit Tier

1. Erstellung und Verwaltung von Tracer und Anästhetika
   1. Gewebe einbetten mindestens einen Tag vor der Durchlässigkeit Assay bereiten Sie beschrifteten Rohre und Formen vor. Pflegen Sie sterile Bedingungen im gesamten Protokoll durch die Arbeit unter sauberen Abzug und Werkzeugen mit 80 % igem Ethanol gereinigt. Verwenden Sie männlich oder weiblich-Wildtyp (WT) oder Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) CD1 Mäuse in der reife Erwachsene Altersgruppe von 3 bis 6 Monaten für das aktuelle Protokoll. Durchführen Sie Genotypisierung der Mäuse bereits ¹⁰beschrieben.
      Hinweis: 80 % Alkohol führt nicht sterilen Instrumenten aber minimiert Kontamination der Proben vorbereitet.
   2. Verdünnen Sie der Tracer in sterilen PBS in 2 mM Aktien zu und speichern Sie die Aliquote lichtgeschützt bei-20 ° C.
   3. Tracer wie (Tetramethyl Rhodamin) TMR und wählen (Fluorescein erfolgt) FITC mit unterschiedlichen Anregung/Emissionsspektren und das Lysin feststellbar, wodurch minimale Interferenzen zwischen der Farbstoffe durch Fluoreszenz-Mikroskopie (mit der TMR oder FITC filter bzw.) und von Fluorometry in einem Teller-Reader für die Durchlässigkeit Assay.
      Hinweis: TMR Dextran 3 kD FITC-Dextran 3 kD in der Studie verwendeten beide Lysin fixierbar und sind daher auch genutzt werden für immunhistochemische Analyse nach Fixierung mit Aldehyden um regionale Unterschiede zu untersuchen.
   4. Behandeln Sie alle Tiere mit größter Sorgfalt nach den Richtlinien der institutionelle Pflege. Injizieren Sie intraperitoneal jede Maus mit 100 µL Tracer-Lösung, die bis zu 200 µL erhöht werden kann, wenn eine zusätzliche Tracer kombiniert wird mit 100 µL jeder Tracer in 1:1 Mischung^10,13. Mindestens ein Tier mit PBS anstelle der Tracer als Schein-Steuerung für Autofluoreszenz Hintergrundabzug dienen allein zu injizieren.
   5. 5 min nach der Injektion des Tracers betäuben das Tier mit einer IP-Injektion von Ketamin und Xylazin (100 mg und 5 – 10 mg in 0,9 % Kochsalzlösung pro kg Körpergewicht Gewicht bzw. 150 µL des Cocktails pro 25 g-Maus).
      Hinweis: Vet Salbe wurde nicht angewendet auf Augen während des Verfahrens als der Zeitraum zwischen tierischen Anästhesie und Perfusion/Opfer kurz war (10 Minuten) wo Trocknung der Augen war nicht zu beobachten.
2. Sammlung und Herz-Kreislauf Durchblutung
   1. Bereiten Sie die Tiere für kardiale Perfusion 10 min nach der Narkose Verabreichung. Keine Pfote zucken Antwort zu überprüfen, um sicherzustellen, dass das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht.
   2. Die Tiere auf den Rücken legen und 80 % igem Ethanol auf die Haut der Bauchbereich auftragen. Mit einer kleinen Schere, eröffnen Sie die Bauchdecke mit einem kleinen Schnitt (2 cm) unterhalb des Brustkorbs. Trennen Sie Leber von der Membran zu und schneiden Sie dann langsam durch das Diaphragma hindurch Freilegung der pleural Raum ¹⁵.
   3. Schneiden Sie den Brustkorb bilateral und beheben Sie geschnittenen Brustbein zu, um die linke Herzkammer freizulegen. Nadel 21-Gauge Schmetterling verbunden zu einem peristaltischen Perfusion System in den hinteren des linken Ventrikels.
   4. Punktion der rechten Vorhof und schnell (innerhalb von 10 s) 200-300 µL Blut in die Brusthöhle mit 1 mL Pipettenspitzen (mit Ende Cut-off) veröffentlicht im Serum Röhrchen sammeln und speichern es auf dem Eis.
      Hinweis: Dieses Verfahren Perfusion ist nicht überleben.
   5. Sobald das Blut gesammelt wird, schalten Sie die Perfusion System (10-12 u/min, 5 mL/min) und durchspülen der Tier 3 min mit warmen (RT) 1 X PBS (frei von Ca^{2 + /}Mg^{2 +} -Ionen).
      Hinweis:^{PBS mit Ca 2 +}/Mg^{2 +} -Ionen können für bessere Herztätigkeit während der Perfusion genutzt werden. Der Gesamtbetrag der PBS zur Perfusion liegt im Bereich von 15-20 mL.
   6. Perfusion Qualität zu bewerten, mit der Feststellung, der Farbe der Leber, Nieren, die nach Perfusion weiß/blass erscheinen.
      Hinweis: Niere oder Leber Perfusion nicht notwendigerweise Brain Perfusion als die Arterien (a. carotis/Wirbelkörper) zu erreichen, die das Gehirn von Aorta während der Vorbereitung in Schritt 3 vor allem während der atrialen Punktion gerissen bekommen könnte.

(2) Gewebe Verarbeitung

1. Orgel-Datenerhebung und-Speicherung
   1. Bestätigen Sie am Ende der Durchblutung Tod des Tieres durch zervikale Dislokation und Ernte Gehirn und Nieren. Überprüfen Sie Gehirn Durchblutung durch die Farbe des Gehirns (ohne sichtbare Blut in Blutgefäßen der Hirnhäute), um die Tiere von der Durchlässigkeit Analyse auszuschließen, wenn Perfusion Qualität nicht gut ist. Trennen Sie das Gehirn in 2 Hemibrains mit einem Skalpell (Abbildung 1).
   2. Mit einem Skalpell ein Hemibrain frei von olfaktorischen Lappen und Kleinhirn zu sezieren Sie und übertragen Sie der Hemicerebrum auf einen 2-mL-Tube. Speichern Sie Hemi-Kleinhirn in eine Hilfsrohr, ggf. für zerebelläre Durchlässigkeit Bewertung.
   3. Übertragen Sie eine einzelne Niere auf ein weiteres 2-mL-Tube. Speichern Sie die Proben sofort auf Trockeneis.
   4. Betten Sie die verbleibende Niere und Hemi-Gehirn (bestehend aus dem Kleinhirn und olfaktorischen Lappen) in Tissue-Tek optimale Arbeitstemperatur (O.C.T) Verbindung auf Trockeneis nativ.
   5. Zentrifugieren Sie schlussendlich die Blutproben auf Eis im Serum Röhrchen bei 10 000 g, 10 min bei 4 ° c gelagert Übertragen Sie Serum Überstände auf 1,5 mL Röhrchen und legen Sie sie in der Trockeneis-Container.
   6. Übertragen Sie alle Proben auf Trockeneis-80 ° C Gefrierschrank bis Weiterverarbeitung gesammelt.
      Hinweis: Es ist wichtig, die Proben vor der Homogenisierung Schritte als Homogenisierung Effizienzsteigerungen nach Einfrieren als Einfrieren Auftauen.
2. Homogenisierung und Zentrifugation
   1. Tauen Sie die Hemi-Großhirn und Niere Proben nach unten bei-80 ° C eingefroren auf Eis auf und wiegen Sie die Rohre mit den Organen. Subtrahieren Sie von diesen Gewichten den Mittelwert aus mehreren leere Rohre (ca. 20), die Gewebe zu bekommen. Fügen Sie 300 µL und 200 µL der Kälte 1 X PBS an den Rohren mit Niere und Hemi-Großhirn, beziehungsweise.
      Hinweis: für geringere Mengen von Gewebe (wie Hemi-Kleinhirn, unter 100 mg) wiegen die einzelnen Rohre wird empfohlen.
   2. Jede Probe in der ursprünglichen Eppendorf Tube zu homogenisieren, Polytetrafluorethylen (PTFE) zerstoßen eine elektrische Überkopf-Rührer (1, 000 u/min) mit ca. 15 Hübe ausführen befestigt (1 Hub = 1 nach oben und 1 unten). Spülen Sie der Stößel mit PBS zwischen Proben und trocknen Sie, bevor Sie fortfahren, die nächste Probe.
      Hinweis: Die Verwendung von Reinigungsmitteln während der Homogenisierung konnte aufgrund möglicher Interferenzen mit Fluorometry vermieden werden. Intrazelluläre Tracer ist jedoch auch in diesem Protokoll erkannt, da das Gewebe gründlich homogenisiert ist, das ist effizienter, nachdem eine Runde Einfrieren Auftauen.
   3. Speichern Sie die homogenisierten Proben auf Eis geschützt vor Licht und Zentrifuge alle zusammen am Ende 15.000 g, 20 min, 4 ° C in einer Tischplatte Zentrifuge. Übertragen Sie Überstände auf eine neue 1,5 mL-Tuben auf Eis für sofortige Fluorometry oder bei-80 ° C, später analysiert werden.
3. Fluoreszenzmessung und Quantifizierung
   1. Wenn am Ende des vorherigen Schrittes eingefroren, auf Eis Auftauen der Überstand und Serum Gewebeproben bei-80 ° c schützt sie vor Licht mit der Folie gelagert.
   2. Pipette 50 µL verdünnter Serum (30 µL 1 X PBS + 20 µL Serum) oder Gewebe Überstände (wie) in eine schwarze 384-Well-Platte. Gehören Sie mindestens eine Probe von Sham Tier für Serum und Gewebe Überstände um sicherzustellen korrekte Hintergrundabzug dieses Gewebe Homogenat Hintergrund normalerweise höher als die von PBS als das Verdünnungsmittel verwendet wird.
      Hinweis: Durchschnittlich 3 Schein Tiere Autofluoreszenz einsetzbar obwohl eine sehr wenig Variabilität in Sham Autofluoreszenz Werte (Daten nicht gezeigt) beobachtet wurde. Die Menge des Serums verwendet kann reduziert werden, durch das verdünnen es mit PBS, wodurch auch der Signal-Rausch-Verhältnis für Proben mit geringer Fluoreszenz wie die Gehirn-Muster erhöht werden kann. Bis zu 10 µL Serum wurde getestet mit 40 µL PBS verdünnen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in die Brunnen vorhanden sind.
   3. Stecken Sie die schwarze 384-Well Platte in der Platte Leser und öffnen Sie ein neues Skript Fluoreszenzmessung auswählen.
   4. Stellen Sie Gain auf optimale und Erregung / (nm) Emissionswerte von 550/580 oder 490/520 für TMR oder FITC Dyee bzw. und starten Sie die Messung um die rohen Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) zu erhalten.
   5. Verwenden Sie roh Fluoreszenz-Einheiten (Verwendungsempfehlungen) aus dem Teller-Leser, um den Durchlässigkeit-Index (PI) nach Abzug der entsprechenden Schein-Werte zu berechnen.
      1. * Durchlässigkeit Index (mL/g) = (Gewebe Verwendungsempfehlungen/g Gewebe Gewicht) / (Serum Verwendungsempfehlungen/mL Serum)
   6. Beispielrechnung für Gehirn-Durchlässigkeit-Index (PI) des Tieres GOF1 (Tabelle 1):
      1. GOF1 des Gehirns Verwendungsempfehlungen - SHAM Gehirn Verwendungsempfehlungen = 154-22,5 = 131,5
      2. GOF1 Serum Verwendungsempfehlungen - SHAM Serum Verwendungsempfehlungen = 38305-27 = 38278
      3. Gehirn-Gewicht (g) = 0.195
      4. Serum-Volumen (ml) = 0,02
      5. Gehirn-Durchlässigkeit Index (10^-3 mL/g) = (131.5/0.195)/(38278/0.02) = 0.352
         Hinweis: Die Durchlässigkeit Index Berechnungen liefern Werte, die absolute und zwischen Experimenten und Gewebetypen vergleichbar sind. Diese können jedoch als Kennzahlen für einfachen Vergleich zwischen 2 Gruppen ¹²präsentiert. Dies kann erreicht werden, indem man die PI jedes Tieres in beiden Gruppen mit der mittleren PI der Kontrollgruppe, fahren die Mittel der Kontrolle-Gruppe durch 1 noch halten die Inter-Tier-Variation in der Kontrollgruppe. Diese Transformation stellt Werte für die experimentelle Gruppe (oder Gruppen) im Vergleich zu der Kontrollgruppe auf 1 gesetzt.
4. Immunfluoreszenz-Visualisierung von tracer
   1. Schneiden Sie die Niere/Hemi-Gehirn-Blöcke 10 µm Abschnitte auf einem Kryostat auf-20 ° C eingestellt und übertragen Sie die Abschnitte auf Folien platziert bei Raumtemperatur nativ in Tissue-Tek Verbindung (O.C.T) (Schritt 2.1) integriert. Sobald die Abschnitte (ca. 30 min) getrocknet werden, übertragen Sie Folien auf-80 ° C Gefrierschrank bis zur Verwendung.
   2. Am Tag der Färbung tauen Sie die Folien bei 37 ° C für 10 min auf, und befestigen Sie die Abschnitte mit 4 % Paraformaladehyde (PFA) für 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von schnellen waschen mit PBS-Puffer.
   3. Inkubieren Sie in den Abschnitten Permeabilisierung/blockieren Puffer gemacht von sterilen PBS mit 1 % BSA und 0,5 % Triton x-100 pH 7,5 für 1 h bei Raumtemperatur.
   4. Folien für 1,5 h bei Raumtemperatur mit CD31 Primärantikörper inkubieren (0,5 mg/ml, Klonen MEC 13,3), in 1: 100 im Puffer mit sterilen PBS, 0,5 % BSA, 0,25 % Triton x-100 (pH 7,2) gefolgt von drei 5 min waschen in PBS verdünnt.
   5. Führen Sie Sekundärantikörper Inkubation in der oben genannten Puffer für 1 h bei Raumtemperatur mit artspezifischen Eindringmittel beschriftet Antikörper verdünnt 1: 500 (2 mg/mL). Für CD31 Ziege Anti-Ratte Alexa 568 oder Alexa 488 bei einer Verdünnung von 1: 500 einsetzbar. DAPI gehören (300 µM) in der Sekundärantikörper mischen (1:1, 000 Verdünnung aus dem Bestand) um für die Kerne färben.
   6. Montieren Sie die gefärbten Abschnitte mit Aqua Polymount und lasse es über Nacht für die Polymerisation bei Raumtemperatur in Dunkelheit.
   7. Erwerben Sie Bilder mit eine spektrale Bildgebung konfokale Laser-scanning Mikroskopsystem. Analysieren von Bildern durch NIS-Elemente-Software (Version 4.3). Software wie Photoshop kann zur Erzeugung von Montage Zahlen verwendet werden.

Ergebnisse

Wir haben kürzlich gezeigt, dass Angiopoietin-2 (Ang-2) Gain of Function (GOF) Mäuse höhere Gehirn vaskulären Permeabilität als Kontroll-Mäusen unter gesunden Bedingungen^{10 haben}. Bei Schlaganfall-induzierte Mäusen war es auch zeigt, dass die GOF-Mäuse Infarkt größer und größere Durchlässigkeit als Kontrolle Wurfgeschwistern hatten. Diese Ergebnisse zeigen eine kritische Rolle von Ang-2 in Durchlässigkeit an der BBB. Das Protokoll daher verwendet die ...

Diskussion

Funktionsstörung der Blut - Hirn-Schranke ist verbunden mit einer Reihe von neurologischen Erkrankungen, einschließlich primäre und sekundäre Hirntumoren oder Schlaganfall. BBB Aufschlüsselung ist häufig verbunden mit lebensbedrohlichen CNS Ödem. Daher ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Öffnung auslösen oder Schließung der BBB therapeutische Bedeutung bei neurologischen Erkrankungen und häufig von Forschern untersucht. BBB Permeabilität in Vivo in der Literatur beschrieben sind ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tetramethyl Rhodamine (TMR) dextran 3kD	Thermosfisher	D3308
Fluorescein isothiocyanate (FITC) dextran 3kD	Thermosfisher	D3306
Ketamine (Ketavet)	Zoetis
Xylazine (Rompun)	Bayer
0.9% Saline	Fresenius Kabi Deutschland GmbH
1X PBS	Gibco	10010-015
Tissue-tek O.C.T compound	Sakura Finetek	4583
37% Formaldhehyde solution	Sigma	252549-1L	prepare a 4% solution
Bovine Serum Albumin, fraction V	Roth	8076.3
Triton X-100	Sigma	T8787
rat anti CD31 antibody, clone MEC 13.3	BD Pharmingen	553370
goat anti rat alexa 568	Molecular Probes	A-11077
goat anti rat alexa 488	Molecular Probes	A-11006
DAPI	Molecular Probes	D1306
Aqua polymount	Polyscience Inc	18606
21-gauge butterfly needle	BD	387455
serum collection tube	Sarstedt	41.1500.005
2mL eppendorf tubes	Sarstedt	72.695.500
Kimtech precision wipes tissue wipers	Kimberley-Clark Professional	05511
384-well black plate	Greiner	781086
slides superfrost plus	Thermoscientific	J1800AMNZ
PTFE pestle	Wheaton	358029
electric overhead stirrer	VWR	VWR VOS 14
plate reader	Tecan	Infinite M200
Cryostat	Microm GmbH	HM 550
Nikon C1 Spectral Imaging confocal Laser Scanning Microscope System	Nikon
peristaltic perfusion system	BVK Ismatec
microcentrifuge	eppendorf	5415R